Nxjerrja e proteinave të asistuara nga sonifikimi nga indi tumoral – protokoll
Ky protokoll përshkruan një metodë nxjerrjeje të proteinave të asistuara nga sonifikimi për indet tumorale që përparon rrjedhën standarde të punës së lizës së uresë CPTAC duke shtuar një hap të kontrolluar të sonifikimit me sondë gjatë përçarjes së indeve. Duke u bazuar në strategjinë e vendosur të përgatitjes së proteomës dhe fosfoproteomës CPTAC në shkallë të thellë, ky modifikim përmirëson përçarjen e strukturës qelizore dhe nënqelizore, zvogëlon viskozitetin e mostrës dhe rrit çlirimin e proteinave që zakonisht janë më të vështira për t'u rikuperuar vetëm me lizën e uresë, veçanërisht proteinat e lidhura me membranën dhe ato që lidhen me ADN-në ose të shoqëruara me bërthamën. Në studimin themelor, rrjedha e punës e asistuar nga sonifikimi rriti zbulimin e proteinave dhe fosfopeptideve duke ruajtur përputhshmërinë me tretjen në stilin CPTAC, etiketimin TMT, fraksionimin, pasurimin e fosfopeptideve dhe tubacionin e analizës LC-MS/MS.
Nxjerrja e proteinave të asistuara nga sonifikimi nga indi tumoral për analizë të thellë proteomike dhe fosfoproteomike
The following protocol is optimized for extraction of proteins from cryopulverized tumor tissue in 8 M urea lysis buffer: An added probe-type sonication step improves the recovery of difficult protein classes, especially membrane-associated and DNA-/nucleus-associated proteins, before digestion and downstream LC-MS/MS analysis. In the underlying study by Li et al. (2025), adding sonication increased detection of membrane and nucleus-associated proteins and supported deep-scale coverage of >12,000 proteins and >25,000 phosphopeptides under their workflow.
sonda tejzanor UP200St për nxjerrjen e proteinave në proteomikë
Fusha e Zbatimit për Protokollin
Përdoreni këtë procedurë për:
- ind tumoral i ngrirë i freskët, i kriopulverizuar
- kokrriza qelizore ose mostra të tjera biologjike ku nxjerrja me bazë ureje është vendosur tashmë
- rrjedhat e punës globale të proteomikës dhe fosfoproteomikës duke përdorur tretje triptike dhe etiketim opsional TMT
Studimi nga Li et al. (2025) pohon se rrjedha e punës është e zbatueshme edhe për lloje të tjera të mostrave, siç janë linjat qelizore, gjaku dhe urina, megjithatë optimizimi mund të kërkohet sipas llojit të mostrës.
Fluksi i punës i optimizuar i përgatitjes së mostrës me hapin e implementuar të sonifikimit. Fluksi i punës i optimizuar dhe dizajni eksperimental bazohen në protokollin e përgatitjes së mostrës CPTAC për analizën globale proteomike dhe fosfoproteomike.
Studimi dhe skema: ©Li et al., 2025
Parimi i Punës
Studimi origjinal shtoi sonikimi në rrjedhën standarde të punës së lizës së uresë CPTAC dhe gjeti zbulim të përmirësuar të proteinave të shoqëruara me membranat dhe bërthamat. Autorët deklarojnë se parametrat e sonikimi duhet të rregullohen në mënyrë të imët në lidhje me madhësinë/përqendrimin e mostrës. – duke zgjedhur madhësinë e sonotrodës, hyrjen e energjisë dhe kohën e pulsit.
Shembullor, për Hielscher UP200Ht dhe UP200St, kjo do të thotë:
- përdorni amplitudën dhe modalitetin e pulsit si variablat kryesore të kontrollit
- mbajini mostrat të ftohta gjatë gjithë kohës (p.sh., në akull)
- filloni me mjedise konservatore
- optimizoni kundrejt qartësisë së mostrës, temperaturës, rendimentit të proteinave dhe cilësisë së peptideve në rrjedhën e poshtme
Të dy modelet sonicator Hielscher 200 vat UP200Ht dhe UP200St janë të dizajnuara për vëllime të vogla dhe të mesme të mostrave, me amplitudë të rregullueshme dhe cilësime të pulsit; të dy homogjenizuesit tejzanor ofrojnë kontroll dixhital të ekranit me prekje për rregullim të saktë të parametrave, regjistrim automatik të të dhënave, sensor të temperaturës së kyçur, telekomandë, ndriçim të mostrës.
