Liza e qelizave të qelizave BL21 me ultratinguj
Qelizat BL21 janë një lloj i E. coli që përdoret gjerësisht në laboratorët kërkimorë, bioteknologji dhe prodhimin industrial për shkak të aftësisë së tyre për të shprehur proteina shumë efikase. Ndërprerja e qelizave tejzanor, liza dhe nxjerrja e proteinave është metoda e zakonshme për të izoluar dhe mbledhur proteinat e synuara nga brendësia qelizore e qelizave BL21. Ultratingulli prish plotësisht qelizën dhe liron të gjitha proteinat e bllokuara, duke e bërë të disponueshme 100% të proteinës.
Qelizat BL21 për shprehjen e proteinave
Qeliza BL21 është një shtam bakterial E. coli me kompetencë kimike i përshtatshëm për transformim dhe shprehje të proteinave të nivelit të lartë duke përdorur një sistem induksioni T7 RNA polimerazë-IPTG. Qelizat BL21 lejojnë shprehjen e proteinave me efikasitet të lartë të çdo gjeni që është nën kontrollin e një promotori T7. Lloji E. coli BL21(DE3) është një shtam i prodhimit të proteinave me bazë polimerazën T7 RNA i kombinuar me vektorët shprehës të bazuar në promotorin T7 dhe përdoret gjerësisht në laboratorë dhe industri për të prodhuar proteina rikombinante. Në BL21(DE3), shprehja e gjenit që kodon proteinën rekombinante transkriptohet nga polimeraza e ARN T7 e koduar kromozomale (T7 RNAP), e cila transkriptohet tetë herë më shpejt se RNAP konvencionale E. coli. Kjo e bën shtamin BL21(DE3) shumë efikas dhe e kthen atë në një nga sistemet qelizore më të preferuara të shprehjes së proteinave.
Protokolli për lizën tejzanor dhe nxjerrjen e proteinave nga qelizat BL21
Liza e qelizave të qelizave BL21 kryhet kryesisht duke përdorur ultratinguj në kombinim me lauroil sarkosinat natriumi (i njohur gjithashtu si sarkosyl) si tampon lize. Përparësitë e përçarjes së qelizave tejzanor dhe nxjerrjes së proteinave qëndrojnë në besueshmërinë, riprodhueshmërinë si dhe funksionimin e thjeshtë, të sigurt dhe të shpejtë të ultrasonikëve. Protokolli i mëposhtëm jep një drejtim hap pas hapi për lizën tejzanor të qelizave BL21:
- Për të hequr proteinat chaperone, peletat bakteriale BL21 u risuspenduan në 50 ml bufer natriumi Tris-EDTA (STE) të ftohtë me akull (që përbëhet nga 10 mM Tris-HCL, pH 8.0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl plotësuar me 100 mM PMSF).
- Shtohen 500 ul lizozimë (10 mg/ml) dhe qelizat inkubohen në akull për 15 min.
- Më pas, shtohen 500 ul DTT dhe 7 ml sarkosyl (10% (w/v) i përbërë në tampon STE).
- Është thelbësore që të gjitha tamponët e pastrimit të mbahen të ftohtë në akull dhe të ruhen mostrat në akull gjatë gjithë kohës. Të gjitha hapat e pastrimit duhet të kryhen në dhomën e ftohtë nëse është e mundur.
- Për lizën tejzanor dhe nxjerrjen e proteinave, mostrat janë sonikuar në Ultrasonikator MultiSample VialTweeter për 4 x 30 sek me amplitudë 100% me një interval prej 2 minutash ndërmjet çdo sonikimi. Përndryshe, një homogjenizues tejzanor i tipit sondë me mikro-majë p.sh. UP200Ht me S26d2 (3 x 30 sek, 2 min. pauzë ndërmjet cikleve ultrasonike, amplitudë 80%) mund të përdoret.
