Liza e qelizave të qelizave BL21 nga Ultrasonication
Qelizat BL21 janë një farë e E. coli që përdoret gjerësisht në laboratorët kërkimorë, bioteknologjinë dhe prodhimin industrial për shkak të aftësisë së tyre për të shprehur proteina shumë efikase. Përçarja tejzanor e qelizave, liza dhe nxjerrja e proteinave është metoda e zakonshme për të izoluar dhe mbledhur proteinat e synuara nga brendësia qelizore e qelizave BL21. Ultrasonikimi prish plotësisht qelizën dhe çliron të gjitha proteinat e bllokuara, duke bërë të disponueshme 100% të proteinave.
Qelizat BL21 për Shprehjen e Proteinave
Qeliza BL21 është një shtam bakterial E. coli kompetent kimikisht i përshtatshëm për transformim dhe shprehje të nivelit të lartë të proteinave duke përdorur një sistem induksioni polimerazë ARN T7. Qelizat BL21 lejojnë shprehjen e proteinave me efikasitet të lartë të çdo gjeni që është nën kontrollin e një promovuesi T7. Tensioni E. coli BL21 (DE3) është një shtam i prodhimit të proteinave me bazë polimeraza në ARN T7 i kombinuar me vektorë të shprehjes të bazuar në promovues T7 dhe zbatohet gjerësisht në laboratorë dhe industri për të prodhuar proteina rekombinante. Në BL21 (DE3), shprehja e gjenit që kodifikon proteinën rekombinante transkriptohet nga polimeraza T7 RNA e kodifikuar kromozomalisht (T7 RNAP), e cila transkripton tetë herë më shpejt sesa E. coli RNAP konvencionale. Kjo e bën llojin BL21 (DE3) shumë efikas dhe e kthen atë në një nga sistemet më të preferuara të qelizave të shprehjes së proteinave.
Protokolli për Lizën tejzanor dhe Nxjerrjen e Proteinave nga Qelizat BL21
Liza qelizore e qelizave BL21 kryhet kryesisht duke përdorur ultrasonikacionin në kombinim me sarkozinatin e natriumit lauroyl (i njohur gjithashtu si sarkosil) si tampon i lizës. Përparësitë e përçarjes së qelizave tejzanor dhe nxjerrjes së proteinave qëndrojnë në besueshmërinë, riprodhueshmërinë, si dhe funksionimin e thjeshtë, të sigurt dhe të shpejtë të ultrasonicatorëve. Protokolli më poshtë jep një drejtim hap pas hapi për lizën tejzanor të qelizave BL21:
- Në mënyrë që të hiqen proteinat chaperone, fishekët bakterialë BL21 u rishpenzuan në 50 ml tampon natriumi Tris-EDTA (STE) i ftohtë (i përbërë nga 10 mM Tris-HCL, pH 8.0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl i plotësuar me 100 mM PMSF).
- Shtohen 500 ulçe lizozimë (10 mg / ml) dhe qelizat inkubohen në akull për 15 min.
- Më pas, shtohen 500 ul DTT dhe 7 ml sarkozil (10% (w / v) i përbërë në tampon STE).
- Essentialshtë thelbësore që të gjitha tamponët e pastrimit të mbahen të ftohtë dhe të ruhen mostrat në akull gjatë gjithë kohës. Të gjitha hapat e pastrimit duhet të kryhen në dhomën e ftohtë nëse është e mundur.
- Për lizën tejzanor dhe nxjerrjen e proteinave, mostrat sonikohen në Ultrasonicator VialTweeter MultiSample për 4 x 30 sek në amplituda 100% me një interval 2 min midis secilës sonifikim. Përndryshe, një homogjenizues tejzanor i tipit sondë me mikro tip, p.sh., UP200Ht me S26d2 (3 x 30 sekonda, 2 min. pauzë midis cikleve tejzanor, mund të përdoret amplituda 80%).
