Teknologjia e ultrazërit Hielscher

Ultrasonik DNA prerje

  • Gjatë thyerjes së ADN-së dhe ARN-së, molekulat e ADN-së ndahen në pjesë të vogla. Fragmentimi i ADN-së / ARN-së është një nga hapat e rëndësishëm të përgatitjes së modelit që kërkohen për krijimin e bibliotekave për sekuencimin e gjeneratës së ardhshme (NGS).
  • Krasitja tejzanor e ADN-së përdor forcat e cavitation akustike për të thyer ADN-në ose ARN në pjesë prej 100 – 5kb bp.
  • Krasitja tejzanor lejon për fragmentimin e saktë të ADN-së dhe përshtatjen me gjatësinë e dëshiruar të ADN-së.

Ultrasonik DNA prerje

Hielscher Ultrasonics ofron zgjidhje të bazuara në ultratinguj për ADN-në, ARN dhe prerjen e kromatinës. Zgjidhni midis një ultrasonicators tipit të hetimit (p.sh. UP100H) për sonication direkte duke përdorur një microtip, ose përdorni VialTweeeter ose cuphorn tejzanor për përgatitjen indirekte të ADN të mostrave të ndryshme në të njëjtën kohë. Hielscher ofron pajisjen ideale duke pasur parasysh nevojat tuaja: a keni 1 ose deri në 10 mostra, vëllime nga mikrolitri në litra vëllime – Hielscher përpunuesit tejzanor janë në dispozicion për të përmbushur kërkesat tuaja për të përgatitur ADN, ARN dhe fragmente të kromatit në gjatësinë e duhur. Riprodhueshmëria, funksionimi i lehtë dhe kontrolli i saktë lejojnë një bibliotekë të besueshme për sekuencimin e gjeneratës së ardhshme.
Në kontrast me fragmentimin enzimatik të ADN-së, prerja tejzanor zbaton forca të pastër mekanike qethëse pa shtuar asnjë kimikate. Me përcaktimin e saktë të parametrave të procesit, prerja tejzanor prodhon fragmente ADN të peshës molekulare të lartë (plasmid dhe ADN gjenomike).
Acidet nukleike të pastruara mund të amplifikohen para ose pas një hapi fragmentimi.
Parametrat e zërit (fuqia, cikli i pulsit / shpërthimet, koha dhe temperatura) mund të kontrollohen në mënyrë të sigurtë nëpërmjet cilësimeve të softuerit.

Përparësitë:

  • kontroll të saktë
  • ciklet e sonikimit dhe koha saktësisht e adaptueshme ndaj madhësisë së dëshiruar të ADN-së
  • fragmente DNA të peshës molekulare të lartë
  • kontrollin e temperaturës
  • shpejt
  • Rezultatet e riprodhueshme
  • Autoclavable
  • zgjidhje të ndryshme: Probe-type, VialTweeter dhe Cuphorn

Protokollet për krismat e tejzanor të ADN-së

Për testin e imunoprotektorëve të kromatit

Shkurtimisht, qelizat u vendosën në enët me diameter 60mm (400,000 për gjellë) dhe transfektuan me RCAA siRNA (siç përshkruhet); pas 72 h, ata u inkubuan me formaldehid (përqendrimi final, 1%) për 10 min në 37 ° C për të lidhur lidhjen e proteinave me ADN. Reaksioni ndërlidhës u shua me shtimin e një vëllimi të një të dhjetëshe prej 1,25 mol / L glicine, duke dhënë 125 mmol / L koncentrim final. Qelizat u lanë dy herë me PBS me akull të ftohtë, resuspenduan në tampon testimi radioimunoprecipitimi [150 mmol / L NaCl, 1% NP40, deoxycholate 0,5%, SDS 0,1%, 5 mmol / L EDTA, 50 mmol / L Tris-HCl )] që përmban 1 mmol / L fenilmetilsulfonil fluorid, 1 Ag / mL aprotinin dhe 1 Ag / mL pepstatin A dhe mbahen në akull për 30 min. Pastaj, lysates qelizore u sonicated në akull me një Hielscher UP200S ultrasound sonicator (3 x 40 s, 40% amplitudë, cikli 1, Hielscher Ultrasonics GmbH) derisa kromatikët e ndërlidhur ishin prerë për të dhënë fragmente të ADN në mes të 200 dhe 1000 bp. Një e dhjeta e lizës së tërë u përdor për të përcaktuar sasinë e ADN-së që është e pranishme në mostra të ndryshme dhe konsiderohet si “ADN-ja totale e hyrjes”. Supernatantët u inkubuan me spermatozoid salmon ADN / proteina agaroze-50% slurry për të reduktuar sfond jo-specifik. Imunoprecipita është bërë pastaj brenda natës në 4 ° C me 5 Ag të anti-NF-nB p65 (Upstate) ose pa antitrup (kontroll negativ). Këto supernatante u plotësuan me 5 mol / L NaCl dhe u nxehën brenda natës në 65 ° C për të rikthyer ndërlidhjet proteina-ADN. Imunokomplekset u trajtuan më tej me proteinazën K të lirë të DNase dhe RNase dhe ADN u pastrua me nxjerrjen fenol / kloroform dhe reshjet etanol. PCR është bërë me primer specifike që korrespondojnë me një sekuencë brenda rajonit të promotorit të gjenit iNOS të njeriut (p1 primer: 5¶-GAGGGCTTTCCCA-GAACCAAG-3¶; primer p2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Studime të shprehjes së EGFP