- Për hapat e mëtejshëm të pastrimit, mostrat duhet të mbahen në akull ose në mënyrë alternative të ruhen në -80°C deri në përpunim të mëtejshëm.
Ndërprerës tejzanor i qelizave UP200St me mikro-majë S26d2 për lizën dhe nxjerrjen e proteinave
Lizë tejzanor nën kontrollin e saktë të temperaturës
Kontrolli i saktë dhe i besueshëm i temperaturës është thelbësor gjatë trajtimit të mostrave biologjike. Temperaturat e larta nisin degradimin e proteinave të induktuara termikisht në mostra.
Si të gjitha teknikat mekanike të përgatitjes së mostrës, sonikimi krijon nxehtësi. Megjithatë, temperatura e mostrave mund të kontrollohet mirë kur përdorni VialTweeter. Ne ju paraqesim opsione të ndryshme për të monitoruar dhe kontrolluar temperaturën e mostrave tuaja gjatë përgatitjes së tyre me VialTweeter dhe VialPress për analizë.
- Monitorimi i temperaturës së mostrës: Procesori tejzanor UP200St, i cili drejton VialTweeter, është i pajisur me një softuer inteligjent dhe një sensor të temperaturës që mund të mbyllet. Futni sensorin e temperaturës në UP200St dhe futni majën e sensorit të temperaturës në një nga tubat e mostrës. Nëpërmjet ekranit me prekje dixhitale me ngjyra, mund të vendosni në menynë e UP200St një gamë specifike të temperaturës për sonikacionin tuaj të mostrës. Ultrasonikatori do të ndalojë automatikisht kur të arrihet temperatura maksimale dhe do të ndalojë derisa temperatura e mostrës të bjerë në vlerën më të ulët të temperaturës së caktuar ∆. Pastaj sonication fillon automatikisht përsëri. Kjo veçori inteligjente parandalon degradimin e shkaktuar nga nxehtësia.
- Blloku VialTweeter mund të ftohet paraprakisht. Vendosni bllokun VialTweeter (vetëm sonotrode pa dhënës!) në frigorifer ose ngrirës për të ftohur paraprakisht bllokun e titanit, ndihmon për të shtyrë rritjen e temperaturës në mostër. Nëse është e mundur, edhe vetë kampioni mund të ftohet paraprakisht.
- Përdorni akull të thatë për t'u ftohur gjatë sonikimit. Përdorni një tabaka të cekët të mbushur me akull të thatë dhe vendosni VialTweeter në akull në mënyrë që nxehtësia të shpërndahet me shpejtësi.
Konsumatorët në mbarë botën përdorin VialTweeter dhe VialPress për punën e tyre të përditshme të përgatitjes së mostrave në laboratorët biologjikë, biokimikë, mjekësorë dhe klinikë. Softueri inteligjent dhe kontrolli i temperaturës së procesorit UP200St, temperatura kontrollohet në mënyrë të besueshme dhe shmanget degradimi i mostrës i shkaktuar nga nxehtësia. Përgatitja e mostrës tejzanor me VialTweeter dhe VialPress jep rezultate shumë të besueshme dhe të riprodhueshme!
Gjeni ndërprerësin optimal tejzanor për aplikacionin tuaj Lysis
Hielscher Ultrasonics është prodhues me përvojë për një kohë të gjatë të ndërprerësve dhe homogjenizuesve të qelizave ultrasonike me performancë të lartë për laboratorë, sisteme të shtratit dhe në shkallë industriale. Madhësia e kulturës suaj të qelizave bakteriale, qëllimi juaj i kërkimit ose prodhimit dhe vëllimi i qelizës për t'u përpunuar në orë ose ditë janë faktorë thelbësorë për të gjetur ndërprerësin e duhur të qelizave tejzanor për aplikimin tuaj.