- Për hapat e mëtejshëm të pastrimit, mostrat duhet të mbahen në akull ose të ruhen në -80 ° C deri në përpunimin e mëtejshëm.
Përçarës i qelizave tejzanor UP200St me mikro-tip S26d2 për lizë dhe ekstraktim të proteinave
Lizë tejzanor nën kontrollin e temperaturës prescize
Kontrolli i saktë dhe i besueshëm i temperaturës është thelbësor kur merren me mostrat biologjike. Temperaturat e larta fillojnë degradimin e proteinave të nxitura termikisht në mostra.
Si të gjitha teknikat mekanike të përgatitjes së mostrës, sonifikimi krijon nxehtësi. Sidoqoftë, temperatura e mostrave mund të kontrollohet mirë kur përdorni VialTweeter. Ne ju paraqesim mundësi të ndryshme për të monitoruar dhe kontrolluar temperaturën e mostrave tuaja ndërsa i përgatisni ato me VialTweeter dhe VialPress për analizë.
- Monitorimi i temperaturës së mostrës: Procesori tejzanor UP200St, i cili drejton VialTweeter, është i pajisur me një softuer inteligjent dhe një sensor të temperaturës të mbyllur. Vendosni sensorin e temperaturës në UP200St dhe futni majën e sensorit të temperaturës në një nga tubat e mostrës. Nëpërmjet ekranit dixhital me prekje me ngjyrë, mund të vendosni në menunë e UP200St një diapazon specifik të temperaturës për sonifikimin tuaj të mostrës. Ultrasonicator automatikisht do të ndalet kur të arrihet temperatura maksimale dhe të ndalojë derisa temperatura e mostrës të ulet në vlerën më të ulët të temperaturës së caktuar. Pastaj sonifikimi fillon përsëri automatikisht. Kjo veçori inteligjente parandalon degradimin e shkaktuar nga nxehtësia.
- Blloku VialTweeter mund të ftohet paraprakisht. Vendosni bllokun VialTweeter (vetëm sonotroda pa këmbyes!) Në frigorifer ose frigorifer për të ftohur paraprakisht bllokun e titanit ndihmon në shtyrjen e rritjes së temperaturës në mostër. Nëse është e mundur, vetë kampioni mund të ftohet gjithashtu paraprakisht.
- Përdorni akull të thatë për t’u ftohur gjatë zërit. Përdorni një tabaka të cekët të mbushur me akull të thatë dhe vendoseni VialTweeter mbi akull në mënyrë që nxehtësia të shpërndahet shpejt.
Klientët në të gjithë botën përdorin VialTweeter dhe VialPress për punën e tyre të përditshme të përgatitjes së mostrës në laboratorë biologjikë, biokimikë, mjekësorë dhe klinikë. Programi inteligjent dhe kontrolli i temperaturës së procesorit UP200St, temperatura kontrollohet në mënyrë të besueshme dhe shmanget degradimi i mostrës i nxitur nga nxehtësia. Përgatitja e mostrës tejzanor me VialTweeter dhe VialPress jep rezultate shumë të besueshme dhe të riprodhueshme!
Gjeni përçarësin tejzanor optimal për aplikimin tuaj të lizës
Hielscher Ultrasonics është prodhues me përvojë për kohë të gjatë i ndërprerësve dhe homogjenizuesve të qelizave tejzanor me performancë të lartë për laboratorë, sisteme të nivelit të lartë dhe të shkallës industriale. Madhësia e kulturës tuaj të qelizave bakteriale, qëllimi juaj i hulumtimit ose prodhimit dhe vëllimi i qelizës që duhet të përpunohet në orë ose ditë janë faktorë thelbësorë për të gjetur përçarësin e duhur të qelizave tejzanor për aplikimin tuaj.
