Lizë ultratinguj për blotting perëndimore

  • Njollosja perëndimore është një procedurë analitike për zbulimin e proteinave specifike në një mostër të homogenatit të indeve ose ekstraktit të qelizës.
  • Për të drejtuar një njollë perëndimore ose për të matur aktivitetin enzimë, shumë analiza kërkojnë qasje në materiale (p.sh. proteina, ADN, fragmente nëncellulare) të kapur në qelizë.
  • Sonication është një metodë e besueshme dhe e lehtë për t'u trajtuar për ndërprerjen e kontrolluar të qelizave dhe lizës.

Ndërhyrja tejzanor e qelizës

Ekstrakti i proteinave nga indet dhe qelizat e kultivuara është hapi i parë për shumë teknika biologjike, biokimike dhe analitike (PAGE, blotting Western, ELISA, spectrometry masive, etj) ose pastrimit të proteinave. Për të marrë një yield të lartë proteina, materiali i qelizës dhe indet duhet të ndërpriten / lysed në mënyrë efikase. Nëse qeliza bimore ose indet e kafshëve, sonication është metoda për të përgatitur lysate qelizën tuaj të lehtë dhe të shpejtë.

Avantazhet e Sonication

  • shpejt & efikas
  • operacion i lehtë
  • rendiment i larte proteinash
  • riprodhueshme / përsëritshme
  • kontrolluar saktësisht
  • shkallëzuar

Imunoprecipitim Protokolli për imunoblotimin perëndimor

A. Reagente

Për përgatitjen e zgjidhjeve, përdorni ujë të pastër si Milli-Q.

  • 1X Fosfat Buffered Saline (PBS)
  • Buffer 1l të lizës së qelizës: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM Pyrofosfat natriumi, 1 mM β-glicerofosfat, 1 mM Na3V04, ml Leupeptin
    E rëndësishme: Shto 1 mM PMSF menjëherë para përdorimit.
  • 15 μl Proteina A + 15 μl Proteina G është e mjaftueshme për IP, por mund të varet nga antitrupi primar dhe vëllimi i mostrës. Ju gjithashtu mund të përdorni agarozë të para-përziera të proteinave A / G (p.sh. Proteina A për lepurin IgG zbres dhe Proteina G për miun IgG tërheq poshtë)
  • 3X SDS Buffer Shembull: 187.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 në 25 ° C), 6% w / v SDS, 30% glicerinë, 150 mM DTT, 0.03% w / v bromofenol blu

B. Përgatitja e Lysates Cell

  • Korrni qelizat. Për të korrur qelizat nën kushte të paqëndrueshmërisë, hiqni media dhe shpëlarje qelizat një herë me PBS me akull të ftohtë.
  • Hiqni PBS dhe shtoni 0.5 ml tampon të lizës së qelizave akull-ftohës 1X në çdo pjatë (10 cm) dhe inkuboni pllakat në akull për 5 minuta.
  • Braktisni qelizat jashtë pllakave dhe transferoni në tubat e mikrocentrifugës. Mbani në akull.
  • Sonicate dy herë për 10 sekonda në tampon imunoprecipitimi me akull të ftohtë (buffer IP: 50 mM Tris-HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40 dhe përzierës inhibitor të proteazës). Për sonication, VialTweeter ose një sondë ultrasonicator të tilla si UP100H ose UP200Ht janë më të përshtatshme.
  • Centrifugoni lysatet në 15,000 g për 10 minuta në 4 ° C.
  • Transferoni supernatantin në një tub të ri. (Nëse është e nevojshme, lysat mund të ruhen në -80 ° C.)
  • Shtoni antitrupin primar në supernatantin. Supernatanti me antitrupin kryesor inkubohet për 1 orë në 4 ° C nën agjitimin e lehtë. Antitrupi primar shtohet në mënyrë tipike në një sasi 10x më të përqendruar sesa që përdoret për blottingun perëndimor. (Mund të filloni me 1μg për 100μL.)
  • Supernatani pastaj inkubohet më tej me përzierjen e sasive të barabarta të proteinave A-agaroze (Invitrogen) dhe agarozës së proteinës G për një tjetër orë.
  • Lani fishekët agaroz tri herë me tampon IP. Më pas, ekstraktoni proteinat e lidhura me tampon ngarkues SDS-PAGE duke u ngrohur në 95 ° C për 5 minuta.

C. Imunoprecipitim

  • Merrni lizat qelizore prej 200 μl dhe shtoni antitrupat primar. Inkubo me lëkundje të buta gjatë natës në 4 ° C.
  • Shtoni ose rruaza të agarozës së proteinave A ose G (20 μl të 50% slurry bead). Inkubo me lëkundje të butë për 1-3 orë në 4 ° C.
  • Mikrocentrifugoni për 30 sekonda në 4 ° C. Lani pellet pesë herë me 500 μl të tamponës së lizës qelizore 1X. Mbani në akull gjatë larjes.
  • Resuspendim topin me 20 μl tampon 3X SDS mostër. Vorbull, pastaj microcentrifuge për 30 sekonda.
  • Nxehtësia e mostrës në 95-100 ° C për 2-5 minuta dhe mikrocentrifugimi për 1 minutë në 14,000 X g.
  • Ngarko kampionin (15-30 μl) në xhel SDS-PAGE (12-15%).
  • Analizoni mostrën nga blotting Western.