Hielscher Ultrasonics ofron zgjidhje të ndryshme për sonikimin e njëkohshëm të mostrave të shumëfishta (deri në 10 shishkë me VialTweeter) dhe mostra masive (p.sh., pllaka mikrotitërore / pllaka ELISA me UIP400MTP), si dhe ultrasonikatorin klasik laboratorik të tipit sonda me të ndryshme nivelet e fuqisë nga 50 në 400 vat deri tek procesorët ultrasonikë plotësisht industrialë me deri në 16,000 vat për njësi për ndërprerjen e qelizave komerciale dhe nxjerrjen e proteinave në prodhim të madh. Të gjithë ultrasonikët Hielscher janë ndërtuar për funksionimin 24/7/365 nën ngarkesë të plotë. Qëndrueshmëria dhe besueshmëria janë tiparet kryesore të pajisjeve tona ultrasonike.
Të gjithë homogjenizuesit dixhitalë tejzanor janë të pajisur me softuer inteligjentë, ekran me prekje me ngjyra dhe protokollim automatik të të dhënave, të cilat e bëjnë pajisjen tejzanor në një mjet pune të përshtatshëm në laborator dhe në ambientet e prodhimit.
Na tregoni se çfarë lloj qelizash, çfarë vëllimi, me çfarë frekuence dhe me çfarë objektivi keni për të përpunuar mostrat tuaja biologjike. Ne do t'ju rekomandojmë ndërprerësin më të përshtatshëm të qelizave tejzanor për kërkesat tuaja të procesit.
Tabela më poshtë ju jep një tregues të kapacitetit të përafërt të përpunimit të sistemeve tona tejzanor nga homogjenizuesit kompakt me dorë dhe ultrasonikët MultiSample deri tek procesorët industrialë ultrasonikë për aplikime komerciale:
| Vëllimi i grupit | Shkalla e rrjedhjes | Pajisjet e rekomanduara |
|---|---|---|
| Pllaka 96-pus / mikrotitër | na | UIP400MTP |
| 10 shishe nga 0,5 deri në 1,5 ml | na | VialTweeter në UP200 St |
| 0.01 deri në 250mL | 5 deri në 100 ml/min | UP50H |
| 0.01 deri në 500mL | 10 deri në 200 ml/min | UP100H |
| 10 deri në 2000 ml | 20 deri në 400 ml/min | UP200Ht, UP400 St |
| 0.1 deri në 20L | 0.2 deri në 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 deri në 100 litra | 2 deri në 10 l/min | UIP4000hdT |
| na | 10 deri në 100 l/min | UIP16000 |
| na | më të mëdha | grumbull i UIP16000 |
Na kontaktoni! / Na pyesni!
Sonicator pllakash UIP400MTP për ndërprerjen e qelizave me fuqi të lartë në pllakat me 96 pus
ultrasonikator UP200Ht me mikromajë 2mm S26d2 për sonikimin e mostrave të vogla
Lexoni më shumë se si mund të përdorni homogjenizuesin tuaj tejzanor të indeve për përgatitjen efikase dhe të besueshme të solucioneve tampon!
Fakte që ia vlen të dihen
Bakteret Escherichia Coli
Escherichia coli është një lloj bakteri, që nuk formon spore, gram-negativ dhe karakterizohet nga forma e një shufre të drejtë. Bakteret E.coli janë të pranishme në mjedisin, ushqimet dhe zorrët e njerëzve dhe kafshëve. E. coli është zakonisht i lëvizshëm duke përdorur flagjela peritrikoze, por ka edhe lloje jolëvizëse. E.coli janë të ashtuquajtur organizma kemioorganotrof anaerobe fakultativisht, që do të thotë se janë të aftë si për metabolizëm respirator ashtu edhe për fermentim. Shumica e llojeve të E.coli janë beninje dhe kryejnë funksione të dobishme në trup, p.sh. shtypin rritjen e specieve të dëmshme bakteriale, sintetizimin e vitaminave etj.
