Lizë tejzanor për Western Blotting

• Western blot është një procedurë analitike për zbulimin e proteinave specifike në një mostër të homogjenatit të indeve ose ekstraktit qelizor.
• Për të kryer një Western blot ose për të matur aktivitetin e enzimës, shumë analiza kërkojnë qasje në materialet (p.sh. proteina, ADN, fragmente nënqelizore) të bllokuara në qelizë.
• Sonication është një metodë e besueshme dhe e lehtë për t'u trajtuar për ndërprerjen dhe lizën e kontrolluar të qelizave.

Ndërprerja e qelizave tejzanor

Nxjerrja e proteinave nga indet dhe qelizat e kultivuara është hapi i parë për shumë teknika biologjike, biokimike dhe analitike (PAGE, Western blotting, ELISA, spektrometria e masës, etj.) ose për pastrimin e proteinave. Për të marrë një rendiment të lartë të proteinave, materiali dhe indi qelizor duhet të prishen/lizohen në mënyrë efikase. Qoftë qeliza bimore apo inde shtazore, sonikacioni është metoda për të përgatitur lizatimin e qelizave tuaja lehtë dhe shpejt.

Avantazhet e Sonication

• Shpejt & Efikas
• Funksionim i lehtë
• rendiment të lartë të proteinave
• i riprodhueshëm/përsëritshëm
• të kontrolluara saktësisht
• i shkallëzuar

Protokolli i imunoprecipitimit për imunobllottingun perëndimor

A. Reagentët

Për përgatitjen e tretësirave përdorni ujë të pastruar si Milli-Q.

• 1X solucion fiziologjik me fosfat (PBS)
• 1X Bufer i Lizës së Qelizës: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM Pirofosfat natriumi, 1 mM β-glicerofosfat, 1 mM NaCl/4, 1 mM Na3 ml Leupeptin
  E rëndësishme: Shtoni 1 mM PMSF menjëherë përpara përdorimit.
• 15 μl Proteina A+15 μl Proteina G është e mjaftueshme për IP, por mund të varet nga antitrupi juaj primar dhe vëllimi i mostrës. Ju gjithashtu mund të përdorni proteinë të përzier paraprakisht A/G agarozë (p.sh. Proteina A për uljen e IgG të lepurit dhe Proteinën G për tërheqjen e IgG të miut)
• 3X SDS tampon kampioni: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 në 25°C), 6% w/v SDS, 30% glicerinë, 150 mM DTT, 0,03% w/v bromofenol blu

B. Përgatitja e lizave qelizore

• Mblidhni qelizat. Për të mbledhur qeliza në kushte jodenatyruese, hiqni median dhe shpëlajini qelizat një herë me PBS të ftohtë në akull.
• Hiqni PBS dhe shtoni 0,5 ml tampon lize qelizore 1X të ftohtë në akull në secilën pjatë (10 cm) dhe inkuboni pllakat në akull për 5 minuta.
• Hiqni qelizat nga pllakat dhe transferojeni në tubat e mikrocentrifugës. Mbajeni në akull.
• Sonikoni dy herë për 10 sekonda në tampon imunoprecipitimi të ftohtë në akull (paferi IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40 dhe përzierja e inhibitorit të proteazës). Për sonikacion, VialTweeter ose një ultrasonikator me sondë si p.sh UP100H ose UP200Ht janë më të përshtatshmet.
• Centrifugoni lizat në 15,000 g për 10 minuta në 4°C.
• Transferoni supernatantin në një tub të ri. (Nëse është e nevojshme, lizati mund të ruhet në -80°C.)
• Shtoni antitrupin primar në supernatant. Supernatanti me antitrupin primar inkubohet për 1 orë në 4°C nën trazim të lehtë. Antitrupat primar zakonisht shtohen në një sasi 10 herë më të koncentruar sesa përdoret për western blotting. (Mund të filloni me 1μg për 100μL.)
• Supernatanti inkubohet më tej me përzierjen e sasive të barabarta të Proteinës A-agaroze (Invitrogen) dhe Proteinës G agaroze për 1 orë të tjera.
• Lani peletat e agarozës tri herë me tampon IP. Më pas, nxirrni proteinat e lidhura me tampon ngarkues SDS-PAGE duke i ngrohur në 95°C për 5 minuta.

C. Imunoprecipitimi

• Merrni 200 μl lizatë qelizore dhe shtoni antitrupin primar. Inkuboni me lëkundje të lehtë gjatë natës në 4°C.
• Shtoni ose rruaza agaroze proteine A ose G (20 μl llum rruaza 50%). Inkuboni me lëkundje të lehtë për 1-3 orë në 4°C.
• Mikrocentrifugoni për 30 sekonda në 4°C. Lani peletin pesë herë me 500 µl buffer 1X të lizës së qelizave. Mbajeni në akull gjatë larjes.
• Risuspendoni peletin me 20 μl 3X tampon kampioni SDS. Vortex, më pas mikrocentrifugoni për 30 sekonda.
• Ngroheni kampionin në 95–100°C për 2–5 minuta dhe mikrocentrifugoni për 1 minutë në 14,000 X g.
• Ngarkoni kampionin (15–30 μl) në xhel SDS-PAGE (12–15%).
• Analizoni mostrën me Western blotting.

Analiza Western Blot me Sonicator UP50H

Në studimin e Kriebisch et al. (2011):
Proteina totale u izolua nga qelizat MC3T3-E1 të trajtuara me 1,25 (OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) ose mjeti. Qelizat u lizuan me një tampon që përmban 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0.1% dodecil sulfat natriumi (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) dhe 0,5% deoksikolat natriumi (Merck). Lizati i qelizave u sonikua për 2 × 10 s në ciklin 1 dhe amplituda 80 me Procesor tejzanor UP50H (Hielscher, Teknologjia me ultratinguj, Teltow, Gjermani). Më pas materiali u centrifugua për 10 minuta në 14,000 rpm dhe supernatanti u përdor për Western blotting. Njëzet e pesë μg proteina u zien në tampon kampion dhe agjent reduktues (Invitrogen) dhe më pas u nda me SDS-PAGE duke përdorur xhel poliakrilamid 4-12% (Invitrogen) dhe u transferua në një membranë nitroceluloze (GE kujdes shëndetësor). Membrana u bllokua për 1 orë me TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7.6; 150 mM NaCl) që përmban 1% kazeinë (Sigma-Aldrich) dhe 1% Tris (1 M). Pas bllokimit, membrana u inkubua me trazim të lehtë gjatë natës në 4°C me antitrupin primar (lepuri anti-human CBS 1/500, i zhvilluar në laboratorin e Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA). Inkubimi me një antitrup sekondar të konjuguar me peroksidazë rrikë (HPR) (Dako) u krye për 1 orë në temperaturën e dhomës. Të gjitha njollat u zhvilluan nga kimilumineshenca e zgjeruar (Perkin Elmer).
 

Klikoni këtu për të lexuar më shumë rreth praktikave më të mira për lizën dhe nxjerrjen e qelizave tejzanor, përgatitjen e lizatit dhe rekomandimet për përmirësimin e procesit!
 
Tabela e mëposhtme ju jep një tregues të kapacitetit të përafërt përpunues të ultrasonikëve tanë të përmasave laboratorike:

Literatura / Referencat