Liza ultrasonike e E. Coli

Bakteret E. coli janë bakteret më të përdorura në mikrobiologji dhe bioteknologji.
Pajisjet ultrasonike për shpërbërjen e qelizave japin rezultate të besueshme dhe të riprodhueshme për lizën e E. coli.
Kavitacioni dhe forcat prerëse intensive, por të kontrollueshme me saktësi, sjellin shpërbërje të plotë dhe rendimente të larta ekstraktimi (p.sh. proteina, ADN).

Pse shpërbërja ultrasonike e qelizave të E. coli është metoda e preferuar?

Homogjenizuesit ultrasonikë ose ultrasonikatorët me sondë ofrojnë disa përparësi për lizën e E. coli, pasi ultratingujt intensivë shpërbëjnë me efikasitet muret dhe membranat qelizore. Ultrasonikatorët me sondë përdoren gjerësisht për lizën e E. coli për arsyet e mëposhtme:

Shpërbërje efikase e mureve qelizore: E. coli ka një mur qelizor gjysmë të ngurtë të përbërë nga peptidoglikani, i cili mund të jetë i vështirë për t’u shpërbërë me metodat tradicionale të lizës. Një ultrasonikator me sondë gjeneron valë ultrasonike intensive që krijojnë flluska kavitacioni në lëngun përreth qelizave. Kur këto flluska kolapsojnë, ato gjenerojnë rryma lëngu me shpejtësi të lartë dhe valë goditëse që shkaktojnë shpërbërjen mekanike të mureve qelizore, duke çliruar në mënyrë efikase përmbajtjen qelizore, siç janë biomolekulat.

Depërtim i përmirësuar: Valët ultrasonike të gjeneruara nga sonda / sonotroda mund të depërtojnë thellë në mostër, duke arritur një numër më të madh qelizash të E. coli dhe duke i trajtuar ato në mënyrë të njëtrajtshme. Kjo ndihmon që liza të jetë më uniforme në të gjithë mostrën, duke sjellë efikasitet më të lartë të shpërbërjes së qelizave.

Kohë më e shkurtër përpunimi: Energjia e transmetuar nga ultrasonikatori me sondë është shumë e përqendruar dhe e lokalizuar, duke sjellë lizë të shpejtë dhe efikase të qelizave. Krahasuar me metoda të tjera, si shpërbërja me rruaza ose liza enzimatike, trajtimi me ultratinguj mund të realizojë lizën e E. coli brenda minutash apo edhe sekondash. Ndërsa shumë teknika alternative, si ngrirja dhe shkrirja, kërkojnë disa cikle trajtimi, liza ultrasonike i hap qelizat në një hap të vetëm të procesit.

Kontrolli i temperaturës: Ultrasonikatorët me teknologjinë më të fundit janë të pajisur me sensorë temperature dhe softuer inteligjent, i cili mundëson caktimin e një temperature maksimale të procesit. Ultrasonikatori ndalon automatikisht kur arrihet kufiri i temperaturës dhe nis procesin e trajtimit me ultratinguj kur arrihet një temperaturë e paracaktuar. Ftohja e mostrave në një banjë me akull është një metodë e thjeshtë për ta mbajtur të ulët temperaturën e mostrës dhe për të parandaluar degradimin e saj nga nxehtësia.

Mundësia e rritjes së shkallës: Ultrasonikatorët me sondë janë të disponueshëm në madhësi të ndryshme, nga pajisjet që mbahen në dorë deri te modelet industriale në shkallë të gjerë. Kjo i bën të përshtatshëm për përpunimin e vëllimeve të vogla në laborator ose për rritjen e shkallës për aplikime më të mëdha të biopërpunimit, p.sh. prodhimin e vaksinave ose biosintezën e molekulave.

Shumëanshmëria: Ultrasonikatorët mund të përdoren për aplikime të ndryshme përtej lizës qelizore, si fragmentimi i ADN-së nga forcat prerëse, ekstraktimi i proteinave, homogjenizimi i indeve, dispergimi i nanogrimcave dhe emulsifikimi. Prandaj, investimi në një ultrasonikator me sondë ofron shumëanshmëri në mjediset kërkimore ose industriale.