Reagentë për Nxjerrjen e Proteinave të Ndihmuara me Sonikim
Tamponi i lizës së uresë
Përgatiteni të freskët menjëherë para përdorimit:
- 8 M ure
- 75 mM NaCl
- 50 mM Tris, pH 8.0
- 1 mM EDTA
- 2 µg/mL aprotininë
- 10 µg/mL leupeptinë
- 1 mM PMSF
- 10 mM NaF
- 20 µM PUGNAc
- Kokteji i Frenuesve të Fosfatazës 2, 1:100 (v/v)
- Kokteji i Frenuesve të Fosfatazës 3, 1:100 (v/v)
Ureja duhet të tretet plotësisht para shtimit të aditivëve; frenuesit duhet të shtohen menjëherë para përdorimit; tamponi duhet të mbahet në akull; dhe pas shtimit të aditivëve rekomandohet të bëhet rrotullim në vend të një përzierjeje të fuqishme.
Reagentë shtesë:
- Reagentë për analizën e proteinave BCA
- 50 mM Tris-HCl, pH 8.0
- DTT
- Jodoacetamid
- LysC
- tripsinën
- Acid formik
- Reagentë TMT, nëse përdoren proteomikë sasiore të shumëfishta
- Reagentë IMAC, nëse kryhet pasurim me fosfopeptide
Ultrasonikator UP200Ht me mikromajë S26d2 për përgatitjen e mostrës
Pajisje për Nxjerrjen e Proteinave të Ndihmuara me Sonikim
E detyrueshme
Zgjedhja e rekomanduar e sondës
Për mostrat rreth 200-1000 µL, përdorni një sonotrode me diametër të vogël të përshtatshëm për përpunimin direkt me intensitet të lartë të vëllimeve të vogla. Hielscher ofron diametra të shumtë sonotrode, dhe diametrat më të vegjël të majës ofrojnë intensitet më të lartë në majë.
Shënim praktik: Përdorni sondën më të vogël që ofron përzierje efikase pa shkumë të tepërt ose kontakt me murin e enës.
Nëse punoni me disa mostra në të njëjtën kohë, mund të merrni në konsideratë Shishja e sonifikuesit me shumë tuba ose Sonicatori i Mikropllakave UIP400MTP!
Udhëzime hap pas hapi: Procedura e nxjerrjes së proteinave të asistuara nga sonifikimi
A. Paraftohje dhe Përgatitje
- Ftohni centrifugën në 4°C.
- Përgatitni tampon të freskët të lizës së uresë dhe mbajeni në akull.
- Vendosni UP200Ht ose UP200St në një stendë brenda një kutie akustike.
- Përgatitni një banjë akulli mjaftueshëm të madhe për të mbajtur tubat e mostrës drejt dhe të qëndrueshëm.
Përgatitja e tamponit të freskët dhe trajtimi i të ftohtit janë kritike.
B. Ekstraktimi fillestar i uresë
- Mbajeni indin e kriopulverizuar në akull.
- Shtoni 200 µL tampon lize të uresë së ftohur për çdo 50 mg ind të lagësht.
- Vorteks 5–10 s me shpejtësi të lartë.
- Inkubojeni për 15 minuta në 4°C.
- Përsëriteni hapin e inkubacionit vortex-plus edhe një herë.
- Centrifugohet në 20,000 g për 10 minuta në 4°C.
- Transferoni lizatin/supernatantin në një tub të pastër me lidhje të ulët.
C. Sonikimi me përdorimin e UP200Ht ose UP200St
Kushtet fillestare për sonifikimin
- Amplituda: filloni nga 20–30%
- Gjatësia e pulsit: 5 s ON
- Ftohja: 2 minuta në akull midis pulsimeve
- Numri i cikleve: 4 cikle
- Koha totale e sonifikimit aktiv: 20 s
- Koha totale e procesit duke përfshirë ftohjen: rreth 8-10 minuta
Hapat e sonifikimit
- Transferoni lizatin në një tub të përshtatshëm për sonifikim. Përdorni një tub të ngushtë me mure të holla që lejon shkëmbim të mirë të nxehtësisë dhe zhytje të sigurt të sondës.
- Vendoseni tubin në një banjë akulli. Dokumenti e identifikon ftohjen gjatë sonifikimit si kritike për të parandaluar dëmtimin nga nxehtësia.
