Liza e qelizave BL21 me ultratinguj

Qelizat BL21 janë një shtam i E. coli që përdoret gjerësisht në laboratorët kërkimorë, bioteknologji dhe prodhimin industrial për shkak të aftësisë së tyre për të shprehur proteina me efikasitet shumë të lartë. Shkatërrimi i qelizave, liza dhe ekstraktimi i proteinave me ultratinguj përbëjnë metodën e zakonshme për të izoluar dhe mbledhur proteinat e synuara nga brendësia e qelizave BL21. Trajtimi me ultratinguj e shkatërron plotësisht qelizën dhe çliron të gjitha proteinat e bllokuara brenda saj, duke e bërë të disponueshme 100% të proteinës.

Qelizat BL21 për shprehjen e proteinave

BL21 është një shtam bakterial i E. coli, kimikisht kompetent, i përshtatshëm për transformim dhe shprehje të proteinave në nivel të lartë duke përdorur një sistem induksioni me ARN-polimerazën T7 dhe IPTG. Qelizat BL21 mundësojnë shprehjen me efikasitet të lartë të proteinave nga çdo gjen që është nën kontrollin e një promotori T7. Shtami BL21(DE3) i E. coli është një shtam për prodhimin e proteinave i bazuar në ARN-polimerazën T7, i kombinuar me vektorë shprehjeje të bazuar në promotorin T7, dhe përdoret gjerësisht në laboratorë dhe industri për të prodhuar proteina rekombinante. Në BL21(DE3), shprehja e gjenit që kodon proteinën rekombinante transkriptohet nga ARN-polimeraza T7 (T7 RNAP) e koduar në kromozom, e cila transkripton tetë herë më shpejt se RNAP-ja konvencionale e E. coli. Kjo e bën shtamin BL21(DE3) shumë efikas dhe e shndërron atë në një nga sistemet qelizore më të parapëlqyera për shprehjen e proteinave.

Protokolli për lizën dhe ekstraktimin e proteinave nga qelizat BL21 me ultratinguj

Liza e qelizave BL21 kryhet kryesisht duke përdorur trajtimin me ultratinguj në kombinim me lauroil sarkozinatin e natriumit (i njohur edhe si sarkosyl) si tretësirë tampon për lizën. Përparësitë e shkatërrimit të qelizave dhe ekstraktimit të proteinave me ultratinguj qëndrojnë te besueshmëria, riprodhueshmëria e rezultateve, si dhe te përdorimi i thjeshtë, i sigurt dhe i shpejtë i sonikatorëve. Protokolli më poshtë jep udhëzime hap pas hapi për lizën e qelizave BL21 me ultratinguj:

• Për të larguar proteinat shaperone, sedimentet bakteriale BL21 u risuspenduan në 50 ml tretësirë tampon natrium Tris-EDTA (STE) të ftohtë si akulli (e përbërë nga 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, me shtesë prej 100 mM PMSF).
• Më pas, shtohen 500 ul lizozimë (10 mg/ ml) dhe qelizat inkubohen mbi akull për 15 min.
• Më pas, shtohen 500 ul DTT dhe 7 ml sarkosyl (10% (w/v), i përgatitur në tretësirën tampon STE).
• Është thelbësore që të gjitha tretësirat tampon për pastrim të mbahen të ftohta si akulli dhe mostrat të mbahen mbi akull gjatë gjithë kohës. Të gjithë hapat e pastrimit duhet të kryhen në dhomën e ftohtë, nëse është e mundur.



• Për lizën dhe ekstraktimin e proteinave me ultratinguj, mostrat trajtohen me ultratinguj në VialTweeter MultiSample Ultrasonicator për 4 x 30 sec me amplitudë 100%, me një interval prej 2 min ndërmjet çdo trajtimi me ultratinguj. Si alternativë, një homogjenizues me ultratinguj i tipit me sondë, me majë mikro, p.sh., UP200Ht me S26d2 (3 x 30 sec, pushim prej 2 min. ndërmjet cikleve të ultratingujve, amplitudë 80%) mund të përdoret.
• Për hapat e mëtejshëm të pastrimit, mostrat duhet të mbahen mbi akull ose, si alternativë, të ruhen në -80°C deri në përpunimin e mëtejshëm.

Liza me ultratinguj me kontroll të saktë të temperaturës

Kontrolli i saktë dhe i besueshëm i temperaturës është thelbësor gjatë punës me mostra biologjike. Temperaturat e larta nisin degradimin e proteinave të shkaktuar nga nxehtësia në mostra.
Ashtu si të gjitha teknikat mekanike të përgatitjes së mostrave, trajtimi me ultratinguj krijon nxehtësi. Megjithatë, temperatura e mostrave mund të kontrollohet mirë kur përdoret VialTweeter. Ju paraqesim mundësi të ndryshme për të monitoruar dhe kontrolluar temperaturën e mostrave tuaja gjatë përgatitjes së tyre me VialTweeter dhe VialPress për analizë.

