Ekstraktimi i proteinave nga indi tumoral i asistuar nga sonikimi – Protokoll

Ky protokoll përshkruan një metodë të ekstraktimit të proteinave nga indi tumoral të asistuar nga sonikimi, e cila përmirëson rrjedhën standarde të punës CPTAC për lizën me ure duke shtuar një hap të kontrolluar sonikimi me sondë gjatë shpërbërjes së indit. Duke u mbështetur në strategjinë e konsoliduar CPTAC për përgatitjen e proteomës dhe fosfoproteomës për analiza të thelluara, ky modifikim përmirëson shpërbërjen e qelizave dhe të strukturave nënqelizore, ul viskozitetin e mostrës dhe rrit çlirimin e proteinave që zakonisht janë më të vështira për t’u rikuperuar vetëm me lizën me ure, veçanërisht proteinave të lidhura me membranën dhe atyre që lidhen me ADN-në ose që shoqërohen me bërthamën. Në studimin ku mbështetet ky protokoll, rrjedha e punës e asistuar nga sonikimi rriti zbulimin si të proteinave, ashtu edhe të fosfopeptideve, duke ruajtur përputhshmërinë me hapat pasues të përpunimit sipas modelit CPTAC: tretjen enzimatike, etiketimin TMT, fraksionimin, pasurimin e fosfopeptideve dhe analizën LC-MS/MS.

Ekstraktimi i proteinave nga indi tumoral i asistuar nga sonikimi për analizë të thelluar proteomike dhe fosfoproteomike

Protokolli i mëposhtëm është optimizuar për ekstraktimin e proteinave nga indi tumoral i pluhurizuar në kushte kriogjenike, në tampon lize me ure 8 M: Një hap i shtuar sonikimi me sondë përmirëson rikuperimin e klasave të proteinave që ekstraktohen me vështirësi, veçanërisht proteinave të shoqëruara me membranën dhe atyre të shoqëruara me ADN-në/bërthamën, përpara tretjes enzimatike dhe analizës pasuese LC-MS/MS. Në studimin përkatës nga Li et al. (2025), shtimi i sonikimit rriti zbulimin e proteinave të shoqëruara me membranën dhe bërthamën dhe mundësoi mbulim të thelluar të >12 000 proteinave dhe >25 000 fosfopeptideve në kuadër të rrjedhës së tyre të punës.

Fusha e zbatimit të protokollit

Përdoreni këtë procedurë për:

• ind tumoral të ngrirë në gjendje të freskët dhe të pluhurizuar në kushte kriogjenike
• sedimente qelizore ose mostra të tjera biologjike për të cilat ekstraktimi me bazë ureje është tashmë i konsoliduar
• rrjedha pune të proteomikës dhe fosfoproteomikës globale që përdorin tretjen enzimatike me tripsinë dhe etiketimin opsional TMT

Studimi nga Li et al. (2025) pohon se rrjedha e punës është gjithashtu e zbatueshme për lloje të tjera mostrash, si linjat qelizore, gjaku dhe urina, megjithatë mund të kërkohet optimizim sipas llojit të mostrës.

Rrjedhë e optimizuar e punës për përgatitjen e mostrave me një hap sonikimi të përfshirë. Rrjedha e optimizuar e punës dhe plani eksperimental bazohen në protokollin CPTAC të përgatitjes së mostrave për analizë globale proteomike dhe fosfoproteomike.
Studimi dhe skema: ©Li et al., 2025

Parimi i punës

Studimi origjinal shtoi sonikimin në rrjedhën standarde të punës CPTAC për lizën me ure dhe konstatoi përmirësim të zbulimit të proteinave të shoqëruara me membranat dhe bërthamat. Autorët pohojnë se parametrat e sonikimit duhet të rregullohen me imtësi sipas madhësisë/përqendrimit të mostrës – duke zgjedhur madhësinë e sonotrodës, energjinë e dhënë dhe kohëzimin e impulseve.

Për shembull, për Hielscher UP200Ht dhe UP200St, kjo do të thotë:

• përdorni amplitudën dhe modalitetin impulsiv si variablat kryesore të kontrollit
• mbajini mostrat të ftohta gjatë gjithë kohës (d.m.th. mbi akull)
• filloni me cilësime të kujdesshme
• optimizoni duke marrë parasysh kthjelltësinë e mostrës, temperaturën, rendimentin e proteinave dhe cilësinë e peptideve në hapat pasues

 
Të dy modelet e sonikatorëve Hielscher prej 200 vatësh, UP200Ht dhe UP200St, janë projektuar për vëllime të vogla dhe mesatare mostrash, me cilësime të rregullueshme të amplitudës dhe impulseve; të dy homogjenizuesit ultrasonikë ofrojnë kontroll digjital me ekran me prekje për rregullimin e saktë të parametrave, regjistrim automatik të të dhënave, sensor temperature të lidhshëm, komandim në distancë dhe ndriçim të mostrës.
 

