Ultrasonik Liza nga E. Coli

  • Bakteret E. coli janë bakteret më të përdorura në mikrobiologji dhe bioteknologji.
  • Disruptorët e qelizave tejzanor japin rezultate të besueshme dhe riprodhuese për lizën e E. colit.
  • Kavitaçi intensive dhe ende saktësisht e kontrollueshme dhe forcat qethëse rezultojnë në përçarje të plota dhe yield-et e larta të nxjerrjes (p.sh. proteina, ADN).

Pse përçarja e qelizave tejzanor të E. coli është metoda e preferuar?

Homogjenizuesit tejzanor ose ultrasonikët e tipit sondë ofrojnë disa avantazhe për lizën e E. coli pasi ultratingulli intensiv prish në mënyrë efikase muret dhe membranat qelizore. Ultrasonikët e tipit sondë përdoren gjerësisht për lizën e E. coli për arsyet e mëposhtme:

  • Prishja efikase e mureve qelizore: E. coli ka një mur qelizor gjysmë të ngurtë të përbërë nga peptidoglikan, i cili mund të jetë i vështirë për t'u thyer duke përdorur metodat tradicionale të lizës. Një ultrasonikator i tipit sondë gjeneron valë intensive tejzanor që krijojnë flluska të kavitacionit në lëngun që rrethon qelizat. Kur këto flluska shemben, ato gjenerojnë avionë të lëngshëm me shpejtësi të lartë dhe valë goditëse që rezultojnë në përçarje mekanike të mureve qelizore, duke çliruar në mënyrë efektive përmbajtje qelizore si biomolekulat.
  • Penetrimi i zgjeruar: Valët tejzanor të krijuara nga sonda / sonotrode mund të depërtojnë thellë në kampion, duke arritur një numër më të madh të qelizave E. coli dhe duke i trajtuar ato në mënyrë të barabartë. Kjo ndihmon për të siguruar që liza të jetë më uniforme në të gjithë kampionin, duke rezultuar në efikasitet më të lartë të ndërprerjes së qelizave.
  • Koha e reduktuar e përpunimit: Energjia e dhënë nga ultrasonikatori i tipit sondë është shumë i përqendruar dhe i lokalizuar, duke çuar në lizë të shpejtë dhe efikase të qelizave. Krahasuar me metoda të tjera si rrahja e rruazave ose liza enzimatike, sonikimi mund të arrijë lizën e E. coli brenda disa minutave apo edhe sekondave. Ndërsa shumë teknika alternative si ngrirja-shkrirja kërkojnë disa raunde trajtimi, liza tejzanor hap qelizat në një hap të vetëm procesi.
  • Kontrolli i temperaturës: Ultrasonikët më të avancuar janë të pajisur me sensorë të temperaturës dhe softuer inteligjent, i cili ju lejon të vendosni një temperaturë maksimale të procesit. Ultrasonikatori ndalon automatikisht kur arrihet kufiri i temperaturës dhe fillon procesin e sonikimit kur arrihet një pikë e caktuar e temperaturës. Ftohja e mostrave në një banjë akulli është një metodë e thjeshtë për të mbajtur temperaturën e kampionit të ulët dhe për të parandaluar degradimin e mostrës të shkaktuar nga nxehtësia.
  • Shkallëzueshmëria: Ultrasonikët e tipit sonda janë të disponueshëm në madhësi të ndryshme, nga pajisjet e dorës deri te modelet industriale në shkallë të gjerë. Kjo i bën ato të përshtatshme për përpunimin e vëllimeve të vogla në laborator ose për shkallëzim për aplikime më të mëdha të biopërpunimit, p.sh. prodhimi i vaksinave ose biosinteza e molekulave.
  • Shkathtësia: Ultrasonikatorët mund të përdoren për aplikime të ndryshme përtej lizës së qelizave, të tilla si prerja e ADN-së, nxjerrja e proteinave, homogjenizimi i indeve, shpërndarja e nanogrimcave dhe emulsifikimi. Prandaj, investimi në një ultrasonikator të tipit sondë ofron shkathtësi në mjediset kërkimore ose industriale.
  • Ultrasonikët e tipit sondë si UP200St janë homogjenizues të besueshëm të indeve dhe thërrmues qelizash, prandaj përdoren gjerësisht për përgatitjen e mostrës në gjenetikë, p.sh., për lizën e E.coli