Aparatet me ultratinguj të tipit sondë, si UP200St, janë homogjenizues të besueshëm të indeve dhe shpërbërës të besueshëm të qelizave, prandaj përdoren gjerësisht për përgatitjen e mostrave në gjenetikë, p.sh., për lizën e E.coli

Ekstraktimi i proteinave nga qelizat e E.coli kryhet me efikasitet me sondën ultrasonike UP200St

Ultrasonikatori me sondë ofron shumë përparësi për lizën e E. coli. Kontrolli i besueshëm dhe i saktë i parametrave të procesit ultrasonik mundëson optimizimin e parametrave të punës, si fuqia, kohëzgjatja dhe manipulimi i mostrave, për të arritur rezultatet e dëshiruara.

Ky udhëzues shpjegon cili lloj sonikatori është më i përshtatshëm për detyrat tuaja të përgatitjes së mostrave, si liza, shpërbërja e qelizave, izolimi i proteinave dhe fragmentimi i ADN-së dhe ARN-së në laboratorë, analiza dhe kërkime shkencore. Zgjidhni llojin ideal të sonikatorit sipas zbatimit tuaj, vëllimit të mostrës, numrit të mostrave dhe kapacitetit të përpunimit. Hielscher Ultrasonics ka homogjenizuesin ultrasonik ideal për ju!

Fragmentimi i ADN-së me ultratinguj përdoret shpesh si hap i përgatitjes së mostrave në sekuencimin e gjeneratës së re (NGS)

Analiza elektroforetike të ADN-së gjenomike të E. coli EDL933, të trajtuar me ultratinguj për 0 – 15 min. L tregon shkallëzuesin e ADN-së.
(studimi dhe imazhi: ©Basselet et al. 2008)

Shpërbërja e qelizave me anë të kavitacionit ultrasonik

Homogjenizuesit ultrasonikë me sondë punojnë me rreth 20 000 cikle në sekondë (në 20kHz) dhe shkaktojnë kavitacion në lëngje ose suspensione. Kavitacioni akustik krijon zona mikroskopike me presione të ngjashme me ato të vakumit dhe temperatura të larta, të cilat i copëtojnë qelizat. Megjithëse temperaturat mund të arrijnë disa mijëra gradë Celsius, vëllimet e kavitacionit janë aq të vogla sa nuk e ngrohin ndjeshëm procesin. Kavitacioni akustik dhe forcat prerëse të gjeneruara nga ultratingujt shpojnë ose çajnë membranën qelizore të qelizave bakteriale si E.coli. Pajisjet ultrasonike Hielscher mundësojnë kontrollin e saktë të parametrave të procesit, si intensiteti i ultratingujve, amplituda, energjia e dhënë dhe temperatura. Kështu, procesi i lizës ultrasonike mund të përshtatet në mënyrë optimale me llojin e qelizës, kulturën qelizore dhe qëllimin e procesit.

Përparësitë e lizës ultrasonike

kontroll i saktë i lizës (intensiteti, amplituda, temperatura)
rezultate të besueshme dhe të riprodhueshme
përshtatje optimale me mostrat specifike
kontroll i temperaturës
për mostra nga shumë të vogla deri në shumë të mëdha (nga µL deri në litra)
trajtim tërësisht mekanik
përdorim i lehtë dhe i sigurt
rritje lineare e shkallës nga laboratori në prodhim

Pajisja me ultratinguj VialTweeter mundëson përgatitjen e njëkohshme të mostrave në deri në 10 flakonë në të njëjtat kushte procesi. (Klikoni për ta zmadhuar!)

