Protokolli për Inaktivimin e Koronavirusit SARS-CoV-2 me Sonikim

Hielscher VialTweeter është një njësi unike ultrasonike për përgatitjen e shumë mostrave, e cila përdoret për të inaktivuar koronavirusin SARS-COV-2. VialTweeter lejon përgatitjen e deri në 10 shishe me mostra njëkohësisht dhe është kështu njësi ideale për përpunimin e mostrave në masë.

Inaktivimi i Koronavirusit SARS-CoV-2 me VialTweeter

Pas heqjes së fiksuesit, monoshtresat u larë tre herë me tretësirë fosfat-buffer (PBS) para se qelizat të hiqeshin në 1mL MEM/5% FBS dhe të sonikoheshin (3 × 10 sekonda ON, 10 sekonda OFF me 100% fuqi dhe amplitudë) duke përdorur procesorin ultrasonik Hielscher UP200St me VialTweeter si aksesor. Supernatantet u qartësuan duke centrifuguar në 3000 × g për 10 min. Lexoni protokollin e plotë më poshtë për inaktivimin e koronavirusit SARS-CoV-2 nga Welch et al. (2020):

Qelizat dhe Virusi

Qelizat Vero E6 (Vero C1008; ATCC CRL-1586) u kultivuan në medium minimal esencial të modifikuar të Eagle (MEM) të suplementuar me 10% (v/v) serum viçi fetal (FCS). Virusi i përdorur ishte stammi SARS-CoV-2 hCOV-19/England/2/2020, i izoluar nga PHE nga grupi i parë i pacientëve në Mbretërinë e Bashkuar më 29/01/2020. Ky virus u përftua në kalimin 1 dhe u përdor për studime inaktivimi në kalimin 2 ose 3.
Për reagentët dhe kimikatet e përdorura për inaktivimin e SARS-CoV-2 si dhe për heqjen e citotoksisitetit të reagentëve, ju lutem shikoni raportin shkencor të Welch et al. (2020).

Inaktivimi i virusit me detergjentë – Protokolli i inaktivimit të Koronavirusit SARS-CoV-2 nga Welch et al. 2020

Inaktivimi i SARS-CoV-2


Për produktet komerciale, preparatet virale (lëngu i kulturës së indeve, titra që variojnë nga 1 × 10⁶ deri në 1 × 10⁸ PFU/ml) u trajtuan në trefish me reagentë në përqendrime dhe për kohëzgjatje kontakti të rekomanduara në udhëzimet e përdorimit të prodhuesit, kur ishin të disponueshme, ose për përqendrime dhe kohëzgjatje të kërkuara specifikisht nga laboratorët e testimit. Kur prodhuesi dha një gamë përqendrimesh, u testua raporti më i ulët i produktit me mostrën (d.m.th. përqendrimi më i ulët i rekomanduar i produktit të testit). Reagentët e tubave të transportit të mostrave u testuan duke përdorur një raport të një vlere lëngu kulture inde me dhjetë vlera reagenti, përveç nëse raporti i vlerës së lëngut të mostrës me reagentin ishte specifikuar nga prodhuesi. Detergjentët, fiksuesit dhe tretësit u testuan në përqendrimet e treguara për kohëzgjatjet e treguara. Të gjitha hapat e inaktivimit u kryen në temperaturën e ambientit të dhomës (18 – 25°C). Për testimin e llojeve alternative të mostrave, virusi u shtua në matricën e mostrës së treguar në një raport 1:9, më pas u trajtua me reagentët e testit si më lart. Të gjitha eksperimentet përfshinin mostra kontrolli të trajtuara në trefish me një vlerë ekuivalente PBS në vend të reagentit të testit. Menjëherë pas kohëzgjatjes së kërkuar të kontaktit, 1mL e mostrës së trajtuar u përpunua duke përdorur matricën e filtrimit të përzgjedhur si duhet. Heqja e reagentëve për testimin e inaktivimit u krye në një format më të madh kolone spin duke përdorur Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns (Thermo Fisher), ose duke mbushur kolona centrifuge bosh Pierce me kapacitet 10mL (Thermo Fisher) me SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR ose Sephadex LH-20 për të dhënë 4mL rrëshirë/guaska të ngjeshura. Për pastrimin duke përdorur filtra Amicon, 2 × mostra 500μl u pastruan duke përdorur dy filtra centrifugalë me metodën e përshkruar më parë, më pas u bashkuan. Për heqjen e formaldehidit dhe formaldehidit me glutaraldehid, u përdor një filtr me 1× vlerë mostre 500μl, u riresuspendua pas përpunimit në 500μl PBS, dhe u shtua në 400ul MEM/5% FBS. Për inaktivimin e monoshtresave të infektuara, 12,5 cm² flaska me qeliza Vero E6 (2,5 × 10⁶ qeliza/flask në 2,5mL MEM/5% FBS) u infektuan në MOI 0,001 dhe u inkubuan në 37°C/5% CO₂ për 24 orë. Supernatanti u hoq, dhe qelizat u fiksuan duke përdorur 5mL formaldehid, ose formaldehid dhe glutaraldehid në temperaturën e dhomës për 15 ose 60 min. Fiksuesi u hoq, dhe monoshtresat u larë tre herë me PBS para se qelizat të hiqeshin në 1mL MEM/5% FBS dhe të sonikoheshin (3 × 10 sekonda ON, 10 sekonda OFF me 100% fuqi dhe amplitudë) duke përdorur një UP200St me aksesor VialTweeter (Hielscher Ultrasound Technology). Supernatantet u qartësuan duke centrifuguar në 3000 × g për 10 min.


Detajet e reagentit të përdorur për inaktivimin e koronavirusit SARS-CoV-2 me VialTweeter ultrasonik sipas protokollit të Welch et al. 2020

Protokolli i plotë duke përfshirë përdorimin e Hielscher VialTweeter mund të gjendet këtu:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Dismembratorë dhe Shkatërrues Qelizorë Ultrasonikë të Avancuar

Ultrasonikatori me shumë mostra VialTweeter është vetëm një nga shumë zgjidhjet ultrasonike për përgatitjen e mostrave në laboratorët biologjikë, biokimikë dhe klinikë. Hielscher Ultrasonics ofron dismembratorin ideal ultrasonik për aplikimin tuaj, p.sh. lizën qelizore, ekstraktimin e qelizave, homogjenizimin e indeve, solubilizimin e lizatit, tretjen, degazimin e mostrave etj.
Na tregoni sa mostra keni për të përpunuar në orë dhe ditë, nëse preferoni sonikim të drejtpërdrejtë ose të tërthortë dhe cili është qëllimi i trajtimit ultrasonik të mostrës. Ne do t’ju rekomandojmë njësinë më të përshtatshme ultrasonike për rutinën tuaj të punës së përditshme!
Procesorët digitalë ultrasonikë të Hielscher Ultrasonics janë të pajisur me softuer inteligjent, regjistrim automatik të të dhënave, opsione të lehta para-vendosjeje për kontrollin e temperaturës, kohëzgjatjen e sonikimit, ciklin/modin e pulsit si dhe ndriçimin e mostrës dhe kontrollin e largët nga browseri. Ne përpiqemi t’i bëjmë pajisjet tona ultrasonike sa më inteligjente që të jetë e mundur në mënyrë që rutina juaj e kërkimit dhe punës të bëhet sa më e përshtatshme dhe e suksesshme që të jetë e mundur.
Klikoni këtu, për të gjetur më shumë aplikime duke përfshirë protokollet e përgatitjes së mostrave ultrasonike me VialTweeter!