Teknologjia e ultrazërit Hielscher

Ultrasonik Liza nga E. Coli

  • Bakteret E. coli janë bakteret më të përdorura në mikrobiologji dhe bioteknologji.
  • Disruptorët e qelizave tejzanor japin rezultate të besueshme dhe riprodhuese për lizën e E. colit.
  • Kavitaçi intensive dhe ende saktësisht e kontrollueshme dhe forcat qethëse rezultojnë në përçarje të plota dhe yield-et e larta të nxjerrjes (p.sh. proteina, ADN).

Çrregullimi i qelizave nga kavitacioni

Bakteret Escherichia coli janë lysed me besueshmëri duke përdorur homogenizuesit e indeve me ultratinguj.Homogjenizuesit e llojit me sondë tejzanor veprojnë me përafërsisht. 20.000 cikle për sekondë (në 20kHz) dhe shkaktojnë cavitation në lëngje ose supsensions. Zonat mikroskopike të cavitation akustike të presioneve të ngjashme me vakuum dhe temperaturat e larta që i heqin qelizat larg. Megjithëse temperaturat mund të arrijnë disa mijë gradë Celsius, vëllimet e kavitacionit janë kaq të vogla, saqë nuk e ngrojnë procesin në mënyrë të konsiderueshme. Kavitaizmi akustik dhe forcat qethëse të krijuara me ultratinguj mund të vrasin ose thyejnë membranën qelizore të E. coli – në varësi të vendosjes së pajisjes së homogenizuesit tejzanor.

Avantazhet e lizës ultratinguj

  • kontrolli i saktë i lizës (intensiteti, amplitudë, temperatura)
  • përshtatje optimale ndaj mostrave specifike
  • kontrollin e temperaturës
  • për mostra shumë të vogla ose shumë të mëdha (μL në litra)
  • trajtim mekanik i pastër
  • shkallë lineare nga laboratori në prodhim
Pajisja tejzanor VialTweeter mundëson përgatitjen e njëkohshme të mostrës deri në 10 shishka nën të njëjtat kushte procesi. (Kliko per te zmadhuar!)

VialTweeter për lizë ultrasonike

Kërkesë informacioni





Ndërsa liza kimike dhe enzimatike mund të jetë problematike – pasi liza kimike mund të ndryshojë strukturat e proteinave dhe të paraqesë probleme të pastrimit dhe liza enzimatike kërkon kohë të gjata inkubimi dhe nuk është e riprodhueshme – përçarje tejzanor është një metodë e sofistikuar, e shpejtë e qelizave të përçarjes.
Liza tejzanor bazohet vetëm në forcat mekanike. Asnjë kimik nuk është shtuar, sonication thyen mur qelizor nga forcat qethje. Lizat kimike mund të ndryshojnë strukturën e proteinave dhe të paraqesin probleme të pastrimit. përçarje enzimatike kërkon kohë të gjata inkubimi dhe nuk është e riprodhueshme.

Rekomandime të Përgjithshme

UP400St ultrasonicator me reaktorin e rrjedhësSonication është teknikë më popullore për lysimin e sasive shumë të vogla, të mesme dhe të mëdha të pezullimeve qelizore – nga pico-litra deri në 100L / orë (duke përdorur një qelizë rrjedhëse tejzanor). Qelizat janë lysed nga qethje të lëngshme dhe cavitation. ADN është gjithashtu i prerë gjatë sonication, kështu që nuk është e nevojshme për të shtuar DNase në pezullimin qelizë.
Kontrolli i temperaturës:
Me ftohjen paraprake të mostrës dhe mbajtjen e mostrës gjatë sonikimit në akull, degradimi termik i mostrës mund të pengohet lehtësisht.
Në rastin ideal, mostrat duhet të mbahen akull-ftohtë gjatë lizës, por për shumicën e mostrave është e mjaftueshme nëse temperatura nuk rritet mbi temperaturën e kulturës ose burimit të indeve. Prandaj rekomandohet, për të mbajtur pezullimin në akull dhe për të sonicate me disa pulses shkurtër ultrasonics prej 5-10 sek dhe pushimet e 10-30 sek. Gjatë pushimeve, nxehtësia mund të zhduket në mënyrë që të rivendosë një temperaturë të ulët. Për mostrat më të mëdha të qelizave, janë të disponueshme reaktorë të ndryshëm qelizash rrjedhëse me xhaketa ftohëse