    Nxjerrja e proteinave nga qelizat E.coli kryhet në mënyrë efikase me sonda tejzanor UP200St

    Ultrasonikator i tipit sondë ofron shumë përparësi për lizën e E. coli. Kontrolli i besueshëm dhe i saktë mbi parametrat e procesit tejzanor mundëson optimizimin e parametrave të funksionimit si fuqia, kohëzgjatja dhe trajtimi i mostrës për të arritur rezultatet e dëshiruara.
     

    Kërkesë informacioni





     

    Ky tutorial shpjegon se çfarë lloji i sonikatorit është më i miri për detyrat tuaja të përgatitjes së mostrës si liza, ndërprerja e qelizave, izolimi i proteinave, fragmentimi i ADN-së dhe ARN-së në laboratorë, analiza dhe kërkime. Zgjidhni llojin ideal të sonikatorit për aplikimin tuaj, vëllimin e mostrës, numrin e mostrës dhe xhiros. Hielscher Ultrasonics ka homogjenizuesin ideal tejzanor për ju!

    Si të gjeni sonikatorin e përsosur për ndërprerjen e qelizave dhe nxjerrjen e proteinave në shkencë dhe analizë

    Miniatura e videos

    Fragmentimi tejzanor i ADN-së përdoret shpesh si hap i përgatitjes së mostrës në Sekuencën e Gjeneratës së ardhshme (NGS)

    Analizat elektroforetike të ADN-së gjenomike të E. coli EDL933 i nënshtruar ultrazërit 0 – 15 min. L tregon shkallën e ADN-së.
    (studim dhe imazh: ©Basselet et al. 2008)

    Ndërprerja e qelizave duke përdorur kavitacion tejzanor

    Homogjenizuesit e tipit sondë tejzanor funksionojnë me përafërsisht. 20,000 cikle në sekondë (në 20 kHz) dhe shkaktojnë kavitacion në lëngje ose pezullime. Zonat mikroskopike të kavitacionit akustik me presione të ngjashme me vakum dhe temperatura të larta që copëtojnë qelizat. Megjithëse temperaturat mund të arrijnë disa mijëra gradë Celsius, vëllimet e kavitacionit janë aq të vogla sa nuk e ngrohin ndjeshëm procesin. Kavitacioni akustik i gjeneruar nga ultratingulli dhe forcat e prerjes shpojnë ose thyejnë membranën qelizore të qelizave bakteriale si E.coli. Ultrasonikët Hielscher lejojnë kontrollin e saktë mbi parametrat e procesit si intensiteti tejzanor, amplituda, futja e energjisë dhe temperatura. Kështu, procesi i lizës tejzanor mund të përshtatet në mënyrë optimale me llojin e qelizës, kulturën qelizore dhe qëllimin e procesit.
     

    Avantazhet e lizës ultratinguj

    • kontrolli i saktë i lizës (intensiteti, amplitudë, temperatura)
    • rezultate të besueshme, të riprodhueshme
    • përshtatje optimale ndaj mostrave specifike
    • kontrollin e temperaturës
    • për mostra shumë të vogla ose shumë të mëdha (μL në litra)
    • Trajtim i pastër mekanik
    • funksionim i përshtatshëm për përdoruesit, i sigurt
    • shkallë lineare nga laboratori në prodhim
    Pajisja tejzanor VialTweeter mundëson përgatitjen e njëkohshme të mostrës deri në 10 shishka nën të njëjtat kushte procesi. (Kliko per te zmadhuar!)

