Protokolli për inaktivizimin e Coronavirus SARS-CoV-2 me Sonication

Hielscher VialTweeter është një njësi unike e përgatitjes tejzanor me shumë mostra, e cila përdoret për të çaktivizuar koronavirusin SARS-COV-2. VialTweeter ju lejon të përgatitni deri në 10 shishe mostrash në të njëjtën kohë dhe në këtë mënyrë është njësia ideale për përpunimin masiv të mostrave.

Inaktivizimi i Coronavirus SARS-CoV-2 me VialTweeter

Pas heqjes së fiksuesit, monoshtresat u lanë tri herë me kripë të kripur të puferuar me fosfat (PBS) përpara se të kryheshin qelizat në 1 ml MEM/5% FBS dhe u sonikuan (3 × 10 sekonda, 10 sekonda jashtë me fuqi dhe amplitudë 100%) duke përdorur Hielscher. procesor tejzanor UP200St me VialTweeter shtojcën. Supernatantët u sqaruan duke u centrifuguar në 3000 × g për 10 minuta. Lexoni protokollin e plotë këtu për çaktivizimin e koronavirusit SARS-CoV-2 nga Welch et al. (2020) më poshtë:

Qelizat dhe viruset

Qelizat Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) u kultivuan në mjedisin minimal esencial të modifikuar të Eagle (MEM) të plotësuar me 10% (v/v) serum fetusi të viçit (FCS). Virusi i përdorur ishte shtami SARS-CoV-2 hCOV-19/Angli/2/2020, i izoluar nga PHE nga grupi i parë i pacientëve në MB më 29/01/2020. Ky virus u mor në kalimin 1 dhe u përdor për studimet e inaktivizimit në pasazhin 2 ose 3.
Për reagentët dhe kimikatet e përdorura për inaktivizimin e SARS-CoV-2, si dhe heqjen e citotoksicitetit të reagentit, ju lutemi shihni raportin shkencor të Welch et al. (2020).

Inaktivizimi i virusit nga detergjentët – Protokolli i inaktivizimit të Coronavirus SARS-CoV-2 nga Welch et al. 2020

Inaktivizimi i SARS-CoV-2

Për produktet komerciale, preparatet e virusit (lëngu i kulturës së indeve, titrat që variojnë nga 1 × 10⁶ në 1 × 10⁸ PFU/ml) u trajtuan në tre kopje me reagentë në përqendrime dhe për kohë kontakti të rekomanduara në udhëzimet e prodhuesit për përdorim, aty ku ka, ose për përqendrimet dhe kohët e kërkuara në mënyrë specifike nga laboratorët e testimit. Aty ku një sërë përqendrimesh ishte dhënë nga prodhuesi, u testua raporti më i ulët i produktit me kampionin (dmth. përqendrimi më i ulët i rekomanduar i produktit të testimit). Reagentët e tubave të transportit të mostrës u testuan duke përdorur një raport prej një vëllimi të lëngut të kulturës së indeve me dhjetë vëllime të reagentit, përveç rasteve kur një raport vëllimi i lëngut të mostrës ndaj reagentit ishte specifikuar nga prodhuesi. Detergjentët, fiksuesit dhe tretësit u testuan në përqendrimet e treguara për kohën e treguar. Të gjitha hapat e çaktivizimit u kryen në temperaturën e dhomës së ambientit (18 – 25°C). Për testimin e llojeve alternative të mostrave, virusi u fut në matricën e mostrës së treguar në një raport prej 1:9, më pas u trajtua me reagentët testues si më sipër. Të gjitha eksperimentet përfshinin mostra të trajtuara me kontroll të trefishtë me një vëllim ekuivalent PBS në vend të reagentit të testimit. Menjëherë pas kohës së kërkuar të kontaktit, 1 mL kampion i trajtuar u përpunua duke përdorur matricën e filtrimit të zgjedhur siç duhet. Heqja e reagentit për testimin e çaktivizimit u krye në një format më të madh të kolonës rrotulluese duke përdorur kolonat Pierce 4mL për heqjen e detergjentit (Thermo Fisher), ose duke mbushur kolonat boshe të centrifugës me kapacitet 10 ml Pierce (Thermo Fisher) me SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-40 Sephadex LH-20 për të dhënë 4 ml rruaza/rrëshirë të paketuara. Për pastrimin duke përdorur filtrat Amicon, mostrat 2 × 500 μl u pastruan duke përdorur dy filtra centrifugale me metodën e përshkruar më parë, më pas u grumbulluan së bashku. Për formaldehidin dhe formaldehidin me heqjen e glutaraldehidit, u përdor një filtër me volum kampioni 1×500μl, u risuspendua pas përpunimit në 500μl PBS dhe u shtua në 400ul MEM/5% FBS. Për inaktivizimin e të infektuarve njështresore, 12,5 cm² shishe me qeliza Vero E6 (2,5 × 10⁶ qelizat/flakë në 2.5 ml MEM/5% FBS) u infektuan në MOI 0.001 dhe u inkubuan në 37°C/5% CO₂ për 24 orë. Supernatanti u hoq dhe qelizat u fiksuan duke përdorur 5 ml formaldehid, ose formaldehid dhe glutaraldehid në temperaturën e dhomës për 15 ose 60 minuta. Fiksuesi u hoq dhe monoshtresat u lanë tre herë me PBS përpara se të gërvishteshin qelizat në 1 ml MEM/5% FBS dhe të sonikoheshin (3 × 10 sekonda ndezur, 10 sekonda fikur me fuqi 100% dhe amplitudë) duke përdorur një UP200St me shtojcën VialTweeter (Hielscher Ultratinguj Teknologjia). Supernatantët u sqaruan duke u centrifuguar në 3000 × g për 10 minuta.

Detajet e reagentit të përdorur për inaktivizimin e koronavirusit SARS-CoV-2 me VialTweeter tejzanor sipas protokollit nga Welch et al. 2020

Protokollin e plotë duke përfshirë përdorimin e Hielscher VialTweeter mund ta gjeni këtu:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Dismembratorë dhe përçarës të qelizave të sofistikuara tejzanor

Ultrasonikatori me shumë mostra VialTweeter është vetëm një nga zgjidhjet e shumta tejzanor për përgatitjen e mostrës në laboratorët biologjikë, biokimikë dhe klinikë. Hielscher Ultrasonics ofron dismembratorin ideal tejzanor për aplikimin tuaj, p.sh. lizën e qelizave, nxjerrjen e qelizave, homogjenizimin e indeve, tretjen e lizatit, tretjen, degazimin e kampionit etj.
Na tregoni se sa mostra duhet të përpunoni në orë dhe ditë, nëse preferoni sonikacion direkt ose indirekt dhe cili është objektivi i trajtimit të mostrës me ultratinguj. Ne do t'ju rekomandojmë njësinë më të përshtatshme tejzanor për rutinën tuaj të përditshme të punës!
Procesorët dixhital tejzanor të Hielscher Ultrasonics janë të pajisur me softuer inteligjent, regjistrim automatik të të dhënave, opsione të thjeshta paracaktimi për kontrollin e temperaturës, kohëzgjatjen e sonication, modalitetin e ciklit/pulsit si dhe me ndriçimin e mostrës dhe telekomandën e shfletuesit. Ne përpiqemi t'i bëjmë pajisjet tona ultrasonike sa më të zgjuara që të jetë e mundur, në mënyrë që rutina juaj e kërkimit dhe e punës të bëhet sa më e përshtatshme dhe e suksesshme.
Kliko këtu, për të gjetur më shumë aplikacione duke përfshirë protokollet e përgatitjes së mostrës tejzanor me VialTweeter!