Protokollet për Përgatitjen e Lysates E. Coli

Analiza e shprehjes dhe pastrimi i proteinave rekombinante

Pellgu E. coli ishte sonicated me një sistem tejzanor UP100H (Hielscher). Për këtë qëllim, pellgu qelizor u ri-suspendohej në tampon lizi të ftohtë (50 mM Tris-HCl pH = 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) dhe ftohet në akull për 10 min. Pastaj, pezullimi i qelizës u zhduk me 10 breshëri të shkurtra prej 10 s pasuar nga intervali prej 30 s për ftohje. Së fundi, mbetjet e qelizave u hoqën nga ultracentrifugimi në 4 ° C për 15 minuta në 14000 rpm. Për konfirmimin e shprehjes rPR, supernatanti u drejtua me xhel 12% të poliakrilamidit dhe u analizua nga SDS-PAGE dhe Western blotting. Pastrimi i rPR është bërë duke përdorur Ni2+-NTA rrëshirë (Invitrogen, USA) sipas udhëzuesit të prodhuesit. Në këtë fazë, u përdor metoda e pastrimit amtare. Pastërtia e proteinës së pastruar u vlerësua duke përdorur elektroforezë në xhel poliakrilamid 12% dhe ngjyrosje pasuese Blue Coomassie. Koncentrimi i proteinave të pastruara u mat nga mikroskopi i analizës së proteinave BCA (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al, 2016)

Disruptor qelizor tejzanor UP100H (100W) për lizë, përçarje qelizash dhe prerje të ADN-së.

Homogenizues tejzanor UP100H (100W)

Rritja e qelizave, ndërlidhja dhe përgatitja e ekstrakteve të qelizave E. coli

Për SeQA dhe RNA polimeraza ChIP-Chip E. coli MG1655 ose MG1655 ΔseqA u rrit në 37 ° C në një OD600 nga rreth 0.15 në 50 ml LB (+ 0.2% glukozë) para se të shtohen 27 μl formaldehide (37%) për ml medie (përqendrimi final 1%). Crosslinking u krye me treshe të ngadalta (100 rpm) në temperaturën e dhomës për 20 min pasuar nga shuarja me 10 ml 2,5 M glycine (përqendrimi final 0.5 M). Për eksperimentet e nxehtësisë, E. coli MG1655 u rrit në 65 ml LB në 30 ° C në një OD600 rreth 0.3. Më pas, 30 ml të kulturës u transferua në një pllakë para-ngrohur në 43 ° C dhe pjesa tjetër u mbajt në 30 ° C. Crosslinking dhe shuarje ishte siç përshkruhet më lart, përveç se qelizat janë mbajtur në 30 ose 43 ° C për 5 min para se të dridhje të tjera të ngadalta në temperaturën e dhomës. Qelizat u grumbulluan me centrifugim dhe lanë dy herë me TBS të ftohtë (pH7.5). Pas ri-suspendimit në 1 ml lysis buffer (10 mM Tris (pH 8,0), 20% saharoze, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg / ml lizozim) dhe inkubim në 37 ° C për 30 min pasuar nga shtimi i 4 ml IP tampon, qelizat u sonicated në akull me 12 herë 30 sec dhe 30 sek pushime në një UP400St procesor tejzanor (Hielscher Ultrasonics GmbH) me fuqi 100%. Pas centrifugimit për 10 min në 9000 g, aliquotes 800 uL të supernatantit u ruajtën në -20 ° C. (Waldminghaus 2010)

Mbiprodhimi dhe pastrimi i enzimeve.

