Fragmentimi i ADN-së me ultratinguj

Gjatë fragmentimit të ADN-së dhe ARN-së, molekulat e gjata të ADN-së ndahen në pjesë më të vogla, një hap thelbësor në përgatitjen e mostrave për ndërtimin e bibliotekave për sekuencimin e gjeneratës së ardhshme (NGS). Fragmentimi i ADN-së me ultratinguj shfrytëzon forcat e kavitacionit akustik për ta ndarë ADN-në ose ARN-në në fragmente që variojnë nga 100 bp deri në 5 kb. Kjo metodë mundëson kontroll të saktë mbi madhësinë e fragmenteve, duke lehtësuar përshtatjen me gjatësinë e dëshiruar të ADN-së për rezultate optimale të sekuencimit.

Fragmentimi i ADN-së duke përdorur trajtimin me ultratinguj

Hielscher Ultrasonics ofron zgjidhje të ndryshme të bazuara në ultratinguj për fragmentimin e ADN-së, ARN-së dhe kromatinës. Zgjidhni një sonikator me sondë (p.sh. UP100H) për sonikim të drejtpërdrejtë duke përdorur një mikro-majë, ose përdorni VialTweeeter ose kupën ultrasonike për përgatitjen e tërthortë të ADN-së së disa mostrave njëkohësisht. Hielscher ofron pajisjen ideale duke marrë parasysh nevojat tuaja: pavarësisht nëse keni 1 ose deri në 10 mostra, me vëllime nga mikrolitra deri në litra – sonikatorët Hielscher do t’i përmbushin kërkesat tuaja për të përgatitur fragmente të ADN-së, ARN-së dhe kromatinës me gjatësinë e duhur. Riprodhueshmëria, përdorimi i lehtë dhe kontrolli i saktë mundësojnë një bibliotekë të besueshme për sekuencimin e gjeneratës së ardhshme.
Në dallim nga fragmentimi enzimatik i ADN-së, fragmentimi me ultratinguj zbaton forca prerëse thjesht mekanike pa shtuar asnjë substancë kimike. Përmes përcaktimit të saktë të parametrave të procesit, fragmentimi me ultratinguj prodhon fragmente të ADN-së me peshë të lartë molekulare (ADN plazmidike dhe gjenomike).
Acidet nukleike të pastruara mund të amplifikohen përpara ose pas një hapi fragmentimi.
Parametrat e sonikimit (fuqia, cikli i impulseve / seritë e impulseve, koha dhe temperatura) mund të kontrollohen në mënyrë të sigurt përmes cilësimeve të softuerit.

Protokolle për fragmentimin e ADN-së me ultratinguj

Për analizën e imunoprecipitimit të kromatinës

Shkurtimisht, qelizat u mbollën në pjata me diametër 60mm (400 000 për pjatë) dhe u transfektuan me siRNA të RhoA (siç përshkruhet); pas 72 h, ato u inkubuan me formaldehid (përqendrimi përfundimtar, 1%) për 10 min në 37°C për të krijuar lidhje të kryqëzuara midis proteinave dhe ADN-së. Reaksioni i lidhjes së kryqëzuar u ndërpre duke shtuar një të dhjetën e vëllimit glicinë 1,25 mol/L, duke dhënë një përqendrim përfundimtar prej 125 mmol/L. Qelizat u lanë dy herë me PBS të ftohtë si akulli, u risuspenduan në tamponin e analizës së radioimunoprecipitimit [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% deoksikolat, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)] që përmbante 1 mmol/L fluorur fenilmetilsulfonili, 1 Ag/mL aprotininë dhe 1 Ag/mL pepstatinë A, dhe u mbajtën në akull për 30 min. Më pas, lizatet qelizore u sonikuan në akull me një Hielscher UP200S , sonikator ultrasonik (3 x 40 s, amplitudë 40%, cikël 1; Hielscher Ultrasonics GmbH), derisa kromatinat me lidhje të kryqëzuara u fragmentuan për të përftuar fragmente të ADN-së midis 200 dhe 1 000 bp. Një e dhjeta e lizatit të plotë u përdor për të përcaktuar sasinë e ADN-së së pranishme në mostra të ndryshme dhe u konsiderua si “ADN-ja totale hyrëse”. Supernatantët u inkubuan me një suspension 50% të ADN-së së spermës së salmonit/agarozës proteinike për të zvogëluar sfondin jospecifik. Më pas, imunoprecipitimi u krye gjatë natës në 4°C me 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) ose pa antitrup (kontroll negativ). Këtyre supernatantëve iu shtua NaCl 5 mol/L dhe u ngrohën gjatë natës në 65°C për të zhbërë lidhjet e kryqëzuara proteinë–ADN. Imunokomplekset u trajtuan më tej me proteinazë K pa DNazë dhe RNazë, dhe ADN-ja u pastrua me ekstraktim me fenol/kloroform dhe precipitim me etanol. PCR-ja u krye me prajmerë specifikë që korrespondonin me një sekuencë brenda rajonit promotor të gjenit njerëzor iNOS (prajmeri p1: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; prajmeri p2: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Studime të shprehjes së EGFP-së

