Liza me ultratinguj e mostrave të Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster përdoret gjerësisht në laboratorë si organizëm model. Prandaj, hapat e përgatitjes paraanalitike, si liza, shpërbërja e qelizave, ekstraktimi i proteinave dhe prerja e ADN-së me forca prerëse në mostrat e Drosophila melanogaster, duhet të kryhen shpesh. Dezintegruesit me ultratinguj janë të besueshëm dhe efikasë dhe mund të përdoren për të kryer me lehtësi detyra të ndryshme, si liza, ekstraktimi i proteinave ose fragmentimi i ADN-së, vetëm duke rregulluar parametrat e procesit me ultratinguj. Homogjenizuesit me ultratinguj janë kështu mjete fleksibël me një gamë të gjerë zbatimesh.

Liza me ultratinguj dhe ekstraktimi i proteinave

Liza, solubilizimi i qelizave, homogjenizimi i indeve dhe ekstraktimi i proteinave janë detyra tipike për dezintegruesit me ultratinguj në laboratorët biologjikë. Dezintegruesit me ultratinguj dhe pajisjet për shpërbërjen e qelizave janë shumë të përshtatshëm për homogjenizimin e indeve shtazore, insekteve (p.sh., Drosophila melanogaster, C. elegans) ose ekzemplarëve bimorë. Zbatime të mëtejshme të trajtimit me ultratinguj janë liza e suspensioneve qelizore dhe sedimenteve qelizore, si edhe ekstraktimi i proteinave brendaqelizore.
Liza me ultratinguj dhe ekstraktimi i proteinave janë procese shumë të besueshme dhe të riprodhueshme, të cilat mund të kryhen në bazë të protokolleve të përcaktuara. Meqë intensiteti i procesit me ultratinguj mund të rregullohet me saktësi nëpërmjet parametrave të sonikimit, si amplituda, mënyra e ciklit / pulsimit, temperatura dhe vëllimi i mostrës, protokollet, pasi të jenë provuar, mund të përsëriten vazhdimisht me të njëjtin rezultat.

Fragmentimi i ADN-së dhe ARN-së me ultratinguj

Pas lizës së qelizave dhe ekstraktimit të proteinave, një hap që kërkohet zakonisht gjatë përgatitjes së mostrave është prerja me forca prerëse dhe fragmentimi i ADN-së, ARN-së dhe kromatinës, p.sh. përpara imunoprecipitimit të kromatinës (ChIP). Fragmentimi i ADN-së dhe ARN-së mund të arrihet në mënyrë të besueshme duke këputur, nëpërmjet forcave fizike, lidhjet kovalente që e mbajnë ADN-në të bashkuar. Kur përdoret prerja fizike, si sonikimi, fillimisht këputen vargjet e ADN-së, pastaj ADN-ja fragmentohet në pjesë më të vogla.
Fragmentimi i ADN-së me ultratinguj është i besueshëm dhe efikas për prerjen e ADN-së në një gjatësi të synuar, p.sh. 500bp (çifte bazash). Përparësitë kryesore të fragmentimit të ADN-së me ultratinguj përfshijnë kontrollin e saktë të parametrave dhe intensitetit të procesit me ultratinguj. Parametrat e procesit me ultratinguj mund të rregullohen duke përcaktuar me saktësi intensitetin, ciklet dhe kohën e sonikimit. Kjo bën të mundur krijimin e madhësive të dëshiruara të ADN-së, dhe gjatësia e synuar e ADN-së mund të prodhohet dhe të riprodhohet në mënyrë të besueshme. Prerja e ADN-së me ultratinguj është gjithashtu ideale për krijimin e fragmenteve të ADN-së me peshë të lartë molekulare.

Protokolle për lizën me ultratinguj të Drosophila melanogaster

Më poshtë mund të gjeni protokolle të ndryshme për lizën, ekstraktimin e proteinave dhe fragmentimin e ADN-së ose kromatinës të mostrave të Drosophila me ndihmën e ultratingujve.