VialTweeter për lizë ultrasonike

Homogjenizuesi ultrasonik kundrejt teknikave të tjera të lizës

Ndërsa liza kimike dhe ajo enzimatike mund të jenë problematike – pasi liza kimike mund të ndryshojë strukturat e proteinave dhe të sjellë probleme gjatë pastrimit, kurse liza enzimatike kërkon kohë të gjata inkubimi dhe nuk është e riprodhueshme – shpërbërja ultrasonike është një metodë e sofistikuar dhe e shpejtë e shpërbërjes qelizore.
Liza ultrasonike bazohet vetëm në forca mekanike. Nuk shtohen kimikate; trajtimi me ultratinguj çan murin qelizor përmes forcave prerëse. Liza kimike mund të ndryshojë strukturën e proteinave dhe të sjellë probleme gjatë pastrimit. Shpërbërja enzimatike kërkon kohë të gjata inkubimi dhe nuk është e riprodhueshme. Shpërbërja ultrasonike e qelizave bakteriale të E.coli është e shpejtë, e thjeshtë, e besueshme dhe e riprodhueshme. Për këtë arsye, pajisjet ultrasonike Hielscher përdoren në laboratorë biologjikë dhe biokimikë në mbarë botën për përgatitjen e mostrave, procedurat paraanalitike, diagnostikimin in vitro dhe analiza të shumëllojshme.

Rekomandime të përgjithshme për lizën ultrasonike

Trajtimi me ultratinguj është teknika më e përdorur për lizën e sasive shumë të vogla, mesatare dhe të mëdha të suspensioneve qelizore – nga pikolitra deri në 100L/hr (duke përdorur një qelizë rrjedhjeje ultrasonike). Qelizat lizohen nga forcat prerëse në lëng dhe kavitacioni. Edhe ADN-ja fragmentohet nga forcat prerëse gjatë trajtimit me ultratinguj, prandaj nuk është e nevojshme të shtohet DNazë në suspensionin qelizor.

Kontrolli i temperaturës gjatë lizës ultrasonike të E.coli
Duke e ftohur paraprakisht mostrën dhe duke e mbajtur mbi akull gjatë trajtimit me ultratinguj, degradimi termik i mostrës mund të parandalohet lehtësisht.
Në kushte ideale, mostrat duhet të mbahen të ftohta si akulli gjatë lizës, por për shumicën e mostrave mjafton që temperatura të mos ngrihet mbi temperaturën e kulturës ose të burimit të indit. Prandaj rekomandohet që suspensioni të mbahet mbi akull dhe të trajtohet me disa impulse të shkurtra ultrasonike prej 5–10 sec dhe pauza prej 10–30 sec. Gjatë pauzave, nxehtësia mund të shpërndahet për të rivendosur një temperaturë të ulët. Për mostra qelizore më të mëdha, ofrohen reaktorë të ndryshëm me qelizë rrjedhjeje dhe me këmisha ftohëse.
Lexoni këtu këshilla dhe rekomandime të hollësishme për një lizë ultrasonike të suksesshme!

Protokolle për përgatitjen ultrasonike të lizateve të E. coli

Studiuesit përdorin homogjenizuesit ultrasonikë Hielscher për shpërbërjen e qelizave të E.coli. Më poshtë mund të gjeni protokolle të ndryshme të testuara dhe të provuara për lizën e E.coli me homogjenizues ultrasonikë Hielscher, për zbatime të ndryshme që lidhen me E. coli.

Rritja qelizore, lidhja e kryqëzuar dhe përgatitja e ekstrakteve qelizore të E. coli me ultratinguj

