Liza me ultratinguj për Western blotting

• Western blot është një procedurë analitike për zbulimin e proteinave specifike në një mostër homogjenati indor ose ekstrakti qelizor.
• Për të kryer një Western blot ose për të matur aktivitetin enzimatik, shumë analiza kërkojnë qasje te materialet (p.sh. proteinat, ADN-ja, fragmentet nënqelizore) të mbyllura brenda qelizës.
• Sonikimi është një metodë e besueshme dhe e lehtë për t’u përdorur për shpërbërjen dhe lizën e kontrolluar të qelizave.

Shpërbërja e qelizave me ultratinguj

Ekstraktimi i proteinave nga indet dhe qelizat e kultivuara është hapi i parë për shumë teknika biologjike, biokimike dhe analitike (PAGE, Western blotting, ELISA, spektrometria e masës etj.) ose për pastrimin e proteinave. Për të përftuar një rendiment të lartë proteinash, materiali qelizor dhe indi duhet të shpërbëhen/ lizohen me efikasitet. Qoftë për qeliza bimore apo për inde shtazore, sonikimi është metoda për ta përgatitur lizatin tuaj qelizor lehtë dhe shpejt.

Përparësitë e sonikimit

• i shpejtë dhe efikas
• përdorim i lehtë
• rendiment i lartë proteinash
• i riprodhueshëm/ i përsëritshëm
• i kontrolluar me saktësi
• i shkallëzueshëm

Protokolli i imunoprecipitimit për imunoblotimin Western

A. Reagentët

Për përgatitjen e tretësirave, përdorni ujë të pastruar, si Milli-Q.

• Tretësirë fiziologjike e tamponuar me fosfat (PBS) 1X
• Tampon për lizën qelizore 1X: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM pirofosfat natriumi, 1 mM β-glicerofosfat, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml leupeptinë
  E rëndësishme: Shtoni 1 mM PMSF menjëherë para përdorimit.
• 15 μl proteinë A+15 μl proteinë G mjaftojnë për IP, por kjo mund të varet nga antitrupi juaj primar dhe vëllimi i mostrës. Mund të përdorni edhe agarozë me proteinë A/ G të parapërzier (p.sh. proteinë A për kapjen dhe precipitimin e IgG-së së lepurit dhe proteinë G për kapjen dhe precipitimin e IgG-së së miut)
• Tampon mostre SDS 3X: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 në 25°C), 6% w/v SDS, 30% glicerol, 150 mM DTT, 0,03% w/v blu bromofenoli

B. Përgatitja e lizateve qelizore

• Mblidhni qelizat. Për t’i mbledhur qelizat në kushte jodenatyruese, hiqni mjedisin e kulturës dhe shpëlajini qelizat një herë me PBS të ftohur në akull.
• Hiqni PBS-në dhe shtoni në secilën pjatë (10 cm) 0,5 ml tampon për lizën qelizore 1X të ftohur në akull dhe inkubojini pjatat mbi akull për 5 minuta.
• Shkëputini qelizat nga pjatat duke i kruar dhe transferojini në tuba mikrocentrifugimi. Mbajini mbi akull.
• Sonikoni dy herë nga 10 sekonda në tampon imunoprecipitimi të ftohur në akull (tampon IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 dhe përzierja e inhibitorëve të proteazave). Për sonikim, VialTweeter ose një ultrasonikator me sondë, si UP100H ose UP200Ht janë më të përshtatshmit.
• Centrifugojini lizatet në 15 000 g për 10 minuta në 4°C.
• Transferojeni supernatantin në një tub të ri. (Nëse është e nevojshme, lizati mund të ruhet në –80°C.)
• Shtoni antitrupin primar në supernatant. Supernatanti me antitrupin primar inkubohet për 1 h në 4°C duke e përzier lehtë. Antitrupi primar zakonisht shtohet në një sasi me përqendrim 10x më të lartë se ai që përdoret për Western blotting. (Mund të filloni me 1μg për 100μL.)
• Më pas, supernatanti inkubohet më tej me përzierjen e sasive të barabarta të proteinës A-agarozë (Invitrogen) dhe agarozës me proteinë G për edhe 1 h.
• Lajini sedimentet e agarozës tri herë me tampon IP. Më pas, ekstraktoni proteinat e lidhura me tamponin e ngarkimit SDS-PAGE duke i ngrohur në 95°C për 5 minuta.

C. Imunoprecipitimi

• Merrni 200 μl lizat qelizor dhe shtoni antitrupin primar. Inkubojeni gjatë natës në 4°C duke e lëkundur lehtë.
• Shtoni sferëza agaroze me proteinë A ose G (20 μl suspension sferëzash 50%). Inkubojeni duke e lëkundur lehtë për 1–3 orë në 4°C.
• Mikrocentrifugojeni për 30 sekonda në 4°C. Lajeni sedimentin pesë herë me 500 µl tampon për lizën qelizore 1X. Mbajeni mbi akull gjatë larjeve.
• Risuspendoni sedimentin me 20 μl tampon mostre SDS 3X. Përziejeni me vorteks, pastaj mikrocentrifugojeni për 30 sekonda.
• Ngroheni mostrën në 95–100°C për 2–5 minuta dhe mikrocentrifugojeni për 1 minutë në 14 000 X g.
• Ngarkojeni mostrën (15–30 μl) në xhel SDS-PAGE (12–15%).
• Analizojeni mostrën me Western blotting.

Analiza Western blot me sonikatorin UP50H

Protokolli i mëposhtëm me sonikatorin me sondë UP50H u përdor në studimin e Kriebisch et al. (2011):
Proteinat totale u izoluan nga qelizat MC3T3-E1 të trajtuara me 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) ose me mjetin bartës. Qelizat u lizuan me një tampon që përmbante 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% dodecil sulfat natriumi (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) dhe 0,5% deoksikolat natriumi (Merck). Lizati qelizor u sonikua për 2 × 10 s në ciklin 1 dhe amplitudën 80 me procesorin me ultratinguj UP50H (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Gjermani). Më pas, materiali u centrifugua për 10 min në 14 000 rpm dhe supernatanti u përdor për Western blotting. Njëzet e pesë μg proteinë u zien në tampon mostre dhe agjent reduktues (Invitrogen), pastaj u ndanë me SDS-PAGE duke përdorur xhele poliakrilamidi 4–12% (Invitrogen) dhe u transferuan në një membranë nitroceluloze (GE health care). Membrana u bllokua për 1 h me TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) që përmbante 1% kazeinë (Sigma-Aldrich) dhe 1% Tris (1 M). Pas bllokimit, membrana u inkubua duke u përzier lehtë gjatë natës në 4°C me antitrupin primar (antitrup lepuri kundër CBS-së njerëzore 1/500, i zhvilluar në laboratorin e Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, SHBA). Inkubimi me një antitrup sekondar të konjuguar me peroksidazë rrepe (HPR) (Dako) u krye për 1 h në temperaturë dhome. Të gjitha blotet u zhvilluan me kemilumineshencë të përforcuar (Perkin Elmer).
 

Klikoni këtu për të lexuar më shumë rreth praktikave më të mira për lizën dhe ekstraktimin e qelizave me ultratinguj, përgatitjen e lizateve dhe rekomandimet për përmirësimin e procesit!
 
Tabela më poshtë ju jep një ide mbi kapacitetin e përafërt të përpunimit të ultrasonikatorëve tanë laboratorikë:

Literatura / Referencat

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.