- Zhytni majën e sondës në mostër. Mbajeni majën të zhytur mjaftueshëm për kavitacion të qëndrueshëm, por mos e lini të prekë murin ose fundin e tubit.
- Ekzekutoni një puls 5 s në amplitudën fillestare.
- Kthejeni menjëherë mostrën plotësisht në akull për 2 minuta.
- Përsëriteni derisa të përfundojnë 4 cikle.
- Inspektoni lizatin pas ciklit.
- Vazhdoni vetëm nëse është e nevojshme, duke përdorur një puls shtesë prej 5 sekondash në të njëjtën kohë, gjithmonë të ndjekur nga ftohja e plotë.
- Ndërpriteni sapo lizati të bëhet më uniform dhe më pak fijor/viskoz.
Pika fundore është një lizat më i tejdukshëm që formon pika në vend të një rrjedhe të vazhdueshme viskoze. - Centrifugohet në rreth 16,000 g për 15 minuta në 4°C.
- Transferoni supernatantin e sqaruar në një tub të freskët dhe matni përqendrimin e proteinave.
Krahasimi i proteomikës globale dhe fosfoproteomikës midis mostrave të sonifikuara dhe jo të sonifikuara.
a. Numri i proteinave të identifikuara (proteomika globale) në të gjitha indet tumorale PDX me ose pa sonifikim. b. Numri i fosfopeptideve të identifikuara (pasurimi IMAC) në të gjitha indet tumorale PDX me ose pa sonifikim. U numëruan vetëm proteinat dhe fosfopeptidet me raport bollëku më të madh ose të barabartë me percentilin e 25-të. Raporti i bollëkut u llogarit midis të njëjtave llojeve të mostrave.
Studimi dhe grafikët: ©Li et al., 2025
Tretje dhe Analizë në Rrjedhën e Poshtëme
Pas sonifikimit dhe sqarimit, vazhdoni siç përshkruhet në rrjedhën origjinale të punës në stilin CPTAC:
- Holloni lizatin 1:3 (v/v) me 50 mM Tris-HCl pH 8.0 për të reduktuar urenë në <2 M.
- Shtoni LysC në sasinë 1 mAU për 50 µg proteinë dhe inkubojeni për 2 orë në 25°C.
- Shtoni tripsinën në raportin 1:49 enzimë:substrat (p/p) dhe treteni gjatë natës në 25°C.
- Shuajeni me acid formik deri në 1% përfundimtar.
- Vazhdoni me çkripëzimin, etiketimin TMT, fraksionimin, pasurimin me fosfopeptide dhe LC-MS/MS sipas nevojës.
Shprehja diferenciale e fosfopeptideve nga MS e shënuar me TMT.
a. Nëntipi bazal, duke nxjerrë në pah disa fosfopeptide njerëzore (fillimi dhe mbarimi i sekuencës së proteinave) të rritura në mostrat e sonifikuara krahasuar me mostrat jo të sonifikuara. b. Nëntipi luminal, duke nxjerrë në pah disa fosfopeptide njerëzore (fillimi dhe mbarimi i sekuencës_së_proteinës) të rritura në mostrat e sonifikuara krahasuar me mostrat jo të sonifikuara. c. Shtigje KEGG të pasuruara bazuar në proteinat e fosfopeptideve të rritura në nëntipin bazal të sonifikuar të tumoreve. d. Shtigje KEGG të pasuruara bazuar në proteinat e fosfopeptideve të rritura në nëntipin luminal të sonifikuar të tumoreve.
Studimi dhe grafikët: ©Li et al., 2025
Dizajn, Prodhim dhe Konsulencë – Cilësi e prodhuar në Gjermani
Ultrasonikët Hielscher janë të njohur për cilësinë e tyre më të lartë dhe standardet e dizajnit. Qëndrueshmëria dhe funksionimi i lehtë lejojnë integrimin e qetë të ultrasonikëve tanë në objektet industriale. Kushtet e vështira dhe mjediset kërkuese trajtohen lehtësisht nga ultrasonikët Hielscher.
Hielscher Ultrasonics është një kompani e certifikuar ISO dhe i kushton theks të veçantë ultratingujve me performancë të lartë që paraqesin teknologjinë më të fundit dhe lehtësinë ndaj përdorimit. Sigurisht, ultrasonikët Hielscher janë në përputhje me CE dhe plotësojnë kërkesat e UL, CSA dhe RoHs.