Për mbiprodhim të proteinave të decahistidine (His10), E. coli BL21 (DE3) u transformua me konstruksione pET19b. Një parakulturë njëditore është korrur me centrifugim dhe 1% është përdorur për të inokuluar një kulturë të shprehjes. Qelizat që mbanin pET19mgtB u rritën në 22 ° C deri në një densitet optik në 600 nm (OD600) prej 0.7. Kultura u transferua në 17 ° C dhe u shkaktua nga 100 μM IPTG. Pas 16 orësh, kultura u korr nga centrifugimi në 7,500 × g në 4 ° C. Qelizat u ri-suspenduan në 50 mM kripur me fosfat-buffered (PBS) me 0.3 M NaCl në pH 7.4 dhe u ndërprenë me ultrasonication me një sonotrode mikro-tip S2 në UP200St ultrasonicator (Hielscher, Teltow, Gjermani) në një cikël prej 0.5 dhe një amplitudë prej 75%.
Mbiprodhimi i dektahistidine-tagged GtfC ishte nxitur në 37 ° C në një OD600 e 0.6 me 100 μM IPTG. Qelizat pastaj u inkubuan për 4 orë, korrur, dhe lysed siç u tha më lart për MgtB.
Ekstraktet e qelizave të papërpunuara u centrifuguan në 15,000 × g dhe 4 ° C për të sedimentuar mbeturinat e qelizave. Ekstraktet e sqaruara u ngarkuan në kolonat e grimcave HisTrap FF 1 ml duke përdorur një sistem ÄKTAprime Plus (GE Healthcare). Enzimat janë pastruar sipas protokollit të prodhuesit për eluentin e gradientit të proteinave të Etiketës së tij. Zgjidhjet e proteinave të eluuara u dializuan dy herë me 1.000 vëllime 50 mM PBS, pH 7.4, me 0.3 M NaCl në 4 ° C. Pastrimi u analizua me 12% SDS-PAGE. Përqendrimi i proteinës është përcaktuar me metodën Bradford duke përdorur Roti-Quant (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Gjermani). (Rabausch et al 2013)

Nxjerrja e proteinave nga E. coli Bakteret
Një proteinë me interes të interesit (në këtë rast, MTV1 e Arabidopsis thaliana) është shkrirë në një tag GST dhe shprehet në qelizat BL21 Escherichia coli (E. coli).
1. Merrni një pellg të GST-MTV1 dhe GST (që korrespondon me kulturën bakteriale 50 ml) dhe resuspend çdo në 2.5 ml tampon ekstrakt të ftohtë të akullit.
2. Përdorni një ultrasonicator UP100H (e pajisur me mikrotip-sonotrode MS3 për vëllime të vogla (2-5mL)) për të prishur qelizat bakteriale derisa ato të jenë lysed, e cila është treguar me paketë të reduktuar dhe viskozitet të rritur. Kjo duhet të kryhet në akull, dhe rekomandohet të kryhet sonicimi në intervale (p.sh. sonicating 10 sec pas 10 sec në akull dhe kështu me radhë). Kujdes duhet të merret që të mos dëgjohet me intensitet shumë të lartë. Nëse zbulohet shkumëzimi ose formimi i një precipitati të bardhë, intensiteti duhet të ulet.
3. Transferoni bakterin tretës në tubat e mikrocentrifugës 1,5 ml dhe centrifugoni në 4 ° C, 16,000 xg për 20 min.