Reagentët për ekstraktimin e proteinave të asistuar nga sonikimi

Tampon lize me ure

Përgatiteni të freskët menjëherë para përdorimit:

• ure 8 M
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• aprotininë 2 µg/mL
• leupeptinë 10 µg/mL
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 2, 1:100 (v/v)
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 3, 1:100 (v/v)

Ureja duhet të jetë tretur plotësisht para shtimit të aditivëve; inhibitorët duhet të shtohen menjëherë para përdorimit; tamponi duhet të mbahet mbi akull; dhe pas shtimit të aditivëve rekomandohet përzierja me lëvizje rrethore në vend të përzierjes së fuqishme me vorteks.
 

Reagentë shtesë:

• Reagentë për përcaktimin e proteinave me metodën BCA
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• Jodoacetamid
• LysC
• Tripsinë
• Acid formik
• Reagentë TMT, nëse përdorni proteomikë sasiore të multipleksuar
• Reagentë IMAC, nëse kryeni pasurimin e fosfopeptideve

Pajisje për ekstraktimin e proteinave të asistuar nga sonikimi

Të nevojshme

Përzgjedhja e rekomanduar e sondës

Për mostra rreth 200–1000 µL, përdorni një sonotrodë me diametër të vogël, të përshtatshme për përpunimin e drejtpërdrejtë me intensitet të lartë të vëllimeve të vogla. Hielscher ofron sonotroda me diametra të ndryshëm dhe diametrat më të vegjël të majës sigurojnë intensitet më të lartë në majë.

Shënim praktik: Përdorni sondën më të vogël që siguron përzierje efikase pa shkumëzim të tepërt ose kontakt me murin e enës.

Nëse punoni me disa mostra njëkohësisht, mund të merrni në konsideratë sonikatorin për shumë tuba VialTweeter ose sonikatorin për mikropllaka UIP400MTP!

Udhëzime hap pas hapi: Procedura e ekstraktimit të proteinave të asistuar nga sonikimi

A. Ftohni paraprakisht dhe përgatitni

1. Ftoheni centrifugën në 4°C.
2. Përgatitni solucion të freskët tampon për lizë me ure dhe mbajeni mbi akull.
3. Montojeni UP200Ht ose UP200St në një stativ brenda një kabine izoluese akustike.
4. Përgatitni një banjë akulli mjaftueshëm të madhe për t’i mbajtur tubat e mostrave drejt dhe në mënyrë të qëndrueshme.

Përgatitja e freskët e solucionit tampon dhe trajtimi në të ftohtë janë thelbësore.

B. Ekstraktimi fillestar me ure

1. Mbajeni indin e pluhurosur në kushte kriogjenike mbi akull.
2. Shtoni 200 µL solucion tampon të ftohur për lizë me ure për çdo 50 mg ind të lagësht.
3. Përziejeni në vorteks për 5–10 s me shpejtësi të lartë.
4. Inkubojeni për 15 min në 4°C.
5. Përsëriteni edhe një herë hapin e përzierjes në vorteks të ndjekur nga inkubimi.
6. Centrifugojeni në 20 000g për 10 min në 4°C.
7. Transferojeni lizatin/supernatantin në një tub të pastër me lidhje të ulët të proteinave në sipërfaqe.

C. Sonikimi duke përdorur UP200Ht ose UP200St

Kushtet fillestare për sonikimin

• Amplituda: filloni me 20–30%
• Kohëzgjatja e impulsit: 5 s AKTIV
• Ftohja: 2 min mbi akull ndërmjet impulseve
• Numri i cikleve: 4 cikle
• Koha totale e sonikimit aktiv: 20 s
• Koha totale e procesit, përfshirë ftohjen: rreth 8–10 min