Për ChIP-Chip të SeqA dhe ARN-polimerazës, E. coli MG1655 ose MG1655 ΔseqA u kultivua në 37°C deri në një OD₆₀₀ prej rreth 0,15 në 50 ml LB (+ 0,2% glukozë), përpara se të shtoheshin 27 μl formaldehid (37%) për ml mjedis (përqendrimi përfundimtar 1%). Lidhja e kryqëzuar u krye me tundje të ngadaltë (100 rpm) në temperaturën e dhomës për 20 min, e ndjekur nga ndalimi i reaksionit me 10 ml glicinë 2,5 M (përqendrimi përfundimtar 0,5 M). Për eksperimentet e goditjes termike, E. coli MG1655 u kultivua në 65 ml mjedis LB në 30°C deri në një OD₆₀₀ prej rreth 0,3. Më pas, 30 ml kulturë u transferuan në një balonë të ngrohur paraprakisht në 43°C dhe pjesa e mbetur u mbajt në 30°C. Lidhja e kryqëzuar dhe ndalimi i reaksionit u kryen siç u përshkrua më sipër, me përjashtimin që qelizat u mbajtën në 30 ose 43°C për 5 min përpara tundjes së mëtejshme të ngadaltë në temperaturën e dhomës. Qelizat u mblodhën me centrifugim dhe u lanë dy herë me TBS të ftohtë (pH7.5). Pas risuspendimit në 1 ml tampon lize (10 mM Tris (pH 8,0), 20% saharozë, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lizozimë) dhe inkubimit në 37°C për 30 min, të ndjekur nga shtimi i 4 ml tampon IP, qelizat u trajtuan me ultratinguj mbi akull 12 herë nga 30 sec, me pushime prej 30 sec, duke përdorur procesorin me ultratinguj Hielscher UP400St me fuqinë të vendosur në 100%. Pas centrifugimit për 10 min në 9000 g, alikuota prej 800 μl të supernatantit u ruajtën në -20°C. (Waldminghaus 2010)

Mbiprodhimi dhe pastrimi i enzimave me një sondë ultrasonike

Për mbiprodhimin e proteinave të etiketuara me dekahistidinë (His10), E. coli BL21(DE3) u transformua me konstrukte pET19b. Një parakulturë e rritur gjatë natës u mblodh me centrifugim dhe 1% u përdor për të inokuluar një kulturë për shprehjen e proteinave. Qelizat që mbartnin pET19mgtB u kultivuan në 22°C deri në një dendësi optike në 600 nm (OD600) prej 0,7. Kultura u transferua në 17°C dhe u induktua me 100 μM IPTG. Pas 16 h, kultura u mblodh me centrifugim në 7 500 × g në 4°C. Qelizat u risuspenduan në solucion fiziologjik të tamponuar me fosfat (PBS) 50 mM me 0,3 M NaCl në pH 7,4 dhe u shpërbënë me trajtim me ultratinguj, duke përdorur një sonotrodë S2 me mikromajë në aparatin me ultratinguj Hielscher UP200St, me një cikël prej 0,5 dhe një amplitudë prej 75%.
Mbiprodhimi i GtfC të etiketuar me dekahistidinë u induktua në 37°C në një OD₆₀₀ prej 0,6 me 100 μM IPTG. Qelizat më pas u inkubuan për 4 h, u mblodhën dhe iu nënshtruan lizës siç u përshkrua më sipër për MgtB.
Ekstraktet qelizore bruto u centrifuguan në 15 000 × g dhe 4°C për të sedimentuar mbetjet qelizore. Ekstraktet e kthjelluara u ngarkuan në kolona HisTrap FF Crude prej 1-ml duke përdorur një sistem ÄKTAprime Plus. Enzimat u pastruan sipas protokollit të prodhuesit për eluimin me gradient të proteinave të etiketuara me His. Tretësirat e proteinave të eluuara u dializuan dy herë kundrejt 1 000 vëllimeve të PBS 50 mM, pH 7,4, me 0,3 M NaCl në 4°C. Pastrimi u analizua me SDS-PAGE 12%. Përqendrimi i proteinës u përcaktua me metodën Bradford duke përdorur Roti-Quant. (Rabausch et al. 2013)

Ekstraktimi i proteinës nga bakteret E. coli me ultratinguj
Një proteinë karrem me interes (në këtë rast, MTV1 nga Arabidopsis thaliana) bashkohet me një etiketë GST dhe shprehet në qelizat BL21 të Escherichia coli (E. coli).