    VialTweeter për lizë ultrasonike

    Kërkesë informacioni





    Homogjenizues tejzanor kundrejt teknikave të tjera të lizës

    Ndërsa liza kimike dhe enzimatike mund të jetë problematike – pasi liza kimike mund të ndryshojë strukturat e proteinave dhe të paraqesë probleme të pastrimit dhe liza enzimatike kërkon kohë të gjata inkubimi dhe nuk është e riprodhueshme – përçarje tejzanor është një metodë e sofistikuar, e shpejtë e qelizave të përçarjes.
    Liza tejzanor bazohet vetëm në forcat mekanike. Nuk shtohen kimikate, sonifikimi thyen murin qelizor nga forcat prerëse. Liza kimike mund të ndryshojë strukturën e proteinave dhe të sjellë probleme pastrimi. Ndërprerja enzimatike kërkon kohë të gjata inkubimi dhe nuk është i riprodhueshëm. Ndërprerja tejzanor e qelizave të baktereve E.coli është e shpejtë, e thjeshtë, e besueshme dhe e riprodhueshme. Kjo është arsyeja pse ultrasonikët Hielscher përdoren në laboratorët biologjikë dhe biokimikë në mbarë botën për përgatitjen e mostrave, para-analitikë, diagonstikë in-vitro dhe analiza të shumëfishta.

    Rekomandime të përgjithshme për lizën tejzanor

    Sonication është teknikë më popullore për lysimin e sasive shumë të vogla, të mesme dhe të mëdha të pezullimeve qelizore – nga pico-litra deri në 100L / orë (duke përdorur një qelizë rrjedhëse tejzanor). Qelizat janë lysed nga qethje të lëngshme dhe cavitation. ADN është gjithashtu i prerë gjatë sonication, kështu që nuk është e nevojshme për të shtuar DNase në pezullimin qelizë.
     

    Kontrolli i temperaturës gjatë lizës së E.coli me ultratinguj
    Ndërprerës tejzanor i qelizave UP100H (100W) për prishjen e qelizave dhe nxjerrjen e përbërjeve bimore.Me ftohjen paraprake të mostrës dhe mbajtjen e mostrës gjatë sonikimit në akull, degradimi termik i mostrës mund të pengohet lehtësisht.
    Në mënyrë ideale, mostrat duhet të mbahen të ftohta në akull gjatë lizës, por për shumicën e mostrave është e mjaftueshme nëse temperatura nuk ngrihet mbi temperaturën e kulturës ose burimit të indeve. Prandaj rekomandohet mbajtja e suspensionit në akull dhe sonikimi me disa impulse të shkurtra ultrasonike prej 5-10 sek dhe pauza 10-30 sek. Gjatë pauzave, nxehtësia mund të shpërndahet për të rivendosur një temperaturë të ulët. Për mostrat e qelizave më të mëdha, janë në dispozicion reaktorë të ndryshëm të qelizave rrjedhëse me xhaketa ftohëse.
    Lexoni këtu këshilla dhe rekomandime të detajuara për një lizë të suksesshme tejzanor!

    Protokollet për përgatitjen me ultratinguj të lizave E. Coli

    Studiuesit përdorin homogjenizues tejzanor Hielscher për përçarjen e qelizave E.coli. Më poshtë mund të gjeni protokolle të ndryshme të testuara dhe të vërtetuara për lizën e E.coli duke përdorur homogjenizues tejzanor Hielscher për aplikacione të ndryshme të lidhura me E. coli.
     

    Ky videoklip tregon homogjenizuesin tejzanor Hielscher UP100H, një aparat ultrasonik i përdorur gjerësisht për përgatitjen e mostrës në laboratorë.

    Homogjenizues tejzanor UP100H

    Miniatura e videos

    Rritja e qelizave, ndërlidhja dhe përgatitja e ekstrakteve të qelizave E. coli duke përdorur ultratinguj