Për studime të shprehjes, varietet rekombinant L. tarentolae p10 :: F9Begfp1.4dBsat # 12 (Jena Bioscience, Gjermani) me gjenin për EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), integruar kromozomale ssu, u kultivua në mediat e ndryshme siç përshkruhet më parë dhe plotësuar plotesisht me 100 mg l-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Gjermani). Gjatë kultivimit, u morën mostra 1 ml, centrifugohen (2000 × g, 20 ° C, 10 min) dhe larë me 0.9% NaCl zgjidhje. Pelleti u resuspendua në tampon (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) dhe u shpërbë nga sonifikimi me procesorin tejzanor UP400S (aplikimi i energjisë ~ 400 Ws). Mbetjet e qelizave u pastruan me centrifugim (6000 × g, 4 ° C, 5 min) dhe analizoheshin me elektroforezën e xeholit të dodecil sulfatit - poliakrilamid (SDS-PAGE) sipas kushteve reduktuese sipas metodës së Laemmli (1970) me 12.5% të geleve polyacralamide . Shprehja e EGFP u ekzaminua në kulturën e agjituar. (Fritsche et al. 2007)

Hielscher's UP100H was used to prepare EHEC DNA for chip array analysis

Analizat elektroforetike të ADN gjenomike të E. coli EDL933 nënshtruar ultrasonication 0-15 min. L tregon shkallën e ADN-së. (Basselet et al., 2008)

Kërkesë informacioni





Implantacioni i kromatit

Disruptor qelizor tejzanor UP100H (100W) për lizë, përçarje qelizash dhe prerje të ADN-së.Analiza e imunoprecipitimit të kromatit u krye duke përdorur ChIP-ITTM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) sipas udhëzimeve të prodhuesit me disa modifikime. Shkurtimisht, podocitet njerëzor të diferencuar u ndërlidhën me 1% formaldehid për 10 minuta në temperaturën e dhomës. Qelizat u lanë me PBS me akull të ftohtë dhe reagimi i fiksimit u ndal duke shtuar 0,125 M glicin për 5 minuta në temperaturën e dhomës. Qelizat u lanë përsëri me PBS me akull të ftohtë dhe u skrapuan nga pjatat. Qelizat u mbushën me centrifugim dhe resuspenduan në tampon lizës. Pas centrifugimit, bërthamat e ngopura u ri-suspenduan në tampon shearing, u inkubuan në akull për 30 min dhe kromatin u pastrua me sonication, p.sh. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Gjermani) me fuqi 25% 5 pulses prej 20 sec secili në akull në fragmente prej rreth 200-600 bp. Kromatin e prerë pastaj u centrifugua dhe supernatanti u mblodh. Për immunoprecipitations, 60 μl kromatin u inkubuar me 1 μg të antitrupave Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, SHBA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) ose NF-κB p50 (Abcam) ose me lepuri IgG (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, SHBA), si një kontroll negativ, brenda natës në 4 ° C me rotacion të butë. Imunokomplekset e lidhura me rruaza magnetike u mblodhën duke përdorur një qëndrim magnetik, të larë gjerësisht dhe ndërthurjet e proteinave / ADN-së u anuluan dhe ADN-ja u përzgjodh për analizë PCR në kohë reale. (Ristola et al. 2009)