Qelizat e baktereve Escherichia coli të të ashtuquajturit tip B janë një kategori e veçantë e shtameve E.coli, të cilat përdoren gjerësisht në kërkime për të hetuar mekanizma të tillë si ndjeshmëria ndaj bakteriofagut ose sistemet e modifikimit të kufizimit. Për më tepër, bakteret E.coli vlerësohen si kalë pune e besueshme për shprehjen e proteinave në laboratorët e bioteknologjisë dhe shkencës së jetës. Për shembull, E.coli përdoret për të sintetizuar komponime të tilla si proteinat dhe oligosakaridet në shkallë industriale. Për shkak të veçorive specifike si mungesa e proteazës, prodhimi i ulët i acetatit në një nivel të lartë të glukozës dhe përshkueshmëria e shtuar, qelizat B E. coli janë qelizat pritëse më të përdorura për prodhimin e proteinave të modifikuara gjenetikisht.
Proteina Rekombinante
Proteinat rekombinante (rProt) po fitojnë një rëndësi të madhe në degë të shumëfishta, duke përfshirë prodhimin kimik, farmaceutikë, kozmetikë, mjekësi njerëzore dhe kafshë, bujqësi, ushqim si dhe industrinë e trajtimit të mbetjeve.
Prodhimi i proteinave rekombinante kërkon përdorimin e një sistemi shprehjeje. Si sisteme qelizore shprehëse për prodhimin e ADN-së rekombinante, mund të përdoren qelizat prokariote dhe eukariote. Ndërsa qelizat bakteriale përdoren më gjerësisht për shprehjen e proteinave për shkak të faktorëve të tillë si kostoja e ulët, shkallëzimi i lehtë dhe kushtet e thjeshta të medias, gjitarët, majatë, algat, insektet dhe sistemet pa qeliza janë alternativa të vendosura. Lloji i proteinës, aktiviteti funksional, si dhe rendimenti i kërkuar i proteinës së shprehur ndikojnë në përzgjedhjen e sistemit qelizor të përdorur për shprehjen e proteinave.
Për të shprehur proteinën rekombinante, një qelizë e veçantë duhet të transfektohet me një vektor ADN që përmban shabllonin e ADN-së rekombinante. Qelizat e transfektuara me shabllon më pas kultivohen. Si pasojë e mekanizmit qelizor, qelizat transkriptojnë dhe përkthejnë proteinën e interesit, duke prodhuar kështu proteinën e synuar.
Meqenëse proteinat e shprehura janë të bllokuara në matricën qelizore, qeliza duhet të lizohet (ndërpritet dhe thyhet) për të çliruar proteinat. Në një hap pasues të pastrimit, proteina ndahet dhe pastrohet.
Proteina e parë rekombinante e përdorur në trajtim ishte insulina humane rekombinante në vitin 1982. Sot, më shumë se 170 lloje të proteinave rekombinante prodhohen në mbarë botën për trajtime mjekësore. Proteinat rekombinante të përdorura zakonisht në mjekësi janë për shembull hormonet rekombinante, interferonet, interleukinat, faktorët e rritjes, faktorët e nekrozës së tumorit, faktorët e koagulimit të gjakut, ilaçet trombolitike dhe enzimat për trajtimin e sëmundjeve të mëdha si diabeti, xhuxhizmi, infarkti i miokardit, dështimi kongjestiv i zemrës, apopleksi cerebrale, skleroza e shumëfishtë, neutropenia, trombocitopenia, anemia, hepatiti, artriti reumatoid, astma, sëmundja e Crohn dhe terapitë e kancerit. (krh. Phuc V. Pham, në Omics Technologies and Bio-Inxhiniering, 2018)
Literatura / Referencat
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
Sonicator VialTweeter për sonikimin e njëkohshëm të 10 mostrave, p.sh. për të prishur qelizat BL21
Ultrasonikë me performancë të lartë! Gama e produkteve të Hielscher mbulon spektrin e plotë nga ultrasonikatori kompakt laboratorik mbi njësitë e sipërme të stolit deri te sistemet tejzanor të plotë industrial.