    Për SeQA dhe RNA polimeraza ChIP-Chip E. coli MG1655 ose MG1655 ΔseqA u rrit në 37 ° C në një OD600 nga rreth 0.15 në 50 ml LB (+ 0.2% glukozë) para se të shtohen 27 μl formaldehide (37%) për ml medie (përqendrimi final 1%). Crosslinking u krye me treshe të ngadalta (100 rpm) në temperaturën e dhomës për 20 min pasuar nga shuarja me 10 ml 2,5 M glycine (përqendrimi final 0.5 M). Për eksperimentet e nxehtësisë, E. coli MG1655 u rrit në 65 ml LB në 30 ° C në një OD600 prej rreth 0.3. Më pas 30 ml kulturë u transferua në një balonë të ngrohur paraprakisht në 43°C dhe pjesa e mbetur u mbajt në 30°C. Lidhja e kryqëzuar dhe shuarja ishte siç u përshkrua më sipër, përveç që qelizat u mbajtën në 30 ose 43°C për 5 minuta përpara shkundjes së mëtejshme të ngadaltë në temperaturën e dhomës. Qelizat u mblodhën me centrifugim dhe u lanë dy herë me TBS të ftohtë (pH 7.5). Pas risuspensionit në 1 ml tampon lize (10 mM Tris (pH 8.0), 20% saharozë, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lizozimë) dhe inkubimit në 37°C për 30 minuta, e ndjekur nga shtimi i 4 ml IP. tampon, qelizat u sonikuan në akull me ndërprerje 12 herë 30 sek dhe 30 sek duke përdorur procesorin tejzanor Hielscher UP400St në vendosjen e fuqisë 100%. Pas centrifugimit për 10 minuta në 9000 g, 800 μl pjesë të supernatantit u ruajtën në -20°C. (Waldminghaus 2010)
     

    Mbiprodhimi dhe pastrimi i enzimave me një sondë tejzanor

    Ultrasonicator UP100H është një homogjenizues laboratorik që përdoret shpesh për përgatitjen e mostrave të pllakave të kulturës qelizore.Për mbiprodhimin e proteinave të etiketuara me dekahistidinë (His10), E. coli BL21(DE3) u transformua me konstruksione pET19b. Një parakulturë brenda natës u korr me centrifugim dhe 1% u përdor për të inokuluar një kulturë shprehëse. Qelizat që mbanin pET19mgtB u rritën në 22°C deri në një densitet optik në 600 nm (OD600) prej 0.7. Kultura u transferua në 17°C dhe u nxit nga 100 μM IPTG. Pas 16 orësh, kultura u korr me centrifugim në 7,500 × g në 4°C. Qelizat u risuspenduan në kripur 50 mM të buferuar me fosfat (PBS) me 0.3 M NaCl në pH 7.4 dhe u ndërprenë nga ultratingulli me një sonotrode mikro-majë S2 në ultrasonikatorin Hielscher UP200St në një cikël prej 0.5 dhe një amplitudë prej 75%.
    Mbiprodhimi i dektahistidine-tagged GtfC ishte nxitur në 37 ° C në një OD600 e 0.6 me 100 μM IPTG. Qelizat pastaj u inkubuan për 4 orë, korrur, dhe lysed siç u tha më lart për MgtB.
    Ekstraktet e qelizave të papërpunuara u centrifuguan në 15,000 × g dhe 4 ° C për të sedimentuar mbeturinat e qelizave. Ekstraktet e sqaruara u ngarkuan në kolonat 1 ml HisTrap FF Crude duke përdorur një sistem ÄKTAprime Plus. Enzimat u pastruan sipas protokollit të prodhuesit për elucionin gradient të proteinave të etiketuara me His. Tretësirat e proteinave të elutura u dializuan dy herë kundër 1000 vëllimeve 50 mM PBS, pH 7.4, me 0.3 M NaCl në 4°C. Pastrimi u analizua nga 12% SDS-PAGE. Përqendrimi i proteinave u përcaktua me metodën Bradford duke përdorur Roti-Quant. (Rabausch et al. 2013)
     

    Nxjerrja me ultratinguj e proteinave nga bakteret E. coli
    Një proteinë me interes të interesit (në këtë rast, MTV1 e Arabidopsis thaliana) është shkrirë në një tag GST dhe shprehet në qelizat BL21 Escherichia coli (E. coli).

