Prerja me ultratinguj e ADN-së

Gjatë prerjes së ADN-së dhe ARN-së, molekulat e gjata të ADN-së fragmentohen në copa më të vogla, një hap vendimtar në përgatitjen e mostrave për ndërtimin e bibliotekës së sekuencës së gjeneratës së ardhshme (NGS). Prerja tejzanor e ADN-së përdor forcat e kavitacionit akustik për të thyer ADN-në ose ARN-në në fragmente që variojnë nga 100 bp deri në 5 kb. Kjo metodë mundëson kontroll të saktë mbi madhësinë e fragmentit, duke lehtësuar përshtatjen në gjatësinë e dëshiruar të ADN-së për rezultate optimale të renditjes.

Prerja e ADN-së duke përdorur ultratinguj

Hielscher Ultrasonics ofron zgjidhje të ndryshme të bazuara në ultratinguj për prerjen e ADN-së, ARN-së dhe kromatinës. Zgjidhni midis një ultrasonikatori të tipit sondë (p.sh. UP100H) për sonikacion të drejtpërdrejtë duke përdorur një mikrotip, ose përdorni VialTweeeter ose kupë tejzanor për përgatitjen e tërthortë të ADN-së të mostrave të ndryshme njëkohësisht. Hielscher ofron pajisjen ideale duke marrë parasysh nevojat tuaja: nëse keni 1 ose deri në 10 mostra, vëllime nga mikrolitra në vëllime litra – Sonikatorët Hielscher do të plotësojnë kërkesat tuaja për të përgatitur fragmente të ADN-së, ARN-së dhe kromatinës në gjatësinë e duhur. Riprodhueshmëria, funksionimi i lehtë dhe kontrolli i saktë lejojnë një bibliotekë të besueshme për renditjen e gjeneratës së ardhshme.
Në kontrast me fragmentimin enzimatik të ADN-së, prerja tejzanor zbaton forca të pastra mekanike të prerjes pa shtuar asnjë kimikat. Me vendosjen e saktë të parametrave të procesit, prerja tejzanor prodhon fragmente të ADN-së me peshë të lartë molekulare (ADN plazmide dhe gjenomike).
Acidet nukleike të pastruara mund të përforcohen para ose pas një hapi të fragmentimit.
Parametrat e zërit (fuqia, cikli i pulsit / shpërthimet, koha dhe temperatura) mund të kontrollohen në mënyrë të sigurt nëpërmjet cilësimeve të softuerit.

Protokollet për prerjen me ultratinguj të ADN-së

Për analizën e imunoprecipitimit të kromatinës

Shkurtimisht, qelizat u vendosën në enë me diametër 60 mm (400,000 për pjatë) dhe u transfektuan me RhoA siRNA (siç përshkruhet); pas 72 orësh, ato u inkubuan me formaldehid (përqendrimi përfundimtar, 1%) për 10 minuta në 37°C për të lidhur proteinat me ADN-në. Reaksioni i ndërlidhjes u shua me shtimin e një të dhjetës së vëllimit të 1.25 mol/L glicine, duke dhënë përqendrim përfundimtar 125 mmol/L. Qelizat u lanë dy herë me PBS të ftohtë në akull, u risuspenduan në tampon të analizës së radioimunoprecipitimit [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% deoksikolat, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl0 (p )] që përmban 1 mmol/L fluorid fenilmetilsulfonil, 1 Ag/mL aprotininë dhe 1 Ag/mL pepstatinë A, dhe mbahet në akull për 30 min. Më pas, lizatet e qelizave u sonikuan në akull me a Hielscher UP200S sonikator me ultratinguj (3 x 40 s, amplituda 40%, cikli 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) derisa kromatinat e ndërlidhura u prenë për të dhënë fragmente të ADN-së midis 200 dhe 1000 bp. Një e dhjeta e lizatit të plotë u përdor për të përcaktuar sasinë e sasisë së ADN-së të pranishme në mostra të ndryshme dhe u konsiderua si “ADN totale hyrëse”. Supernatantët u inkubuan me slurry të ADN-së së spermës së salmonit/proteinës agarozë-50% për të reduktuar sfondin jospecifik. Më pas u bë imunoprecipitimi gjatë natës në 4°C me 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) ose pa antitrup (kontroll negativ). Këta supernatantë u plotësuan me 5 mol/L NaCl dhe u ngrohën gjatë natës në 65°C për të rikthyer lidhjet e kryqëzuara protein-ADN. Komplekset imunokomplekse u trajtuan më tej me proteinazë K pa DNazë dhe RNazë, dhe ADN-ja u pastrua me ekstraktim fenol/kloroform dhe precipitim me etanol. PCR u bë me primerë specifikë që korrespondojnë me një sekuencë brenda rajonit promotor të gjenit human iNOS (primer p1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; primer p2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Studimet e shprehjes EGFP