Merrni nga një pelet të GST-MTV1 dhe GST (që i korrespondon 50 ml kulturë bakteriale) dhe risuspendojeni secilin në 2,5 mL tampon ekstraktimi të ftohtë si akulli.
Përdorni një aparat me ultratinguj UP100H (të pajisur me sonotrodën MS3 me mikromajë për vëllime të vogla prej rreth 2–5mL) për të shpërbërë qelizat bakteriale derisa të lizohen, gjë që tregohet nga zvogëlimi i opacitetit dhe rritja e viskozitetit. Kjo duhet të kryhet mbi akull dhe rekomandohet trajtimi me ultratinguj në intervale (p.sh. 10 sec trajtim me ultratinguj, të ndjekur nga 10 sec pushim mbi akull e kështu me radhë). Duhet pasur kujdes që trajtimi me ultratinguj të mos kryhet me intensitet tepër të lartë. Nëse vërehet shkumëzim ose formimi i një precipitati të bardhë, intensiteti duhet ulur.
Transferojeni tretësirën e baktereve të lizuara në tuba mikrocentrifugimi prej 1,5 mL dhe centrifugojeni në 4°C, 16 000 x g për 20 min.

Sondat me ultratinguj përdorin forcat e kavitacionit akustik për të shpërbërë qelizat dhe për të nxjerrë molekula dhe ADN nga E.coli.

Aparatet me ultratinguj të tipit sondë, si UP400St përdorin parimin e punës së kavitacionit akustik për lizën efikase të E.coli.

Analiza e shprehjes dhe pastrimi i proteinës rekombinante duke përdorur trajtimin me ultratinguj

Sedimenti i E. coli u trajtua me ultratinguj me ultrasonikatorin Hielscher UP100H. Për këtë qëllim, sedimenti qelizor u risuspendua në tretësirë tampon të ftohur për lizë (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) dhe u ftoh mbi akull për 10 min. Më pas, suspensioni qelizor u trajtua me ultratinguj me 10 impulse të shkurtra prej 10 s, të ndjekura nga intervale prej 30 s për ftohje. Në fund, mbetjet qelizore u larguan me ultracentrifugim në 4°C për 15 min në 14 000 rpm. Për të konfirmuar shprehjen e rPR, supernatanti iu nënshtrua elektroforezës në xhel poliakrilamidi 12% dhe u analizua me SDS-PAGE dhe Western blotting. Pastrimi i rPR u krye duke përdorur rrëshirë Ni2+-NTA (Invitrogen, SHBA) sipas udhëzuesit të prodhuesit. Në këtë fazë u përdor metoda e pastrimit në kushte native. Pastërtia e proteinës së pastruar u vlerësua me elektroforezë në xhel poliakrilamidi 12% dhe ngjyrosje pasuese me blu Coomassie. Përqendrimi i proteinës së pastruar u mat me kompletin Micro BCA për analizën e proteinave (PIERCE, SHBA). (Azarnezhad et al. 2016)

Kjo video paraqet sonotrodën ultrasonike në formë kupe me fuqi 200 vat për dispergimin, homogjenizimin, ekstraktimin ose degazimin e mostrave laboratorike.

Homogjenizues me ultratinguj për lizën e E. coli

Hielscher Ultrasonics projekton, prodhon dhe furnizon homogjenizues me ultratinguj me performancë të lartë për lizën e besueshme dhe efikase të baktereve E. coli dhe të llojeve të tjera të qelizave, indeve dhe kulturave qelizore.
Gama e gjerë e sondave me ultratinguj, si dhe e sistemeve të trajtimit të tërthortë me ultratinguj, na lejon t’ju ofrojmë homogjenizuesin ideal të indeve me ultratinguj për zbatimin tuaj të shpërbërjes së qelizave dhe ekstraktimit.

Projektim, prodhim dhe këshillim – Cilësi e prodhuar në Gjermani

Ultrasonikatorët Hielscher njihen për standardet e tyre më të larta të cilësisë dhe projektimit. Softueri inteligjent, menyja intuitive, cilësimet e programueshme dhe regjistrimi automatik i të dhënave janë vetëm disa nga veçoritë e ultrasonikatorëve Hielscher. Qëndrueshmëria dhe përdorimi i lehtë mundësojnë integrimin pa vështirësi të ultrasonikatorëve tanë në mjediset kërkimore dhe bioteknologjike. Edhe kushtet e vështira dhe mjediset kërkuese përballohen lehtësisht nga ultrasonikatorët Hielscher.