Sonicator me shumë pllakë UIP400MTP për nxjerrjen e proteinave me rendiment të lartë nga mostrat
Literatura / Referencat
- Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
- Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
- Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
- Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
- Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.
pyetjet e bëra shpesh
Cili është ndryshimi midis nxjerrjes së proteinave nga indet bimore kundrejt indeve të gjitarëve?
Nxjerrja e proteinave nga indet bimore është zakonisht më e vështirë sesa nga indet e gjitarëve, sepse qelizat bimore kanë një mur qelizor të ngurtë të pasur me celulozë, polisakaride të bollshme, komponime fenolike, pigmente dhe enzima endogjene aktive që mund të ndërhyjnë në tretjen e proteinave, të kontaminojnë ekstraktet ose të nxisin degradimin e proteinave. Në të kundërt, indet e gjitarëve nuk kanë një mur qelizor dhe në përgjithësi janë më të lehta për t'u shkatërruar kimikisht, megjithëse shpesh përmbajnë më shumë lipide, matricë jashtëqelizore dhe proteaza që ende mund ta ndërlikojnë nxjerrjen. Si rezultat, protokollet e bimëve zakonisht kërkojnë shkatërrim më të fortë mekanik, bluarje në temperaturë të ulët dhe aditivë të tillë si PVPP, agjentë reduktues ose pastrim me bazë fenoli, ndërsa indi i gjitarëve trajtohet më shpesh me sukses me tampona me bazë detergjenti, siç janë sistemet e lizës RIPA ose ure. Si indet bimore ashtu edhe të gjitarëve mund të lizohen në mënyrë efikase me anë të sonifikimit!
Si të përmirësohet nxjerrja e proteinave nga indet duke përdorur RIPA Buffer?
Nxjerrja e proteinave nga indi me tampon RIPA mund të përmirësohet duke optimizuar si përçarjen ashtu edhe mbrojtjen e mostrës. Masat më të rëndësishme janë mbajtja e indit dhe tamponit të ftohtë, përdorimi i frenuesve të proteazës dhe fosfatazës të përgatitur fllad, grirja ose pluhurizimi i indit plotësisht para lizës, ruajtja e një raporti të përshtatshëm tampon-ind dhe shtimi i një hapi mekanik të përçarjes siç është homogjenizimi ose sonikimi i shkurtër me sondë për të copëtuar indin e dendur dhe për të zvogëluar viskozitetin. Efikasiteti i nxjerrjes përmirësohet gjithashtu kur lizatet inkubohen në akull me përzierje të ndërprerë, e ndjekur nga centrifugimi i frigoriferit me shpejtësi të lartë për të hequr mbeturinat e patretshme. Për indet fibroze, të pasura me lipide ose shumë të strukturuara, përsëritja e nxjerrjes një herë ose rritja e kohës së ekspozimit ndaj detergjentit mund të përmirësojë rikuperimin, por sonikimi i tepërt ose trajtimi i zgjatur në temperaturë ambienti duhet të shmanget sepse ato mund të denatyrojnë proteinat ose të rrisin proteolizën.
Cilat kërkesa sigurie duhet të mbahen gjatë nxjerrjes tejzanor të proteinave?
Kryeni sonifikimin me sondë në një kuti mbrojtëse nga zhurma ose me mbrojtje të përshtatshme për dëgjimin. Protokolli i burimit paralajmëron posaçërisht për zhurmën e dëmshme të dëgjueshme të gjeneruar gjatë sonifikimit.
Vishni mbrojtëse për sytë, xhaketë laboratori dhe doreza.
Mbajeni sondën larg lëkurës dhe mos e trajtoni kurrë me ultratinguj një enë të hapur pa mbrojtje nga spërkatjet.
Trajtoni PMSF-në dhe frenuesit e tjerë sipas rregullave lokale të sigurisë kimike.
Mbani mostrat në akull për të zvogëluar dëmtimin e proteinave të shkaktuar nga nxehtësia; dokumenti e identifikon vazhdimisht kontrollin e temperaturës si kritik.
Sonikatori VialTweeter përshpejton dhe përmirëson nxjerrjen e proteinave në proteomikë
Hielscher Ultrasonics prodhon homogjenizues tejzanor me performancë të lartë nga laboratori te madhësia industriale.