Për studimet e shprehjes, soji rekombinant L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Gjermani) me gjenin për EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), ssu kromozomale të integruar, u kultivua në media të ndryshme siç përshkruhet më parë dhe plotësohet gjithashtu me 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Gjermani). Gjatë kultivimit janë marrë kampione 1 ml, janë centrifuguar (2000 × g, 20°C, 10 min) dhe janë larë me tretësirë NaCl 0,9%. Peleti u risuspendua në tampon (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) dhe u shpërbë nga sonifikimi me procesorin tejzanor UP400S (aplikimi i energjisë ~ 400 Ws). Mbetjet qelizore u hoqën me centrifugim (6000 × g, 4°C, 5 min) dhe u analizuan me elektroforezë me xhel dodecil sulfat natriumi - poliakrilamid (SDS-PAGE) në kushte reduktuese sipas metodës së Laemmli (1970) me xhel poliakralamid 12,5%. . Shprehja e EGFP u ekzaminua në kulturën e trazuar. (Fritsche et al. 2007)

imunoprecipitimi i kromatinës

Analiza e imunoprecipitimit të kromatinës u krye duke përdorur ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) sipas udhëzimeve të prodhuesit me disa modifikime. Shkurtimisht, podocitet e diferencuara njerëzore u lidhën me 1% formaldehid për 10 minuta në temperaturën e dhomës. Qelizat u lanë me PBS të ftohtë në akull dhe reaksioni i fiksimit u ndal duke shtuar 0.125 M glicinë për 5 minuta në temperaturën e dhomës. Qelizat u lanë përsëri me PBS të ftohtë në akull dhe u fshinë nga ena. Qelizat u pelletuan me centrifugim dhe u risuspenduan në buferin e lizës. Pas centrifugimit, bërthamat e peletuara u risuspenduan në tampon prerës, u inkubuan në akull për 30 minuta dhe kromatina u qeth me sonikacion, p.sh. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Gjermani) me fuqi 25% 5 impulse nga 20 sekonda secila në akull në fragmente prej përafërsisht 200-600 bp. Kromatina e prerë më pas u centrifugua dhe supernatanti u mblodh. Për imunoprecipitimet, 60 μl kromatinë u inkubuan me 1 μg Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Kembrixh, MB) ose NF-κB p50 (Abcam) antitrupa ose me IgG (Zymed Laboratories), si një kontroll negativ, gjatë natës në 4°C me rrotullim të butë. Komplekset imunokomplekse të lidhura me rruaza magnetike u mblodhën duke përdorur një stendë magnetike, u lanë gjerësisht dhe lidhjet e kryqëzuara të proteinave/ADN-së u kthyen dhe ADN-ja u eluat për analizë PCR në kohë reale. (Ristola et al. 2009)

Përgatitja e ADN-së EHEC për analizën e grupit të çipave

Rregullimi i lizave të qelizave dhe ADN-ve të nxjerra
Peletat bakteriale të pezulluara në PBS në përqendrimin përfundimtar të dëshiruar u trajtuan me ndërprerës i ultrazërit UP100H (Hielscher GmbH, Gjermani) e pajisur me një mikromajë MS1 (1 mm në diametër). Frekuenca e funksionimit ishte 30 kHz dhe fuqia efektive e daljes ishte 100 W. Gjatë operacionit, mostrat u ftohën në një banjë me ujë akulli, u përzien dhe u centrifuguan. Mostrat u përdorën për studime të citometrisë së rrjedhës, ndërsa për trajtim të mëvonshëm, mostrat iu nënshtruan një trajtimi termik (95°C, 5 min). Lizatat e papërpunuara të qelizave u përpunuan me një përzierje fenoli: kloroform: alkooli izoamil (25:24:1). Një vëllim i barabartë i kësaj përzierjeje iu shtua kampionit të lizatit, tretësira u rrotullua fuqishëm për 15 s dhe u centrifugua në 15,000 xg për 2 minuta në temperaturën e dhomës (RT) rreth 22°C. Faza e sipërme ujore që përmban ADN-në gjenomike u nda me kujdes dhe u mblodh në një tub të ri steril Eppendorf.
Më pas, mostrat u sonikuan për të fragmentuar ADN-në. Hapi i sonikacionit u realizua në të njëjtat kushte siç përshkruhet më sipër. Për të vlerësuar efektet e fragmentimit në ADN-në gjenomike, mostrat u analizuan duke përdorur elektroforezë me xhel agarozë.
(…) Mostrat e sonikuara më parë për 2.5 min iu nënshtruan një hapi ekstraktimi pas trajtimit termik dhe centrifugimit. ADN-ja e lëshuar u nxor dy herë me një përzierje fenol: kloroform: alkool izoamil, dhe më pas iu nënshtrua sonikimit të dytë për 0 - 15 min. Elektroforeza e xhelit të agarozës u përdor për të përcaktuar shpërndarjen e madhësisë së ADN-së që i nënshtrohet fragmentimit tejzanor pas nxjerrjes (Fig. në anën e sipërme djathtas). ADN-ja shumë e fragmentuar ishte e dukshme nga prania e një njollosje të ADN-së dhe jo nga brezat me peshë të lartë molekulare që u eliminuan nga mostrat e sonikuara për 2.5 minuta ose më gjatë. Sonicizimi më i gjatë zvogëloi gradualisht gjatësinë e fragmenteve në afërsisht 150 - 600 bp, dhe sonikimi për 15 minuta i degradoi më tej këto fragmente, siç mund të shihet kryesisht nga pjesa e sipërme e njollosjes. Kështu, madhësia mesatare e fragmentit të ADN-së u zvogëlua gradualisht me kohën e ultrazërit dhe trajtimi 5 min lejoi të merrte madhësitë e fragmenteve të ADN-së më të përshtatshme për analizat e grupit të çipave. Më në fund, u krijua procedura e përgatitjes së analitit të ADN-së që përfshin 2 minutat e para të trajtimit me ultratinguj, nxjerrjen e ADN-së (2×) dhe sonikimin pasues 5 minutash. (Basselet et al. 2008)