Hielscher Ultrasonics është një kompani e certifikuar sipas ISO dhe i kushton vëmendje të veçantë ultrasonikatorëve me performancë të lartë, të pajisur me teknologji bashkëkohore dhe të lehtë për t’u përdorur. Natyrisht, ultrasonikatorët Hielscher janë në përputhje me CE dhe përmbushin kërkesat e UL, CSA dhe RoHs.

Tabela më poshtë ju jep një ide për kapacitetin e përafërt të përpunimit të ultrasonikatorëve tanë:

Vëllimi i serisë	Prurja	Pajisjet e rekomanduara
pllaka me shumë puse / mikrotitrimi	n.a.	UIP400MTP
CupHorn për flakonë ose gotë kimike	n.a.	Ultrasonic CupHorn
mikroreaktor me rrjedhje me ultratinguj	n.a.	GDmini2
deri në 10 flakonë me 0,5 deri në 1,5mL	n.a.	VialTweeter
0,5 deri në 1,5mL	n.a.	VialTweeter
1 deri në 500mL	10 deri në 200mL/min	UP100H
10 deri në 2000mL	20 deri në 400mL/min	UP200Ht, UP400St
0,1 deri në 20L	0,2 deri në 4L/min	UIP2000hdT
10 deri në 100L	2 deri në 10L/min	UIP4000
n.a.	10 deri në 100L/min	UIP16000
n.a.	më e madhe	grup pajisjesh UIP16000

Na kontaktoni! / Na pyesni!

Videoja paraqet sistemin ultrasonik UIP400MTP për përgatitjen e mostrave, i cili mundëson përgatitjen e besueshme të mostrave në çdo pllakë standarde me shumë puse duke përdorur ultratinguj me intensitet të lartë. Zbatimet tipike të UIP400MTP përfshijnë lizën qelizore, fragmentimin e ADN-së, ARN-së dhe kromatinës, si dhe ekstraktimin e proteinave.

Protokolle shtesë për lizën e E. coli me ultratinguj

Proteina të modifikuara me alicinë në E. coli duke përdorur një VialTweeter me ultratinguj

Përcaktimi i përmbajtjes së grupeve sulfhidrile me analizën me acid 5,5′-ditiobis(2-nitrobenzoik) (DTNB)
Një kulturë e E. coli MG1655 e rritur gjatë natës u përdor për të inokuluar mjedisin minimal MOPS (1:100). Kultura u rrit në kushte aerobe derisa u arrit një A600 prej 0,4. Kultura u nda në tri kultura prej 15-ml për trajtimin me stres. Një kulturë e patrajtuar shërbeu si kontroll negativ. Në njërën nga dy kulturat e mbetura u shtua alicinë 0,79 mM (128 μg ml-1), ndërsa në tjetrën diamid 1 mM. Kulturat u inkubuan për 15 min. Nga secila kulturë u mblodhën 5 ml me centrifugim (8 525 × g, 4°C, 10 min). Qelizat u lanë dy herë me 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, i ruajtur në kushte anaerobe përpara përdorimit) dhe u centrifuguan (13 000 × g, 4°C, 10 min). Qelizat u risuspenduan në tretësirë tampon për lizë (PBS me HCl guanidiniumi 6 mM, pH 7,4) përpara shpërbërjes në 4°C me anë të trajtimit me ultratinguj (VialTweeter ultrasonikator, Hielscher GmbH, Gjermani) (3 × 1 min). Mbetjet qelizore u sedimentuan me centrifugim (13 000 × g, 4 °C, 15 min). Supernatanti u transferua në një kuvetë QS-macro 3,5-ml (10 mm) me një shufër përzierëse magnetike dhe u përzie me 1 ml tretësirë tampon për lizë. Ekstinksioni i mostrave u monitorua në 412 nm me një spektrofotometër Jasco V-650 të pajisur me mbajtësin e kuvetave PSC-718 me temperaturë të kontrolluar, në temperaturën e dhomës. U shtuan 100μl tretësirë 3 mM të acidit ditiobis(2-nitrobenzoik). Ekstinksioni u monitorua derisa arriti ngopjen. Përqendrimi i tioleve u llogarit duke përdorur koeficientin e ekstinksionit ϵ₄₁₂ = 13 700 M^-1 cm^-1 për acidin tio-2-nitrobenzoik (TNB). Përqendrimet qelizore të tioleve u llogaritën bazuar në një vëllim të qelizave të E. coli prej 6,7 × 10^-15 litra dhe një dendësi qelizore prej A600 = 0,5 (e barasvlershme me 1 × 10⁸ qeliza ml^-1 kulturë). (Müller et al. 2016)