    1. Merrni një topth GST-MTV1 dhe GST (që korrespondon me 50 ml kulturë bakteriale) dhe risuspendoni secilin në 2,5 ml tampon ekstraktimi të ftohtë në akull.
    2. Përdorni një ultrasonikator UP100H (i pajisur me MS3 microtip-sonotrode për vëllime të vogla prej përafërsisht 2-5 mL) për të prishur qelizat bakteriale derisa ato të lizohen, gjë që tregohet nga zvogëlimi i errësirës dhe viskoziteti i rritur. Kjo duhet të kryhet në akull dhe rekomandohet të bëhet sonikimi në intervale (p.sh. sonikimi 10 sekonda i ndjekur nga pauza 10 sekonda në akull e kështu me radhë). Duhet pasur kujdes që të mos sonikohet me intensitet shumë të lartë. Nëse zbulohet shkumëzimi ose formimi i një precipitati të bardhë, intensiteti duhet të ulet.
    3. Transferoni tretësirën e baktereve të lizuara në tubat e mikrocentrifugës 1,5 mL dhe centrifugoni në 4°C, 16,000 xg për 20 min.

     

    Sondat tejzanor përdorin forcat e kavitacionit akustik për të prishur qelizën dhe për të nxjerrë molekulat dhe ADN-në nga E.coli.

    Ultrasonikë të tipit sondë të tillë si UP400St përdorin parimin e punës së kavitacionit akustik për lizën efikase të E.coli.

    Analiza e Shprehjes dhe Pastrimi i Proteinës Rekombinante duke përdorur Sonication

    Peleti E. coli u sonikua me ultrasonikatorin Hielscher UP100H. Për këtë qëllim, peleti qelizor u risuspendua në tampon lize të ftohtë (50 mM Tris-HCl pH=7.5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) dhe u fto në akull për 10 min. Më pas, suspensioni i qelizave u sonikua me 10 breshëri të shkurtra prej 10 s të ndjekura nga një interval prej 30 s për ftohje. Më në fund, mbeturinat e qelizave u hoqën me ultracentrifugim në 4°C për 15 minuta në 14000 rpm. Për konfirmimin e shprehjes rPR, supernatanti u përdor në xhel poliakrilamid 12% dhe u analizua me SDS-PAGE dhe Western blotting. Pastrimi i rPR është bërë duke përdorur rrëshirë Ni2+-NTA (Invitrogen, USA) sipas udhëzuesit të prodhuesit. Në këtë fazë është përdorur metoda e pastrimit vendas. Pastërtia e proteinës së pastruar u vlerësua duke përdorur elektroforezë në xhelin e poliakrilamidit 12% dhe ngjyrosjen e mëvonshme blu Coomassie. Përqendrimi i proteinës së pastruar u mat me kompletin e analizës së proteinës Micro BCA (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al. 2016)
     

    Kjo video tregon filxhanin tejzanor 200 vat për shpërndarjen, homogjenizimin, nxjerrjen ose degazinimin e mostrave laboratorike.

    Kupa tejzanor (200 Watts)

    Miniatura e videos

    Homogjenizues tejzanor për E. coli Lisis

    Hielscher Ultrasonics projekton, prodhon dhe furnizon homogjenizues tejzanor me performancë të lartë për lizën e besueshme dhe efikase të baktereve E. coli dhe llojeve të tjera të qelizave, indeve dhe kulturave qelizore.
    Portofoli i gjerë i sondave tejzanor si dhe i sistemeve indirekte të sonikacionit na lejon t'ju ofrojmë homogjenizuesin ideal të indeve ultrasonike për aplikimin tuaj të përçarjes dhe nxjerrjes së qelizave.

    Dizajn, Prodhim dhe Konsulencë – Cilësi e prodhuar në Gjermani

    Ultrasonikët Hielscher mund të kontrollohen nga distanca nëpërmjet kontrollit të shfletuesit. Parametrat e tingullit mund të monitorohen dhe përshtaten saktësisht sipas kërkesave të procesit.Ultrasonikët Hielscher janë të njohur për cilësinë e tyre më të lartë dhe standardet e dizajnit. Softueri inteligjent, menyja intuitive, cilësimet e programueshme dhe protokollimi automatik i të dhënave janë vetëm disa veçori të ultrasonikëve Hielscher. Qëndrueshmëria dhe funksionimi i lehtë lejojnë integrimin e qetë të ultrasonikëve tanë në objektet kërkimore dhe bioteknike. Edhe kushtet e vështira dhe mjediset kërkuese trajtohen lehtësisht nga ultrasonikët Hielscher.