1. Monitorimi i temperaturës së mostrës: Procesori ultrasonik UP200St, i cili vë në punë VialTweeter, është i pajisur me një softuer inteligjent dhe një sensor temperature që lidhet me prizë. Lidheni sensorin e temperaturës me UP200St dhe futeni majën e sensorit të temperaturës në një nga epruvetat e mostrave. Nëpërmjet ekranit dixhital me ngjyra dhe me prekje, mund të caktoni në menynë e UP200St një interval specifik temperature për sonikimin e mostrës suaj. Ultrasonikatori do të ndalet automatikisht kur të arrihet temperatura maksimale dhe do të qëndrojë në pauzë derisa temperatura e mostrës të bjerë në vlerën e poshtme të intervalit të caktuar të temperaturës ∆. Pastaj sonikimi fillon sërish automatikisht. Ky funksion inteligjent parandalon degradimin e shkaktuar nga nxehtësia.
2. Blloku i VialTweeter mund të ftohet paraprakisht. Vendoseni bllokun e VialTweeter (vetëm sonotrodën pa transduktor!) në frigorifer ose në ngrirës për ta ftohur paraprakisht bllokun e titanit, gjë që ndihmon në vonimin e rritjes së temperaturës në mostër. Nëse është e mundur, edhe vetë mostra mund të ftohet paraprakisht.
3. Përdorni akull të thatë për ftohje gjatë sonikimit. Përdorni një tabaka të cekët të mbushur me akull të thatë dhe vendoseni VialTweeter mbi akull në mënyrë që nxehtësia të mund të shpërndahet shpejt.

Klientë në mbarë botën përdorin VialTweeter dhe VialPress për punën e tyre të përditshme të përgatitjes së mostrave në laboratorë biologjikë, biokimikë, mjekësorë dhe klinikë. Me softuerin inteligjent dhe kontrollin e temperaturës së procesorit UP200St, temperatura kontrollohet në mënyrë të besueshme dhe shmanget degradimi i mostrave i shkaktuar nga nxehtësia. Përgatitja ultrasonike e mostrave me VialTweeter dhe VialPress jep rezultate shumë të besueshme dhe të riprodhueshme!
 

Gjeni pajisjen optimale ultrasonike për shpërbërjen e qelizave për aplikimin tuaj të lizës

Hielscher Ultrasonics është një prodhues me përvojë shumëvjeçare i pajisjeve ultrasonike me performancë të lartë për shpërbërjen e qelizave dhe i homogjenizuesve për laboratorë, sisteme tavoline dhe sisteme në shkallë industriale. Madhësia e kulturës suaj të qelizave bakteriale, objektivi juaj kërkimor ose i prodhimit dhe vëllimi i qelizave që do të përpunohen në orë ose në ditë janë faktorë thelbësorë për të gjetur pajisjen e duhur ultrasonike për shpërbërjen e qelizave për aplikimin tuaj.
Hielscher Ultrasonics ofron zgjidhje të ndryshme për sonikimin e njëkohshëm të shumë mostrave (deri në 10 flakonë me VialTweeter) dhe të mostrave në masë (d.m.th., pllaka mikrotitrimi / pllaka ELISA me UIP400MTP), si dhe ultrasonikatorin klasik laboratorik të tipit sondë me nivele të ndryshme fuqie nga 50 deri në 400 vat, deri te procesorët ultrasonikë plotësisht industrialë me deri në 16 000 vat për njësi për shpërbërjen komerciale të qelizave dhe ekstraktimin e proteinave në prodhim në shkallë të gjerë. Të gjithë ultrasonikatorët Hielscher janë ndërtuar për funksionim 24/7/365 nën ngarkesë të plotë. Qëndrueshmëria dhe besueshmëria janë veçori thelbësore të pajisjeve tona ultrasonike.
Të gjithë homogjenizuesit ultrasonikë dixhitalë janë të pajisur me softuer inteligjent, ekran me ngjyra dhe me prekje dhe regjistrim automatik të të dhënave, të cilat e bëjnë pajisjen ultrasonike një mjet pune praktik në laborator dhe në mjediset e prodhimit.
Na tregoni çfarë lloji qelizash, çfarë vëllimi, sa shpesh dhe me çfarë objektivi duhet t’i përpunoni mostrat tuaja biologjike. Ne do t’ju rekomandojmë pajisjen ultrasonike më të përshtatshme për shpërbërjen e qelizave sipas kërkesave të procesit tuaj.

Tabela më poshtë ju jep një ide për kapacitetin e përafërt të përpunimit të sistemeve tona ultrasonike, nga homogjenizuesit kompaktë që mbahen në dorë dhe ultrasonikatorët MultiSample deri te procesorët ultrasonikë industrialë për aplikime komerciale:

Literatura / Referencat

• Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
• LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
• Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
• Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.