Liza me ultratinguj për analizën e imunoprecipitimit me lidhje të kryqëzuara (CLIP)

Analiza CLIP u krye siç është raportuar më parë, me disa modifikime. Afërsisht 20 mg vezore nga femra të tipit të egër me moshë nga 0 deri në 1 ditë iu nënshtruan formimit të lidhjeve të kryqëzuara me rrezatim UV (3 × 2000 μJ/cm2), u homogjenizuan mbi akull në 1 mL tampon RCB (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM saharozë, 1 mM DTT, 1× inhibitorë të proteazave Complete pa EDTA, 1 mM PMSF) të plotësuar me 300 U RNAseOUT dhe u vendosën mbi akull për 30 min. Homogjenati u sonikua mbi akull, me fuqi 80%, pesë herë në intervale sonikimi prej 20 s, me pushime prej 60 s ndërmjet tyre, duke përdorur procesorin me ultratinguj Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) dhe u centrifugua (16 000 × g për 5 min në 4°C). Ekstrakti i tretshëm u pastrua paraprakisht me 20 μl Dynabeads Protein-G për 20 min në 4°C. Pas marrjes së mostrave për imunoblotim dhe përcaktimin sasior të ARN-së hyrëse (1%), HP1 u imunoprecipitua me antitrupin anti-HP1 9A9 nga 450 μl ekstrakt i pastruar paraprakisht, nëpërmjet inkubimit për 4 h me 50 μl Dynabeads Protein-G. Imunoprecipitatet u lanë 4 herë me RCB. Për të eluuar ARN-të e imunoprecipituara, rruazat e sedimentuara u zien në 100 μL ujë UltraPure të trajtuar me DEPC për 5 min. Supernatantit të mbledhur për përgatitjen e ARN-së iu shtuan 900 μL reagent Qiazol. ARN-ja e pastruar u përdor si kallëp për të sintetizuar ADNc duke përdorur oligo dT, heksamerë të rastësishëm dhe transkriptazën e kundërt SuperScript III, sipas protokollit të prodhuesit.
(Cassale et al. 2019)

Liza me ultratinguj për analizën e imunoprecipitimit të kromatinës

Imunoprecipitimi i kromatinës u krye sipas metodës së përshkruar nga Menet, me modifikime të vogla. Afërsisht 20 mg vezore nga femra të tipit të egër, me moshë nga 0 deri në 1 ditë, u homogjenizuan në 1 mL tampon NEB (10 mM HEPES-Na në pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na në pH 8, 0,5 mM EDTA-Na në pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM spermidinë, 0,15 mM sperminë, 1× inhibitorë të proteazave Complete pa EDTA) me një homogjenizues / dispergues me zhytje për 1 min (në 3000 rpm). Homogjenati u transferua në një homogjenizues qelqi Dounce të ftohur paraprakisht dhe u kryen 15 goditje të plota me një piston që përshtatej ngushtë. Më pas, bërthamat e lira u centrifuguan në 6000xg për 10 min në 4°C. Sedimentet që përmbanin bërthamat u risuspenduan në 1 mL NEB dhe u centrifuguan në 20 000 × g për 20 min mbi një gradient saharoze (0,65 mL saharozë 1,6 M në NEB, 0,35 mL saharozë 0,8 M në NEB). Sedimenti u risuspendua në 1 mL NEB dhe formaldehid, me përqendrim përfundimtar të formaldehidit prej 1%. Në bërthama u krijuan lidhje të kryqëzuara për 10 min në temperaturën e dhomës dhe reaksioni u ndal duke shtuar 1/10 vol glicinë 1,375 M. Bërthamat u mblodhën me centrifugim në 6000 × g për 5 min. Bërthamat u lanë dy herë në 1 mL NEB dhe u risuspenduan në 1 mL tampon lize (15 mM HEPES-Na në pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA në pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% deoksikolat natriumi, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroilsarkozinë dhe 1× inhibitorë të proteazave Complete pa EDTA). Bërthamat u trajtuan me ultratinguj duke përdorur një procesor ultrasonik Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) gjashtë herë, me 20 s trajtim aktiv dhe 1 min në akull. Bërthamat e trajtuara me ultratinguj u centrifuguan në 13 000 × g për 4 min në 4°C. Pjesa më e madhe e kromatinës së trajtuar me ultratinguj kishte gjatësi nga 500 deri në 1000 çifte bazash (bp). Për çdo imunoprecipitim, 15 μg kromatinë u inkubuan në prani të 10 μg antitrup monoklonal HP1 9A9 (3 h në 4°C në një rrotë rrotulluese). Më pas, u shtuan 50 μl Dynabeads Protein G dhe inkubimi vazhdoi gjatë natës në 4°C. Supernatantet u hodhën dhe mostrat u lanë dy herë në tampon lize (çdo larje për 15 min në 4 °C) dhe dy herë në tampon TE (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl në pH 8). Kromatina u eluua nga rruazat në dy hapa; fillimisht në 100 μl tampon eluimi 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl në pH 8) në 65°C për 15 min, pasuar nga centrifugimi dhe mbledhja e supernatantit. Materiali i rruazave u ekstraktua sërish në 100 μl TE + 0,67% SDS. Eluati i bashkuar (200 μl) u inkubua gjatë natës në 65°C për të zhbërë lidhjet e kryqëzuara dhe u trajtua me 50 μg/ml RNaseA për 15 min në 65°C dhe me 500 μg/ml proteinazë K për 3 h në 65°C. Mostrat iu nënshtruan ekstraktimit me fenol–kloroform dhe precipitimit me etanol. ADN-ja u risuspendua në 25 μl ujë. Për të maksimizuar analizat molekulare me ADN-në e imunoprecipituar, gjenet kandidate u amplifikuan në çifte nëpërmjet një protokolli të optimizuar duplex-PCR, duke përdorur në një reaksion të vetëm dy grupe të ndryshme prajmerësh me temperatura të ngjashme shkrirjeje.
(Casale et al. 2019)
 