Proteinat e modifikuara me Allicin në E. coli

VialTweeter është një ultrasonicator komod për homogjenizimin e mostrës së vogëlPërcaktimi i Përmbajtjes Sulfhydryl nga 5,5'-Dithiobis (acid 2-nitrobenzoic acid) (DTNB)
Një kulturë E. coli MG1655 brenda natës është përdorur për të inokuluar mediumin minimal MOPS (1: 100). Kultura u rrit aerobi deri në arritjen e një A600 prej 0.4. Kultura u nda në tri kultura 15 ml për trajtimin e stresit. Një kulturë e patrajtuar shërbeu si një kontroll negativ. 0.79 mM allicin (128 μg ml-1) ose 1 mM diamide u shtuan në njërën nga dy kulturat e mbetura secila. Kulturat u inkubuan për 15 minuta. 5 ml të secilës kulturë janë korrur me centrifugim (8,525 × g, 4 ° C, 10 min). Qelizat u lahen dy herë me 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4, ruajtur anaerobisht para përdorimit) dhe centrifuguar (13.000 × g, 4 ° C, 10 min). Qelizat u ri-suspenduan në tampon lysis (PBS me 6 mM guanidinium HCl, pH 7,4) para përçarje në 4 ° C nga ultrasonication (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, Gjermani) (3 × 1 min). Mbeturinat e qelizave u mbushën me centrifugim (13,000 × g, 4 ° C, 15 min). Supernatanti u transferua në një cuvë QS-makro 3.5 ml (10 mm) me një shirit magnetik përzierës dhe u përzier me 1 ml tampon lizi. Zhdukja e mostrave u monitorua në 412 nm me një spektrofotometër Jasco V-650 të pajisur me mbajtësin e qelizës së kontrolluar me temperaturë të kontrolluar PSC-718 (Jasco) në temperaturën e dhomës. U shtuan 100μl një solucion 3 mM dithiobis (acid 2-nitrobenzoik). Zhdukja është monitoruar derisa të arrihet mbushja. Llogaritja e përqendrimit tiol është kryer duke përdorur koeficientin e zhdukjes ε412 = 13,700 M-1 cm-1 për acidin thio-2-nitrobenzoik (TNB). Përqendrimet e tioleve celulare u llogaritën në bazë të një vëllimi të qelizave E. coli prej 6.7 × 10-15 litër dhe një dendësi qelizore të A600 = 0.5 (ekuivalent me 1 × 108 qeliza ml-1 kultura). (Müller et al. 2016)

Përcaktimi në Vivo Glutathione

E.coli MG1655 u rrit në mesatare minimale MOPS në një vëllim total prej 200ml deri në A600 prej 0.5 është arritur. Kultura u nda në kultura 50 ml për trajtimin e stresit. Pas 15 minutash inkubacioni me 0.79 mM allicin, 1 mM diamide, ose dimetil sulfoksid (kontroll), qelizat u korrnuan në 4.000 g në 4 ° C për 10 min. Qelizat u lahen dy herë me tampon KPE para rinisimit të fishekëve në 700μl të tamponës KPE. Për deproteinimin, 300l 10% (w / v) acid sulfosalicilik u shtuan para përçarjes së qelizave nga ultrasonication (3 x 1 min; VialTweeter ultrasonicator). Supernatantët u mblodhën pas centrifugimit (30 min, 13,000g, 4 ° C). Përqendrimet e acideve sulfosalicilike u zvogëluan në 1% me shtimin e 3 vëllimeve të tamponit KPE. Matjet e glutationit total dhe GSSG janë kryer siç përshkruhet më sipër. Përqendrimet e glutationit qelizor u llogaritën në bazë të një vëllimi të qelizave E. coli të 6.7×10-15 litër dhe një dendësi qelizore të A600 0.5 (ekuivalent me 1×108 qeliza ml-1 kultura). Përqendrimet GSH u llogaritën me zbritjen e 2 [GSSG] nga glutationi total. (Müller et al. 2016)

Disruptor tejzanor për lizë qelizore dhe nxjerrjen e materialit biologjik (Kliko për ta zmadhuar!)

Sondë tip ultrasonicator UP400St

Shprehja e mAspAT Njeriut në E. coli

Disruptor qelizor tejzanor UP400St (400W) për nxjerrjen e lëndës intracelulare (p.sh. proteina, organele, ADN, ARN, etj)Kolonia e vetme e E. coli BL21 (DE3) që përmban vektorin e shprehjes në 30 ml Luria-Bertani (LB) të mesme që përmban 100μg / ml ampicilin, dhe pastaj kultivohet në 37ºC deri në densitetin optik (OD600) arriti 0.6. Qelizat u korrnuan me centrifugim në 4,000 × g për 10 min dhe resuspenduan në 3L medium të freskët LB që përmban 100μg / mL ampicilin.
Më pas, shprehja e proteinave u nxit me 1 mM izopropil β-ᴅ-1-tiogalaktopiranozid (IPTG) për 20 orë në 16ºC. Qelizat u korrnuan me centrifugim në 8,000 × g për 15 min dhe larë me tampon A (20 mM NaH2P04, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Përafërsisht 45g (pesha e lagur) qelizat janë marrë nga 3 L kulturë. Pas centrifugimit, fishekët qelizorë u resuspenduan në 40 ml (për 1 L kulturë) tampon ekstrakti akull-ftohës A dhe lizoheshin me ultrasonication në temperaturë të ftohtë me akull duke përdorur një UP400St instrument (Dr. Hielscher GmbH, Gjermani). Liza e qelizës u centrifugua në 12,000 rpm për 15 minuta për të ndarë fraksione të tretshme (supernatante) dhe precipituar (pellgu). (Jiang et al 2015)