Imunoprecipitimi i kromatinës (ChIP)

Qelizat HEK293 u kulturuan siç përshkruhet më sipër dhe u fiksuan me 2 mM disuccinimidyl-glutarate për 45 minuta në temperaturën e dhomës. Më pas, qelizat u lanë dy herë me PBS. Kromatina u lidh për 10 minuta në temperaturën e dhomës duke përdorur 1% (v/v) formaldehid dhe u la dy herë me PBS të ftohtë në akull. Reaksioni i ndërlidhjes u ndal me inkubimin me glicinë në një përqendrim përfundimtar prej 0.125 M për 5 minuta në temperaturën e dhomës. Pas inkubimit me tripsinë, qelizat u gërvishtën nga ena e kulturës së qelizave dhe u lanë dy herë me PBS. Peleti i qelizave u risuspendua në tampon lize (tuba 5 mM, pH 8.0, 85 mM KCl dhe 0.5% (v/v) Nonidet P-40), u inkubua në akull për 10 min dhe u homogjenizua me një homogjenizues Dounce. Më pas, bërthamat u grumbulluan me centrifugim (3500 xg, 5 min, 4 °C) dhe u risuspenduan në tampon bërthamash (50 mM Tris-HCl, pH 8.1, 10 mM EDTA dhe 1% (w/v) SDS). Bërthamat u ndërprenë nga sonication me tre pulses 20-s në a Sonicator UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) në një vendosje të ciklit 0,5 dhe amplitudë 30%, duke nxjerrë fragmente të ADN-së gjenomike me një madhësi të madhe prej 200 – 1000 bp. Për ChIP, 50 g ADN u hollua 4 herë në tampon imunoprecipitimi (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 dhe 0,01% (w/w v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Analiza e modifikimit të histonit nga imunoprecipitimi i kromatinës (ChIP)

Shkurtimisht, 6 x 10⁶ qelizat u lanë dy herë me PBS dhe u lidhën në pllakën e kulturës për 15 minuta në temperaturën e dhomës në prani të formaldehidit 0.5%. Reaksioni i ndërlidhjes u ndal duke shtuar 0,125 M glicinë. Të gjitha hapat e mëpasshëm u kryen në 48°C. Të gjithë tamponët ishin të ftohur paraprakisht dhe përmbanin frenues të proteazës (Complete Mini, Roche). Qelizat u lanë dy herë me PBS dhe më pas u kruan. Peletat e mbledhura u tretën në 1 ml tampon lize (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) dhe u sonikuan në një banjë të ftohtë etanoli për 10 cikle në amplitudë 100% duke përdorur një Sonicator UP50H (Hielscher, Teltow, Gjermani). Fragmentimi i kromatinës u vizualizua në xhel agarozë 1%. Fragmentet e marra ishin në intervalin 200-500 pb. Kromatina e tretshme u përftua duke centrifuguar mostrat e sonikuara në 14,000 g për 10 minuta në 48 ° C. Fraksioni i tretshëm u hollua 1/10 në tampon hollimi (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) më pas u nda dhe u ruajt në 80°C deri në përdorim. (Rodriguez et al. 2008)