Hielscher Ultrasonics ofron zgjidhje të ndryshme për sonifikimin e njëkohshëm të shumë-mostrave (deri në 10 shishka me VialTweeter) dhe mostrave masive (dmth., Pllaka mikrotiteri / pllaka ELISA me UIP400MTP), si dhe ultrasonicator klasik i tipit të sondës me ndryshe nivelet e energjisë nga 50 në 400 vat në procesorë ultrasonikë plotësisht industriale me deri në 16,000 vat për njësi për prishjen e qelizave komerciale dhe nxjerrjen e proteinave në prodhim të madh. Të gjithë ultrasonicatorët e Hielscher janë ndërtuar për funksionimin 24/7/365 nën ngarkesë të plotë. Fortësia dhe besueshmëria janë tiparet thelbësore të pajisjeve tona tejzanor.
Të gjithë homogjenizuesit dixhital tejzanor janë të pajisur me softuer inteligjent, ekran me ngjyra të prekura dhe protokollim automatik të të dhënave, të cilat e bëjnë pajisjen tejzanor në një mjet pune të përshtatshëm në laborator dhe objektet e prodhimit.
Na tregoni, çfarë lloj qelizash, çfarë vëllimi, me çfarë frekuence dhe me çfarë synimi keni për të përpunuar mostrat tuaja biologjike. Ne do t'ju rekomandojmë përçarësin më të përshtatshëm të qelizave tejzanor për kërkesat tuaja të procesit.
Tabela më poshtë ju jep një tregues të kapacitetit të përafërt të përpunimit të sistemeve tona tejzanor nga homogjenizuesit kompaktë dore dhe Ultrasonicators MultiSample te përpunuesit tejzanor industrialë për aplikime komerciale:
| Vëllimi i Serisë | Shkalla e rrjedhjes | Devices rekomanduara |
|---|---|---|
| Pllaka 96-pus / mikrotiter | na | UIP400MTP |
| 10 shishka à 0.5 deri 1.5 ml | na | VialTweeter në UP200St |
| 00,01 deri në 250 ml | 5 deri në 100mL / min | UP50H |
| 0.01 deri në 500 ml | 10 deri 200mL / min | UP100H |
| 10 deri në 2000 ml | 20 deri 400mL / min | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 deri në 20L | 0.2 deri në 4L / min | UIP2000hdT |
| 10 deri në 100L | 2 deri në 10L / min | UIP4000hdT |
| na | 10 deri në 100L / min | UIP16000 |
| na | më e madhe | grup i UIP16000 |
Na kontaktoni! / Pyet Na!
Sonicator i pllakave UIP400MTP për ndërprerjen e qelizave me fuqi të lartë në pllaka 96 pusesh
ultrasonicator UP200Ht me mikrotip 2mm S26d2 për sonifikimin e mostrave të vogla
Lexoni më shumë se si mund të përdorni homogjenizuesin tuaj tejzanor të indeve për përgatitjen efikase dhe të besueshme të solucioneve tampon!
Fakte të vlefshme
Bakteret Escherichia Coli
Escherichia coli është një lloj bakteri, që nuk krijon spore, Gram-negative dhe karakterizohet nga forma e tij e një shufre të drejtë. Bakteret E.coli janë të pranishme në mjedis, ushqime dhe zorrët e njerëzve dhe kafshëve. E. coli është zakonisht lëvizës duke përdorur flagelën peritrichous, por ka edhe lloje jo-lëvizës. E.coli janë të ashtuquajtur organizma kemoorganotrof fakultativë anaerobe, që do të thotë se janë të aftë për të dy metabolizmin e frymëmarrjes dhe atë fermentues. Shumica e llojeve të E.coli janë beninje dhe përmbushin funksione të dobishme në trup, p.sh. shtypjen e rritjes së specieve të dëmshme bakteriale, sintetizimin e vitaminave etj.