Na kontaktoni / kërkoni më shumë informacion

Bisedoni me ne në lidhje me kërkesat tuaja të përpunimit. Ne do të rekomandojë më të përshtatshme instalimit dhe përpunimit parametrat për projektin tuaj.





Ju lutem vini re tonë Politika e privatësisë.


Më shumë protokolle Sonication

Analiza Western Blot me UP50H ultrasonicator

Protokolli i mëposhtëm është përdorur në studimin e Kriebisch et al. (2011):
Proteina totale u izolua nga qelizat MC3T3-E1 të trajtuara me 1,25 (OH)2D3 (10-8 M) ose mjet. Qelizat u lizuan me një tampon që përmban 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0.1% dodecil sulfat natriumi (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) dhe 0.5% deoksikolat natriumi (Merck). Lizat e qelizës u sonicated për 2 × 10 s në ciklin 1 dhe amplitudën 80 me UP50H procesor tejzanor (Hielscher, Teknologjia ultratinguj, Teltow, Gjermani). Pastaj materiali u centrifugua për 10 min në 14,000 rpm dhe supernatanti u përdor për blotting Western. Njëzet e pesë μg proteina u zien në tampon mostër dhe agjent reduktues (Invitrogen) dhe më pas u ndanë nga SDS-PAGE duke përdorur 4-12% xhel poliakrilamid (Invitrogen) dhe u transferuan në një membranë nitroceluloze (kujdes shëndetësor GE). Membrana u bllokua për 1 orë me TBS (10 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl) që përmban 1% kazeinë (Sigma-Aldrich) dhe 1% Tris (1 M). Pas bllokimit, membrana është inkubuar me agjërim të lehtë gjatë natës në 4 ° C me antitrupin primar (CBS 1/500 anti-human lepuri, zhvilluar në laboratorin e Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA). Inkubimi me një peroksidaze të rrikë (HPR) -konjuguar sekondare konjuguar (Dako) është kryer për 1 orë në temperaturën e dhomës. Të gjitha blotet u zhvilluan nga chemiluminescence zgjeruara (Perkin Elmer).

Letërsi / Referencat



Rreth Western Blotting

Blotet janë procedurat analitike ku ADN-ja, ARN dhe proteinat transferohen në një bartës në mënyrë që ata të mund të ndahen.
Shpërthimi jugor përdoret për zbulimin e ADN-së, thërrmijën veriore për ARN dhe blotin perëndimor për proteinat.
Blotting perëndimore quhet gjithashtu immunoblotting protein sepse një antitrup është përdorur për të zbuluar në mënyrë specifike antigjenin e saj. Blotting Western është një nga metodat më të rëndësishme të analizës për të zbuluar proteinat specifike në mostër. Në njollën perëndimore, proteinat janë immobilizuar në membranat për t'i zbuluar ato duke përdorur antitrupa monoklonalë ose poliklonalë.
Nga SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) proteina amtare janë të ndara nga struktura 3-D ose proteina denaturuar nga gjatësia e polipeptidit. Proteinat pastaj transferohen në një membranë (zakonisht nitrocellulose ose PVDF), ku ata janë njollosur me antitrupa specifike për proteinë e synuar. Hapi i elektroforezës së xhelit është përfshirë në analizën perëndimore të blotit për të zgjidhur çështjen e ndër-reaktivitetit të antitrupave.
Më pas, proteinat e ndara janë të blotted mbi një matricë (kryesisht në një nitrocellulose ose PVDF membrana), ku ata janë njollosur me antitrupat. Antitrupat funksionojnë si një hetim dhe përzgjidhen në mënyrë specifike ndaj proteinës së synuar. Analiza e vendndodhjes dhe intensiteti i reaksionit specifik tregon detajet e shprehjes së proteinave të synuara në mostrën e dhënë. Blotting Western mund të zbulojë proteinën e synuar e cila është aq e ulët sa 1ng për shkak të zgjidhjes së lartë të elektroforezës së xhelit dhe specifikitetit të fortë dhe ndjeshmërisë së lartë të imunoanalizës. Metoda Western blot është përdorur në biologji molekulare, biokimi, immunogenetics dhe fusha të tjera kërkimore molekulare.
Teknika të tjera të ndërlidhura përfshijnë analizën dot-blot, immunohistochemistry dhe immunocytochemistry ku antitrupat janë përdorur për të zbuluar proteinat në indet dhe qelizat nga immunostaining, dhe enzimë të lidhura immunosorbent assay (ELISA).

Hielscher's VialTweeter is is´deal for the lysis of multiple samples

VialTweeter për preparat tejzanor

Na kontaktoni! / Pyet Na!





Ju lutem vini re tonë Politika e privatësisë.


Sonication është një hap i rëndësishëm gjatë përgatitjes së mostrës

UP200St me mikro-tip për sonication mostër