Përcaktimi in vivo i glutationit duke përdorur një shpërbërës qelizor ultrasonik

E.coli MG1655 u rrit në mjedis minimal MOPS në një vëllim total prej 200ml derisa u arrit një A600 prej 0,5. Kultura u nda në kultura 50-ml për trajtim me stres. Pas 15 min inkubimi me 0,79 mM alicinë, 1 mM diamid ose dimetil sulfoksid (kontroll), qelizat u mblodhën me centrifugim në 4 000g në 4°C për 10 min. Qelizat u lanë dy herë me tretësirë tampon KPE përpara risuspendimit të sedimenteve në 700µl tretësirë tampon KPE. Për deproteinizim, u shtuan 300l acid sulfosalicilik 10% (w/v) përpara shpërbërjes së qelizave me ultratinguj (3 x 1 min; VialTweeter ultrasonikator). Supernatantet u mblodhën pas centrifugimit (30 min, 13 000g, 4°C). Përqendrimet e acidit sulfosalicilik u ulën në 1% duke shtuar 3 vëllime tretësire tampon KPE. Matjet e glutationit total dhe GSSG u kryen siç përshkruhet më sipër. Përqendrimet qelizore të glutationit u llogaritën bazuar në një vëllim të qelizave të E. coli prej 6,7×10^-15 litra dhe një dendësi qelizore prej A600 0,5 (e barasvlershme me 1×10⁸ qeliza ml^-1 kulturë). Përqendrimet e GSH u llogaritën duke zbritur 2[GSSG] nga glutationi total. (Müller et al. 2016)

Shprehja e mAspAT njerëzore në E. coli duke përdorur një homogjenizues ultrasonik

Kolonia e vetme e E. coli BL21 (DE3) që mbartte vektorin e shprehjes në 30 mL mjedis Luria-Bertani (LB) që përmbante 100μg/mL ampicilinë, më pas u kultivua në 37ºC derisa dendësia optike (OD₆₀₀) arriti 0,6. Qelizat u mblodhën me centrifugim në 4 000 × g për 10 min dhe u risuspenduan në 3L mjedis të freskët LB që përmbante 100μg/mL ampicilinë.
Më pas, shprehja e proteinës u induktua me 1 mM izopropil β-ᴅ-1-tiogalaktopiranozid (IPTG) për 20 h në 16ºC. Qelizat u mblodhën me centrifugim në 8 000 × g për 15 min dhe u lanë me tretësirë tampon A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Nga 3 L kulturë u përftuan afërsisht 45g qeliza (peshë e lagësht). Pas centrifugimit, sedimentet qelizore u risuspenduan në 40 mL (për 1 L kulturë) tretësirë tampon ekstraktimi A, të ftohtë si akulli, dhe iu nënshtruan lizës me ultratinguj në temperaturë të ftohtë si akulli duke përdorur shpërbërësin qelizor ultrasonik Hielscher UP400St. Lizati qelizor u centrifugua në 12 000 rpm për 15 min për të ndarë fraksionet e tretshme (supernatanti) nga ato të precipituara (sedimenti). (Jiang et al. 2015)