Tabela më poshtë ju jep një tregues të kapacitetit të përafërt të përpunimit të ultrasonicators tonë:

Vëllimi i Serisë Shkalla e rrjedhjes Devices rekomanduara
05 deri në 1.5mL na VialTweeter
1 deri 500mL 10 deri 200mL / min UP100H
10 deri në 2000 ml 20 deri 400mL / min UP200Ht, UP400St
0.1 deri në 20L 0.2 deri në 4L / min UIP2000hdT
10 deri në 100L 2 deri në 10L / min UIP4000
na 10 deri në 100L / min UIP16000
na më e madhe grup i UIP16000

Na kontaktoni! / Pyet Na!

Ju lutemi përdorni formularin e mëposhtëm, nëse dëshironi të kërkoni informacione shtesë rreth homogjenizimit tejzanor. Ne do të jemi të lumtur t'ju ofrojmë një sistem tejzanor që plotëson kërkesat tuaja.









Ju lutem vini re tonë Politika e privatësisë.


Letërsi / Referencat



Fakte të vlefshme

E.coli

Escherichia coli (E. coli) është një bakter mikroorganizmi gram-negativ, facultativ anaerob, në shufër, e Escherichia gjini që zakonisht gjendet në zorrët e ulëta të organizmave me gjak të ngrohtë (endotermet). Ekzistojnë një numër i madh i shtameve E. coli (ose nëntipe) me karakteristika të ndryshme. Shumica e shtameve të E. coli janë të padëmshme për njerëzit, p.sh. shtamet B dhe K-12 që përdoren zakonisht për aplikime kërkimore në laboratorë. Megjithatë, disa lloje janë të dëmshme dhe mund të shkaktojnë sëmundje serioze.
E. coli luan një rol të rëndësishëm në inxhinieri moderne biologjike dhe mikrobiologji industriale pasi bakteret janë të lehta për t'u manipuluar. Aplikime të përbashkëta laboratorike të cilat përfshijnë shpesh përdorimin e E. coli, p.sh. për të krijuar acid rekombinant deoksiribonukleik (ADN) ose për të vepruar si një organizëm model.
E. coli është një mikpritës shumë i zhdërvjellët për prodhimin e proteinave heterologe dhe sistemet e shumëfishta të shprehjes së proteinave janë në dispozicion për të prodhuar proteinat rekombinante në E. coli. Përdorimi i plazmideve që lejojnë shprehjen e nivelit të lartë të proteinave, gjenet mund të futen në baktere, gjë që mundëson prodhimin e proteinave të tilla në sasi të mëdha në proceset fermentuese industriale.
E.coli përdoren si fabrika qelizore për të prodhuar insulinë. Aplikime të mëtejshme përfshijnë përdorimin e qelizave E. coli të modifikuar për të zhvilluar dhe prodhuar vaksina dhe enzima të imobilizuar, për të prodhuar biokarburantet, si dhe për bioremediation.
Kripë K-12 është një formë mutante e E. coli që mbi-shpreh enzimë Alkaline Phosphatase (ALP). Ky mutacion ndodh për shkak të një defekti në gjenin që vazhdimisht përcakton enzimë. Nëse një gjen prodhon një produkt pa asnjë pengesë, kjo njihet si aktivitet konstituiv. Ky formë specifike mutante përdoret për izolimin dhe pastrimin e enzimës ALP.

Ultrasonik DNA prerje

Forcat e qethjes me ultratinguj janë një metodë e zakonshme që përdoret për t'u ndarë nga qeliza dhe për të prishur fijet e ADN-së në copa. Cavitation akustike thyen muret qelizore dhe membranat për nxjerrjen e ADN nga qelizat dhe gjenerojnë fragmente prej rreth 600 – 800 bp në gjatësi, e cila është ideale për analizë.
Kliko këtu për të mësuar më shumë rreth homogenizuesit tejzanor për fragmentimin e ADN-së!