Hapat e sonikimit

1. Transferojeni lizatin në një tub të përshtatshëm për sonikim. Përdorni një tub të ngushtë, me mure të holla, që mundëson shkëmbim të mirë të nxehtësisë dhe zhytje të sigurt të sondës.
2. Vendoseni tubin në një banjë akulli. Artikulli e identifikon ftohjen gjatë sonikimit si thelbësore për të parandaluar dëmtimin nga nxehtësia.
3. Zhytni majën e sondës në mostër. Mbajeni majën të zhytur mjaftueshëm për kavitacion të qëndrueshëm, por mos e lejoni të prekë murin ose fundin e tubit.
4. Aplikoni një impuls prej 5 s me amplitudën fillestare.
5. Rikthejeni menjëherë mostrën plotësisht në akull për 2 min.
6. Përsëriteni derisa të përfundohen 4 cikle.
7. Kontrollojeni lizatin pas ciklit.
8. Vazhdoni vetëm nëse është e nevojshme, duke aplikuar nga një impuls shtesë prej 5 s çdo herë, gjithmonë të ndjekur nga ftohje e plotë.
9. Ndaloni sapo lizati të bëhet më homogjen dhe më pak fijëzues/viskoz.
   Pika përfundimtare është një lizat më i tejdukshëm që formon pika në vend të një rrjedhjeje viskoze të vazhdueshme.
10. Centrifugojeni në rreth 16 000g për 15 min në 4°C.
11. Transferojeni supernatantin e kthjelluar në një tub të ri dhe matni përqendrimin e proteinave.

Krahasimi i proteomikës globale dhe fosfoproteomikës ndërmjet mostrave të sonikuara dhe atyre të pasonikuara.
a. Numri i proteinave të identifikuara (proteomika globale) në të gjitha indet tumorale PDX me ose pa sonikim. b. Numri i fosfopeptideve të identifikuara (pasurimi IMAC) në të gjitha indet tumorale PDX me ose pa sonikim. U numëruan vetëm proteinat dhe fosfopeptidet me raport bollëku më të madh ose të barabartë me percentilin e 25-të. Raporti i bollëkut u llogarit ndërmjet mostrave të të njëjtave lloje.
Studimi dhe grafikët: ©Li et al., 2025

Tretja proteolitike dhe analiza pasuese

Pas sonikimit dhe kthjellimit, vazhdoni siç përshkruhet në rrjedhën origjinale të punës sipas modelit CPTAC:

1. Hollojeni lizatin 1:3 (v/v) me 50 mM Tris-HCl pH 8,0 për ta ulur përqendrimin e uresë në <2 M.
2. Shtoni LysC në sasinë 1 mAU për çdo 50 µg proteina dhe inkubojeni për 2 h në 25°C.
3. Shtoni tripsinë në raportin enzimë:substrat 1:49 (w/w) dhe kryeni tretjen proteolitike gjatë natës në 25°C.
4. Ndërpriteni reaksionin me acid formik deri në një përqendrim përfundimtar prej 1%.
5. Vazhdoni me heqjen e kripërave, etiketimin TMT, fraksionimin, pasurimin e fosfopeptideve dhe LC-MS/MS, sipas nevojës.

Shprehja diferenciale e fosfopeptideve nga MS me etiketim TMT.
a. Nëntipi bazal, duke vënë në dukje disa fosfopeptide njerëzore (fillimi dhe fundi i sekuencës së proteinës) me shprehje të rritur në mostrat e sonikuara krahasuar me mostrat e pasonikuara. b. Nëntipi luminal, duke vënë në dukje disa fosfopeptide njerëzore (fillimi dhe fundi i sekuencës së proteinës) me shprehje të rritur në mostrat e sonikuara krahasuar me mostrat e pasonikuara. c. Rrugët KEGG të pasuruara, bazuar në proteinat e fosfopeptideve me shprehje të rritur në nëntipin bazal të tumoreve të sonikuara. d. Rrugët KEGG të pasuruara, bazuar në proteinat e fosfopeptideve me shprehje të rritur në nëntipin luminal të tumoreve të sonikuara.
Studimi dhe grafikët: ©Li et al., 2025

Projektim, prodhim dhe këshillim – Cilësi e prodhuar në Gjermani

Sonikatorët Hielscher njihen për standardet e tyre më të larta të cilësisë dhe projektimit. Qëndrueshmëria dhe përdorimi i lehtë mundësojnë integrimin pa vështirësi të sonikatorëve tanë në impiantet industriale. Sonikatorët Hielscher përballojnë me lehtësi kushtet e ashpra dhe mjediset kërkuese.

Hielscher Ultrasonics është një kompani e certifikuar sipas ISO dhe i kushton rëndësi të veçantë sonikatorëve me performancë të lartë, të pajisur me teknologjinë më të përparuar dhe të lehtë për t’u përdorur. Natyrisht, sonikatorët Hielscher janë në përputhje me CE dhe plotësojnë kërkesat e UL, CSA dhe RoHs.

Literaturë / Referenca

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.