Tema të lidhura

Fakte që ia vlen të dini

E.coli

Escherichia coli (E. coli) është një bakter koliform i gjinisë Escherichia, gram-negativ, anaerob fakultativ dhe në formë shkopi, që gjendet zakonisht në pjesën e poshtme të zorrëve të organizmave me gjak të ngrohtë (endotermëve). Ekziston një numër i madh shtamesh (ose nëntipesh) të E. coli me karakteristika të ndryshme. Shumica e shtameve të E. coli janë të padëmshme për njerëzit, p.sh. shtamet B dhe K-12, të cilat përdoren zakonisht për kërkime në laboratorë. Megjithatë, disa shtame janë të dëmshme dhe mund të shkaktojnë sëmundje të rënda.
E. coli luan një rol të rëndësishëm në inxhinierinë biologjike moderne dhe në mikrobiologjinë industriale, pasi ky bakter manipulohet lehtë. Përdorimet e zakonshme laboratorike shpesh përfshijnë E. coli, p.sh. për të krijuar acid deoksiribonukleik (ADN) rekombinant ose për të shërbyer si organizëm model.
E. coli është një organizëm pritës shumë i gjithanshëm për prodhimin e proteinave heterologe dhe ekzistojnë sisteme të shumta të shprehjes së proteinave për prodhimin e proteinave rekombinante në E. coli. Duke përdorur plazmide që lejojnë shprehjen e proteinave në nivel të lartë, gjenet mund të futen në baktere, gjë që mundëson prodhimin e këtyre proteinave në sasi të mëdha në proceset industriale të fermentimit.
E.coli përdoren si fabrika qelizore për prodhimin e insulinës. Përdorime të tjera përfshijnë përdorimin e qelizave të modifikuara të E. coli për zhvillimin dhe prodhimin e vaksinave dhe enzimave të imobilizuara, për prodhimin e biokarburanteve, si dhe për bioremedim.
Shtami K-12 është një formë mutante e E. coli që mbishpreh enzimën fosfatazë alkaline (ALP). Ky mutacion ndodh për shkak të një defekti në gjenin që kodon vazhdimisht për enzimën. Nëse një gjen prodhon një produkt pa asnjë frenim, kjo njihet si aktivitet konstitutiv. Kjo formë specifike mutante përdoret për izolimin dhe pastrimin e enzimës ALP.
Bakteret E. coli përdoren gjithashtu gjerësisht si fabrika qelizore. Mikrobet e modifikuara me anë të inxhinierisë biologjike (p.sh., bakteret) dhe qelizat bimore mund të përdoren si të ashtuquajtura fabrika qelizore. Këto qeliza të modifikuara gjenetikisht prodhojnë molekula, substanca kimike, polimere, proteina dhe substanca të tjera, të cilat përdoren, për shembull, në industrinë farmaceutike, ushqimore dhe kimike. Për të çliruar molekulat e prodhuara në brendësi të këtyre qelizave të modifikuara me anë të inxhinierisë biologjike, liza me ultratinguj është një metodë e zakonshme për të shpërbërë muret qelizore dhe për të transferuar substancat e synuara në lëngun përreth. Lexoni më shumë rreth lizës së qelizave të modifikuara me anë të inxhinierisë biologjike!

Fragmentimi i ADN-së nga forcat prerëse të ultratingujve

Forcat prerëse të ultratingujve janë një metodë e përdorur zakonisht për të çliruar molekula, organele dhe proteina nga brendësia e qelizës, si dhe për të copëtuar vargjet e ADN-së. Kavitacioni akustik shpërbën muret dhe membranat qelizore për të nxjerrë ADN-në nga qelizat dhe për të krijuar fragmente me gjatësi rreth 600 – 800 bp, gjë që është ideale për analizë.
Klikoni këtu për të mësuar më shumë rreth homogjenizuesve me ultratinguj për fragmentimin e ADN-së!

Literatura / Referencat

Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.

Ultratinguj me performancë të lartë! Gama e produkteve Hielscher mbulon të gjithë spektrin, nga aparati ultrasonik kompakt laboratorik, përmes njësive për tavolinë pune, deri te sistemet ultrasonike plotësisht industriale.

Hielscher Ultrasonics prodhon homogjenizues me ultratinguj me performancë të lartë, nga përmasat laboratorike deri në industriale.