Për studimet e shprehjes, shtami rekombinant L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Gjermani), me gjenin për EGFP (proteina fluoreshente e gjelbër e përmirësuar) të integruar në ssu kromozomale, u kultivua në mjedise të ndryshme siç u përshkrua më parë, të plotësuara gjithashtu me 100 mg l^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Gjermani). Gjatë kultivimit, u morën mostra prej 1 ml, u centrifuguan (2000 × g, 20°C, 10 min) dhe u lanë me tretësirë NaCl 0,9%. Sedimenti u risuspendua në tampon (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) dhe u shpërbë me sonikim duke përdorur procesorin ultrasonik UP400S (aplikim energjie ∼ 400 Ws). Mbetjet qelizore u larguan me centrifugim (6000 × g, 4°C, 5 min) dhe u analizuan me elektroforezë në xhel poliakrilamidi me dodecil sulfat natriumi (SDS-PAGE) në kushte reduktuese sipas metodës së Laemmli (1970), me xhele poliakrilamidi 12,5%. Shprehja e EGFP u shqyrtua në kulturë me tundje. (Fritsche et al. 2007)

Imunoprecipitimi i kromatinës

Analiza e imunoprecipitimit të kromatinës u krye duke përdorur ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, SHBA) sipas udhëzimeve të prodhuesit, me disa modifikime. Shkurtimisht, podocitet njerëzore të diferencuara iu nënshtruan lidhjes së kryqëzuar me formaldehid 1% për 10 min në temperaturën e dhomës. Qelizat u lanë me PBS të ftohtë si akulli dhe reaksioni i fiksimit u ndal duke shtuar glicinë 0,125 M për 5 min në temperaturën e dhomës. Qelizat u lanë përsëri me PBS të ftohtë si akulli dhe u shkëputën nga ena me gërvishtje. Qelizat u sedimentuan me centrifugim dhe u risuspenduan në tamponin e lizës. Pas centrifugimit, bërthamat e sedimentuara u risuspenduan në tamponin e fragmentimit, u inkubuan mbi akull për 30 min dhe kromatina u fragmentua me sonikim, p.sh. me UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Gjermani) me fuqi 25%, me 5 impulse nga 20 sec secili mbi akull, në fragmente prej afërsisht 200–600 bp. Kromatina e fragmentuar më pas u centrifugua dhe u mblodh supernatanti. Për imunoprecipitimet, 60 μl kromatinë u inkubuan me 1 μg antitrupa kundër Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, SHBA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, Mbretëria e Bashkuar) ose NF-κB p50 (Abcam), ose me IgG lepuri (Zymed Laboratories) si kontroll negativ, gjatë natës në 4°C me rrotullim të lehtë. Imunokomplekset e lidhura me rruazat magnetike u mblodhën duke përdorur një stativ magnetik, u lanë gjerësisht dhe lidhjet e kryqëzuara proteinë/ADN u zhbënë, ndërsa ADN-ja u elua për analizë me PCR në kohë reale. (Ristola et al. 2009)