    Hielscher Ultrasonics është një kompani e certifikuar ISO dhe i kushton theks të veçantë ultratingujve me performancë të lartë që paraqesin teknologjinë më të fundit dhe lehtësinë ndaj përdorimit. Sigurisht, ultrasonikët Hielscher janë në përputhje me CE dhe plotësojnë kërkesat e UL, CSA dhe RoHs.

    Tabela më poshtë ju jep një tregues të kapacitetit të përafërt të përpunimit të ultrasonicators tonë:

    Vëllimi i Serisë Shkalla e rrjedhjes Devices rekomanduara
    pllaka me shumë pus / mikrotitër na UIP400MTP
    Kupa për shishka ose gotë na Kornizë tejzanor
    reaktor mikro-rrjedhës tejzanor na GDmini2
    deri në 10 shishe me 0,5 deri në 1,5 ml na VialTweeter
    05 deri në 1.5mL na VialTweeter
    1 deri 500mL 10 deri 200mL / min UP100H
    10 deri në 2000 ml 20 deri 400mL / min UP200Ht, UP400St
    0.1 deri në 20L 0.2 deri në 4L / min UIP2000hdT
    10 deri në 100L 2 deri në 10L / min UIP4000
    na 10 deri në 100L / min UIP16000
    na më e madhe grup i UIP16000

    Na kontaktoni! / Pyet Na!

    Pyesni për më shumë informacion

    Ju lutemi përdorni formularin e mëposhtëm për të kërkuar informacion shtesë në lidhje me homogjenizuesit tejzanor të indeve dhe thërrmuesit e qelizave, aplikacionet e lizës dhe çmimet. Ne do të jemi të lumtur të diskutojmë procesin tuaj me ju dhe t'ju ofrojmë një homogjenizues tejzanor që plotëson kërkesat tuaja!









    Ju lutem vini re tonë Politika e privatësisë.


    Videoja tregon sistemin e përgatitjes së mostrës me ultratinguj UIP400MTP, i cili lejon përgatitjen e besueshme të mostrës së çdo pllake standarde me shumë pusi duke përdorur ultratinguj me intensitet të lartë. Aplikimet tipike të UIP400MTP përfshijnë lizën e qelizave, ADN-në, ARN-në dhe prerjen e kromatinës, si dhe nxjerrjen e proteinave.

    Ultrasonicator UIP400MTP për sonifikimin e pllakave me shumë puse

    Miniatura e videos

    Protokolle Shtesë për Lizën E. coli me ultratinguj

    Proteinat e modifikuara nga alicina në E. coli duke përdorur një VialTweeter tejzanor

    VialTweeter në procesorin tejzanor UP200STPërcaktimi i Përmbajtjes Sulfhydryl nga 5,5'-Dithiobis (acid 2-nitrobenzoic acid) (DTNB)
    Një kulturë E. coli MG1655 gjatë natës u përdor për të inokuluar mjedisin minimal MOPS (1:100). Kultura u rrit në mënyrë aerobike derisa u arrit një A600 prej 0.4. Kultura u nda në tre kultura 15 ml për trajtimin e stresit. Një kulturë e patrajtuar shërbeu si një kontroll negativ. 0,79 mM allicin (128 μg ml-1) ose 1 mM diamide iu shtua njërës nga dy kulturat e mbetura secila. Kulturat u inkubuan për 15 min. 5 ml të secilës kulturë u mblodhën me centrifugim (8,525 × g, 4°C, 10 min). Qelizat u lanë dy herë me 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4, u ruajtën në mënyrë anaerobe përpara përdorimit) dhe u centrifuguan (13,000 × g, 4°C, 10 min). Qelizat u risuspenduan në tampon lize (PBS me 6 mM HCl guanidinium, pH 7.4) përpara ndërprerjes në 4°C me anë të ultrazërit (VialTweeter ultrasonikator, Hielscher GmbH, Gjermani) (3 × 1 min). Mbetjet e qelizave u grumbulluan me centrifugim (13,000 × g, 4 ° C, 15 min). Supernatanti u transferua në një kuvetë makro QS 3,5 ml (10 mm) me një shirit magnetik përzierjeje dhe u përzier me 1 ml tampon lize. Zhdukja e mostrave u monitorua në 412 nm me një spektrofotometër Jasco V-650 të pajisur me mbajtësin e qelizave PSC-718 të kontrolluar nga temperatura në temperaturën e dhomës. U shtuan 100 μl tretësirë 3 mM ditiobis (2-acid nitrobenzoik). Zhdukja u monitorua derisa arriti ngopjen. Llogaritja e përqendrimit të tiolit u krye duke përdorur koeficientin e zhdukjes ϵ412 = 13,700 M-1 cm-1 për acidin thio-2-nitrobenzoik (TNB). Përqendrimet e tioleve celulare u llogaritën në bazë të një vëllimi të qelizave E. coli prej 6.7 × 10-15 litër dhe një dendësi qelize prej A600 = 0,5 (ekuivalente me 1 × 108 qeliza ml-1 kultura). (Müller et al. 2016)
     