Përgatitja e ADN EHEC për analizën e array chip

Aranzhimi i lysates qelizore dhe ADN-të e nxjerra
Fletët bakteriale të suspenduara në PBS deri në përqendrimin final të dëshiruar janë trajtuar me ultratingues UP100H (Hielscher GmbH, Gjermani) e pajisur me një mikrotip MS1 (1mm në diametër). Frekuenca e funksionimit ishte 30 kHz dhe fuqia efektive e prodhimit ishte 100 W. Gjatë operacionit, mostrat u ftoheshin në një banjë me ujë të akullt, të përzier dhe centrifuguar. Mostrat u përdorën për studimet e citometrisë së rrjedhës, ndërsa për trajtimin e mëvonshëm, mostrat iu nënshtruan një trajtimi të ngrohjes (95 ° C, 5 min). Lysatet e qelizave të papërpunuara janë përpunuar me një përzierje të fenol: kloroform: izoamil (25: 24: 1). Një volum i barabartë i kësaj përzierjeje u shtua në mostrën e lizatit, zgjidhja u vorteksua fuqishëm për 15 s dhe centrifugoi në 15,000 xg për 2 minuta në temperaturën e dhomës (RT) rreth 22 ° C. Faza më e lartë ujore që përmban ADN gjenomike u nda me kujdes dhe u mblodh në një tub të ri steril Eppendorf.
Më pas, mostrat u sonicated për të fragmentuar ADN. Hapi i sonifikimit u realizua në të njëjtat kushte siç u përshkrua më sipër. Për të vlerësuar efektet e fragmentimit në ADN gjenomike, mostrat janë analizuar duke përdorur elektroforezën e agarozës së xhelit.
(…) Mostrat sonicated më parë për 2,5 min u nënshtruan një hap të nxjerrjes pas trajtimit të ngrohjes dhe centrifugimit. ADN-ja u lirua dy herë me një fenol: kloroform: përzierje me alkool isoamil, dhe më pas u nënshtrua sonikimit të dytë për 0-15 min. Elektroforeza me agarose gel është përdorur për të përcaktuar shpërndarjen e madhësisë së ADN-së që i nënshtrohet fragmentimit tejzanor pas heqjes (Fig. Në anën e djathtë). ADN-ja shumë e fragmentuar ishte e dukshme nga prezenca e njollosjes së ADN-së në vend të bandave me peshë molekulare të lartë që u eliminuan nga mostrat e zërit për 2,5 minuta ose më shumë. Sonication gjatë shkurtuar gradualisht gjatesite fragment deri në rreth 150 - 600 bp, dhe sonication për 15 min degraduar më tej këto fragmente, siç mund të shihet kryesisht nga pjesa e sipërme e smear. Kështu, madhësia mesatare e fragmentit të ADN-së gradualisht u zvogëlua me kohën e ultrasonizimit dhe trajtimi 5 min i lejuar për të marrë përmasat e fragmenteve të ADN-së më të përshtatshme për analizat e array chip. Më në fund, u krijua procedura e përgatitjes së analizës së ADN-së, që përbëhej nga 2 min trajtimi tejzanor, nxjerrja e ADN-së (2 ×), dhe sonikimi i mëvonshëm 5 min. (Basselet et al., 2008)

Impiant i imunitetit të kromatinës (ChIP)

Procesor tejzanor UP100H për ADN, RNA dhe prerjen e kromatit. (Kliko per te zmadhuar!)HEK293 qelizat u kultivuan siç përshkruhet më sipër dhe fiksohet me 2 mM disukcinimidil-glutarat për 45 minuta në temperaturën e dhomës. Më pas, qelizat u lahen dy herë me PBS. Kromatin u kryqëzua për 10 minuta në temperaturën e dhomës duke përdorur formaldehid 1% (v / v) dhe larë dy herë me PBS me akull të ftohtë. Reaksioni ndërlidhës u ndalua me inkubacion me glicinë në një përqendrim final prej 0.125 M për 5 minuta në temperaturën e dhomës. Pas inkubacionit me trysinë, qelizat u kapën nga pjata e kultivës qelizore dhe u lanë dy herë me PBS. Pellgu qelizor u resuspendua në tampon lizi (tuba 5 mM, pH 8,0, 85 mM KCl dhe 0,5% (v / v) Nonidet P-40), inkubohej në akull për 10 min dhe u homogjenizohej me një homogjenizues Dounce. Më pas, bërthama u pelletoi me centrifugim (3500 xg, 5 min, 4 ° C) dhe resuspendohej në buffer nuclei (50 mM Tris-HCl, pH 8.1, 10 mM EDTA dhe SDS 1% (w / v). Bërthamat u ndërprenë nga sonication me tre pulses 20-të në një UP50H sonicator (Hielscher Ultraschall Technologie) në një mjedis të ciklit 0.5 dhe amplitudë 30%, duke krijuar fragmentet gjenomike të ADN me një madhësi të madhe prej 200 - 1000 bp. Për ChIP, 50 g ADN u holluar 4 herë në tampon immunoprecipitation (16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1, 167 mM NaCl, 1.2 mM EDTA, 1.1% (v / v) Triton X-100 dhe 0.01% (w / v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Analiza e modifikimit të histonit nga imunoprecipitat e kromatit (ChIP)