Përgatitja e ADN-së së EHEC për analizë me mikroçipa

Sistemimi i lizateve qelizore dhe i ADN-ve të ekstraktuara
Sedimentet bakteriale të suspenduara në PBS deri në përqendrimin përfundimtar të dëshiruar u trajtuan me shpërbërësin ultrasonik UP100H (Hielscher GmbH, Gjermani) i pajisur me një mikromajë MS1 (me diametër 1mm). Frekuenca e punës ishte 30 kHz dhe fuqia efektive në dalje ishte 100 W. Gjatë punës, mostrat u ftohën në një banjë me ujë dhe akull, u përzien dhe u centrifuguan. Mostrat u përdorën për studime me citometri rrjedhëse, ndërsa për përpunimin e mëvonshëm, mostrat iu nënshtruan një trajtimi termik (95°C, 5 min). Lizatet qelizore bruto u përpunuan me një përzierje fenoli:kloroformi:alkooli izoamilik (25:24:1). Mostrës së lizatit iu shtua një vëllim i barabartë i kësaj përzierjeje, tretësira u përzie fuqishëm me vorteks për 15 s dhe u centrifugua në 15 000 x g për 2 min në temperaturën e dhomës (RT), rreth 22°C. Faza e sipërme ujore që përmbante ADN-në gjenomike u nda me kujdes dhe u mblodh në një tub të ri steril Eppendorf.
Më pas, mostrat u trajtuan me ultratinguj për të fragmentuar ADN-në. Hapi i trajtimit me ultratinguj u krye në të njëjtat kushte siç përshkruhet më sipër. Për të vlerësuar efektet e fragmentimit mbi ADN-në gjenomike, mostrat u analizuan me elektroforezë në xhel agaroze.
(…) Mostrat e trajtuara më parë me ultratinguj për 2,5 min iu nënshtruan një hapi ekstraktimi pas trajtimit termik dhe centrifugimit. ADN-ja e çliruar u ekstraktua dy herë me një përzierje fenoli:kloroformi:alkooli izoamilik dhe më pas iu nënshtrua një trajtimi të dytë me ultratinguj për 0 – 15 min. Elektroforeza në xhel agaroze u përdor për të përcaktuar shpërndarjen e madhësive të ADN-së së nënshtruar fragmentimit me ultratinguj pas ekstraktimit (figura lart djathtas). ADN-ja shumë e fragmentuar dallohej nga prania e një brezi difuz të ADN-së në vend të brezave me peshë të lartë molekulare, të cilët u eliminuan nga mostrat e trajtuara me ultratinguj për 2,5 min ose më gjatë. Trajtimi më i gjatë me ultratinguj e zvogëloi gradualisht gjatësinë e fragmenteve në afërsisht 150 – 600 bp, dhe trajtimi me ultratinguj për 15 min i degradoi më tej këto fragmente, siç mund të shihet kryesisht nga pjesa e sipërme e brezit difuz. Kështu, madhësia mesatare e fragmenteve të ADN-së u zvogëlua gradualisht me kohën e trajtimit me ultratinguj dhe trajtimi prej 5 min mundësoi përftimin e madhësive të fragmenteve të ADN-së më të përshtatshme për analizat me mikroçipe. Në fund, u përcaktua procedura e përgatitjes së analitit të ADN-së, e cila përfshinte fillimisht 2 min trajtim me ultratinguj, ekstraktimin e ADN-së (2×) dhe më pas 5 min trajtim me ultratinguj. (Basselet et al. 2008)

Imunoprecipitimi i kromatinës (ChIP)

Qelizat HEK293 u kultivuan siç përshkruhet më sipër dhe u fiksuan me 2 mM disukcinimidil-glutarat për 45 min në temperaturën e dhomës. Më pas, qelizat u lanë dy herë me PBS. Kromatina u lidh në mënyrë të kryqëzuar për 10 min në temperaturën e dhomës duke përdorur formaldehid 1% (v/v) dhe u la dy herë me PBS të ftohtë si akulli. Reaksioni i lidhjes së kryqëzuar u ndal me inkubim me glicinë në një përqendrim përfundimtar prej 0,125 M për 5 min në temperaturën e dhomës. Pas inkubimit me tripsinë, qelizat u shkëputën me kruajtje nga pjata e kulturës qelizore dhe u lanë dy herë me PBS. Sedimenti qelizor u risuspendua në tampon lize (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl dhe 0,5% (v/v) Nonidet P-40), u inkubua mbi akull për 10 min dhe u homogjenizua me një homogjenizues Dounce. Më pas, bërthamat u sedimentuan me centrifugim (3500 x g, 5 min, 4 °C) dhe u risuspenduan në tampon për bërthamat (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA dhe 1% (w/v) SDS). Bërthamat u shpërbënë me trajtim me ultratinguj me tre impulse nga 20-s në një sonikator UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) me ciklin të vendosur në 0,5 dhe amplitudën në 30%, duke përftuar fragmente të ADN-së gjenomike me madhësi kryesisht 200 – 1000 bp. Për ChIP, 50g ADN u holluan 4 herë në tampon imunoprecipitimi (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 dhe 0,01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Analiza e modifikimeve të histoneve me imunoprecipitim të kromatinës (ChIP)

Shkurtimisht, 6 x 10⁶ qeliza u lanë dy herë me PBS dhe u lidhën në mënyrë të kryqëzuar në pllakën e kulturës për 15 min në temperaturën e dhomës, në prani të formaldehidit 0,5%. Reaksioni i lidhjes së kryqëzuar u ndal duke shtuar glicinë 0,125 M. Të gjithë hapat pasues u kryen në 48°C. Të gjitha tretësirat tampon ishin ftohur paraprakisht dhe përmbanin inhibitorë të proteazave (Complete Mini, Roche). Qelizat u lanë dy herë me PBS dhe më pas u shkëputën me gërvishtje. Peletat e mbledhura u tretën në 1 ml tampon lize (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) dhe u trajtuan me ultratinguj në një banjë të ftohtë etanoli për 10 cikle me amplitudë 100%, duke përdorur një sonikator UP50H (Hielscher, Teltow, Gjermani). Fragmentimi i kromatinës u vizualizua në xhel agaroze 1%. Fragmentet e përftuara ishin në intervalin 200–500pb. Kromatina e tretshme u përftua duke centrifuguar mostrat e trajtuara me ultratinguj në 14 000g për 10 min në 48°C. Fraksioni i tretshëm u hollua 1/10 në tampon hollimi (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), më pas u nda në alikuota dhe u ruajt në 80°C deri në përdorim. (Rodriguez et al. 2008)