Qeliza e baktereve Escherichia coli e të ashtuquajturit tip B janë një kategori e veçantë e shtameve E.coli, të cilat përdoren gjerësisht në kërkime për të hetuar mekanizma të tillë si ndjeshmëria ndaj bakterofagut ose sistemet e modifikimit të kufizimit. Për më tepër, bakteret E.coli vlerësohen si kali i besueshëm i punës për shprehjen e proteinave në bioteknologji dhe laboratorë të shkencave të jetës. Për shembull, E.coli përdoren për të sintetizuar përbërje të tilla si proteina dhe oligosakaride në shkallë industriale. Për shkak të veçorive specifike si mungesa e proteazës, prodhimi i ulët i acetatit në një nivel të lartë të glukozës dhe depërtueshmëria e shtuar, qelizat B. coli B janë ato që përdoren më shpesh qelizat pritëse për prodhimin e proteinave të inxhinierizuara gjenetikisht.
Proteina rekombinante
Proteinat rekombinante (rProt) po fitojnë një rëndësi të konsiderueshme në degët e shumëfishta, duke përfshirë prodhimin kimik, farmaceutik, kozmetik, ilaçe njerëzore dhe shtazore, bujqësi, ushqim si dhe industri të trajtimit të mbeturinave.
Prodhimi i proteinave rekombinante kërkon përdorimin e një sistemi shprehës. Si sisteme qelizore shprehëse për prodhimin e ADN-së rekombinante, mund të përdoren qelizat prokariotike dhe eukariotike. Ndërsa qelizat bakteriale përdoren më gjerësisht për shprehjen e proteinave për shkak të faktorëve të tillë si kostoja e ulët, shkallëzimi i lehtë dhe kushtet e thjeshta të medias, gjitarët, majaja, algat, insektet dhe sistemet pa qeliza janë krijuar si alternativa. Lloji i proteinave, aktiviteti funksional, si dhe rendimenti i kërkuar i proteinave të shprehura ndikojnë në zgjedhjen e sistemit qelizor të përdorur për shprehjen e proteinave.
Në mënyrë që të shprehet proteina rekombinante, një qelizë e veçantë duhet të transfektohet me një vektor të ADN-së që përmban shabllonin e ADN-së rekombinante. Qelizat e transfertuara me shabllonin pastaj kultivohen. Si pasojë e mekanizmit qelizor, qelizat transkriptojnë dhe përkthejnë proteinën me interes, duke prodhuar kështu proteinën e synuar.
Ndërsa proteinat e shprehura bllokohen në matricën qelizore, qeliza duhet të lihet (prishet dhe prishet) për të çliruar proteinat. Në një hap pasues të pastrimit, proteina ndahet dhe pastrohet.
Proteina e parë rekombinante e përdorur në trajtim ishte insulina njerëzore rekombinante në 1982. Sot, më shumë se 170 lloje të proteinave rekombinante prodhohen në të gjithë botën për trajtime mjekësore. Proteinat rekombinante të përdorura zakonisht në mjekësi janë për shembull hormonet rekombinante, interferonet, interleukinat, faktorët e rritjes, faktorët e nekrozës tumorale, faktorët e koagulimit të gjakut, barnat trombolitike dhe enzimat për trajtimin e sëmundjeve kryesore si diabeti, xhuxhizmi, infarkti i miokardit, dështimi i zemrës kongjestive, apopleksia cerebrale, skleroza e shumëfishtë, neutropenia, trombocitopenia, anemia, hepatiti, artriti reumatoid, astma, sëmundja e Crohn dhe terapitë e kancerit. (krh. Phuc V. Pham, në Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)
Literatura / Referencat
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
Sonicator VialTweeter për sonikimin e njëkohshëm të 10 mostrave, p.sh. për të prishur qelizat BL21
Ultrasonikët me performancë të lartë! Gama e produkteve të Hielscher mbulon spektrin e plotë nga ultrasonicatori i laboratorit kompakt mbi njësitë e nivelit të lartë deri te sistemet tejzanor tërësisht industriale.