    Përcaktimi In Vivo Glutathione duke përdorur një Thërrmues qelizash tejzanor

    E.coli MG1655 u rrit në mjedis minimal MOPS në një vëllim total prej 200 ml derisa u arrit një A600 prej 0.5. Kultura u nda në kultura 50 ml për trajtimin e stresit. Pas 15 minutash inkubacion me 0,79 mM allicin, 1 mM diamide ose dimetil sulfoksid (kontrolli), qelizat u mblodhën në 4000 g në 4°C për 10 minuta. Qelizat u lanë dy herë me tampon KPE përpara risuspensionit të peletit në 700 μl bufer KPE. Për deproteinim, 300 l acid sulfosalicilik 10% (w/v) u shtuan përpara prishjes së qelizave me anë të ultrazërit (3 x 1 min; VialTweeter ultrasonicator). Supernatantët u mblodhën pas centrifugimit (30 min, 13,000g, 4 ° C). Përqendrimet e acideve sulfosalicilike u zvogëluan në 1% me shtimin e 3 vëllimeve të tamponit KPE. Matjet e glutationit total dhe GSSG janë kryer siç përshkruhet më sipër. Përqendrimet e glutationit qelizor u llogaritën në bazë të një vëllimi të qelizave E. coli të 6.7×10-15 litër dhe një dendësi qelize prej A600 0,5 (ekuivalente me 1×108 qeliza ml-1 kultura). Përqendrimet GSH u llogaritën me zbritjen e 2 [GSSG] nga glutationi total. (Müller et al. 2016)

    Shprehja e mAspAT e njeriut në E. coli duke përdorur një homogjenizues tejzanor

    Disruptor qelizor tejzanor UP400St (400W) për nxjerrjen e lëndës intracelulare (p.sh. proteina, organele, ADN, ARN, etj)Kolonia e vetme e E. coli BL21 (DE3) që përmban vektorin e shprehjes në 30 ml Luria-Bertani (LB) të mesme që përmban 100μg / ml ampicilin, dhe pastaj kultivohet në 37ºC deri në densitetin optik (OD600) arriti 0.6. Qelizat u korrnuan me centrifugim në 4,000 × g për 10 min dhe resuspenduan në 3L medium të freskët LB që përmban 100μg / mL ampicilin.
    Më pas, shprehja e proteinave u nxit me 1 mM izopropil β-ᴅ-1-tiogalaktopiranozid (IPTG) për 20 orë në 16ºC. Qelizat u mblodhën me centrifugim në 8000 × g për 15 min dhe u lanë me tampon A (20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, pH 7.4). Përafërsisht 45 g (peshë të lagësht) qeliza u morën nga kultura 3 L. Pas centrifugimit, peletat qelizore u risuspenduan në 40 mL (për kulturë 1 L) tampon A të ekstraktimit të ftohtë në akull dhe u lizuan me ultratinguj në temperaturë të ftohtë në akull duke përdorur thërrmuesin e qelizave tejzanor Hielscher UP400St. Liza e qelizave u centrifugua në 12,000 rpm për 15 minuta për të ndarë fraksionet e tretshme (mbipërkatëse) dhe të precipituara (pelet). (Jiang et al. 2015)
     