Shkurtimisht, 6 x 106 qelizat u lanë dy herë me PBS dhe u kryqëzuan në pllakën e kulturës për 15 minuta në temperaturë dhome në praninë e 0.5% formaldehid. Reaksioni ndërlidhës u ndal duke shtuar 0.125 M glicin. Të gjitha hapat e mëpasshëm janë kryer në 48 ° C. Të gjitha buffers ishin para-ftohur dhe përmban frenuesit protease (Complete Mini, Roche). Qelizat u lanë dy herë me PBS dhe pastaj u skrapuan. Pellet e mbledhura u tretën në 1 ml lysis buffer (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) dhe u sonicated në një banjë të ftohtë etanoli për 10 cikle në 100% amplitudë duke përdorur një UP50H sonicator (Hielscher, Teltow, Gjermani). Fragmentimi i kromatit u vizualizua në xhel 1% të agarozës. Fragmentet e fituara ishin në rangun 200-500pb. Kromati i tretshëm është marrë duke centrifuguar mostrat e zërit në 14,000 g për 10 min në 48 ° C. Pjesa e tretshme u hollua 1/10 në tampon hollimi (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) pastaj alikotoheshin dhe ruheshin në 80 ° C deri në përdorim. (Rodriguez et al. 2008)

pajisje Fuqia [W] lloj Sasia [ml]
VialTweeter 200 vete 0.5 1.5
UP50H 50 dore apo të montuar 00,01 250
UP100H 100 dore apo të montuar 00,01 500
UP200Ht 200 dore apo të montuar 0.1 1000
UP200St 200 standmounted 0.1 1000
UP400St 400 standmounted 5.0 2000
Cuphorn 200 CupHorn, sonoreaktor 10 200
GDmini2 200 qelizë rrjedhin ndotje-free

Kërkesë informacioni





Hielscher's VialTweeter is is´deal for the simultaneous preparation of multiple samples

VialTweeter për preparat tejzanor

Na kontaktoni! / Pyet Na!

Pyesni për më shumë informacion

Ju lutemi përdorni formularin e mëposhtëm, nëse dëshironi të kërkoni informacione shtesë rreth homogjenizimit tejzanor. Ne do të jemi të lumtur t'ju ofrojmë një sistem tejzanor që plotëson kërkesat tuaja.









Ju lutem vini re tonë Politika e privatësisë.


Letërsi / Referencat

  • Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): Përpunimi i mostrës për analizën e ADN-së të chipit të bazuar në Escherichia coli enterohemorrhagic (EHEC). Fabrikat e qelizave mikrobike 7:29. 2008.
  • Doublier S., Riganti Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA Heshtja Reverton rezistencën ndaj Doxorubicin në qelizat e kancerit të zorrës së trashë të njeriut. Hulumtimi i kancerit molekular 6 (10), 2008.
  • Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid NHH, Simonsson M. (2008): Vlerësimi i metodës së ekstraktimit të Fusarium DNA nga mycelia dhe gruri për përcaktimin e sasisë së PCR në kohë reale dhe korrelacion me nivelet e mikotoksinës . Gazeta e Metodave Mikrobiologjike 2008.
  • Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Karakterizimi i sjelljes së rritjes së Leishmania tarentolae - një sistem i ri shprehjeje për proteinat rekombinante. Gazeta e Mikrobiologjisë Bazë 47, 2007. 384-393.
  • Ristola M., Arpiainen S., Saleem MA, Mathieson PW, GI, Welsh, Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Rregullimi i gjenit Neph3 në podocitet - rolet kryesore të faktorëve të transkriptimit NF-κB dhe Sp1. BMC Biology Molecular 10:83, 2009.
  • Rodriguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Munoz M., Vendrell E., Peinado MA (2008): Ndjekja gjinore e ADN-së të pashlyeruar Alu përsërit në qelizat normale dhe të kancerit. Nucleic Acids Research Vol. 36, Nr. 3, 2008. 770-784.
  • Weiske J. Huber O. (2006): Histidine Triad Protein Hint1 nxit Apoptosis pavarur nga aktiviteti i saj enzimatik. Gazeta e kimisë biologjike. Vol. 281, Nr. 37, 2006. 27356-27366.


Fakte të vlefshme

Cavitation tejzanor / akustike krijon forca shumë intensive që promovon proceset e kristalizimit dhe të reshjeve (Kliko për ta zmadhuar!)

Krasitja tejzanor e ADN bazohet në cavitation akustike dhe forcat e saj të qethjes hidrodinamike