    Fakte të vlefshme

    E.coli

    Escherichia coli (E. coli) është një bakter mikroorganizmi gram-negativ, facultativ anaerob, në shufër, e Escherichia gjini që zakonisht gjendet në zorrët e ulëta të organizmave me gjak të ngrohtë (endotermet). Ekzistojnë një numër i madh i shtameve E. coli (ose nëntipe) me karakteristika të ndryshme. Shumica e shtameve të E. coli janë të padëmshme për njerëzit, p.sh. shtamet B dhe K-12 që përdoren zakonisht për aplikime kërkimore në laboratorë. Megjithatë, disa lloje janë të dëmshme dhe mund të shkaktojnë sëmundje serioze.
    E. coli luan një rol të rëndësishëm në inxhinieri moderne biologjike dhe mikrobiologji industriale pasi bakteret janë të lehta për t'u manipuluar. Aplikime të përbashkëta laboratorike të cilat përfshijnë shpesh përdorimin e E. coli, p.sh. për të krijuar acid rekombinant deoksiribonukleik (ADN) ose për të vepruar si një organizëm model.
    E. coli është një mikpritës shumë i zhdërvjellët për prodhimin e proteinave heterologe dhe sistemet e shumëfishta të shprehjes së proteinave janë në dispozicion për të prodhuar proteinat rekombinante në E. coli. Përdorimi i plazmideve që lejojnë shprehjen e nivelit të lartë të proteinave, gjenet mund të futen në baktere, gjë që mundëson prodhimin e proteinave të tilla në sasi të mëdha në proceset fermentuese industriale.
    E.coli përdoren si fabrika të qelizave për të prodhuar insulinë. Zbatime të mëtejshme përfshijnë përdorimin e qelizave të modifikuara E. coli për të zhvilluar dhe prodhuar vaksina dhe enzima të imobilizuara, për të prodhuar biokarburantet, si dhe për bioremediation.
    Kripë K-12 është një formë mutante e E. coli që mbi-shpreh enzimë Alkaline Phosphatase (ALP). Ky mutacion ndodh për shkak të një defekti në gjenin që vazhdimisht përcakton enzimë. Nëse një gjen prodhon një produkt pa asnjë pengesë, kjo njihet si aktivitet konstituiv. Ky formë specifike mutante përdoret për izolimin dhe pastrimin e enzimës ALP.
    Bakteret E. coli përdoren gjithashtu gjerësisht si fabrika të qelizave. Mikrobet e krijuara (p.sh. bakteret) dhe qelizat bimore mund të përdoren si të ashtuquajturat fabrika të qelizave. Këto qeliza të modifikuara gjenetikisht prodhojnë molekula, kimikate, polimere, proteina dhe substanca të tjera, të cilat përdoren për shembull në industrinë farmaceutike, ushqimore dhe kimike. Për të çliruar molekulat e prodhuara në brendësi të qelizave të tilla të bioinxhinieruara, liza tejzanor është një metodë e zakonshme për të prishur muret e qelizave dhe për të transferuar substancat e synuara në lëngun përreth. Lexoni më shumë rreth lizës së qelizave të bioinxhinieruara!

    Ultrasonik DNA prerje

    Forcat e prerjes tejzanor janë një metodë e përdorur zakonisht për lirimin e molekulave, organeleve dhe proteinave nga brendësia e qelizës, si dhe për të thyer fijet e ADN-së në copa. Kavitacioni akustik thyen muret dhe membranat qelizore për të nxjerrë ADN-në nga qelizat dhe për të gjeneruar fragmente prej rreth 600 – 800 bp në gjatësi, e cila është ideale për analizë.
    Kliko këtu për të mësuar më shumë rreth homogenizuesit tejzanor për fragmentimin e ADN-së!

    Literatura / Referencat


    Ultrasonikë me performancë të lartë! Gama e produkteve Hielscher mbulon spektrin e plotë nga aparati ultratingullor kompakt laboratorik mbi njësitë e sipërme të stolit deri te sistemet tejzanor të plotë industrial.

    Hielscher Ultrasonics prodhon homogjenizues tejzanor me performancë të lartë nga laboratormadhësia industriale.


    Ne do të jemi të lumtur të diskutojmë procesin tuaj.

    Le të kontaktojmë.