Pajisje ultrasonike me performancë të lartë për shpërbërjen e qelizave në mostra biologjike

Hielscher Ultrasonics është partneri juaj me përvojë të gjatë për ultrasonikatorë me performancë të lartë për shpërbërjen e qelizave, lizën, ekstraktimin e proteinave, fragmentimin e ADN-së, ARN-së dhe kromatinës, si dhe për hapa të tjerë të përgatitjes paraanalitike të mostrave. Duke ofruar një portofol gjithëpërfshirës homogjenizuesish laboratorikë me ultratinguj dhe njësish për përgatitjen e mostrave, Hielscher ka pajisjen ideale me ultratinguj për aplikimin dhe kërkesat tuaja biologjike.
Ultrasonikatori klasik me sondë me majë mikro, si UP200St (200W; shihni figurën majtas), ose një nga njësitë e përgatitjes së mostrave me ultratinguj VialTweeter ose UP200ST_TD_CupHorn me VialHolder janë modele të parapëlqyera në laboratorët kërkimorë dhe analitikë. Sonda klasike me ultratinguj është ideale kur duhet të lizohen, të ekstraktohen ose të fragmentohen më pak mostra. Njësitë e përgatitjes së mostrave VialTweeter dhe UP200St_TD_CupHorn mundësojnë trajtimin e njëkohshëm me ultratinguj të deri në 10 ose 5 flakonëve, përkatësisht.
Nëse duhet të përpunohet një numër i madh mostrash (p.sh. pllaka me 96 puse, pllaka mikrotitrimi etj.), UIP400MTP është sistemi ideal për trajtimin me ultratinguj. UIP400MTP funksionon si një sondë më e madhe në formë kupe, e cila mbushet me ujë dhe ka hapësirë të mjaftueshme për të mbajtur pllaka me mikropuse. I fuqizuar nga një procesor i fuqishëm me ultratinguj prej 400 vat, UIP400MTP siguron trajtim shumë të njëtrajtshëm dhe intensiv me ultratinguj të pllakave me shumë puse për të shpërbërë qelizat, për të lizuar mostrat, për të tretur sedimentet, për të ekstraktuar proteinat ose për të fragmentuar ADN-në me forca prerëse.

Kontroll i saktë përmes softuerit inteligjent

Të gjitha zgjidhjet Hielscher për trajtimin me ultratinguj me fuqi nga 200 vat e lart janë të pajisura me ekran dixhital me ngjyra me prekje dhe me softuer inteligjent. Përmes regjistrimit inteligjent të të dhënave, të gjithë parametrat e procesit me ultratinguj ruhen automatikisht si skedar CSV në një kartë SD të integruar, sapo të ndizet ultrasonikatori. Kjo e bën kërkimin dhe regjistrimin e të dhënave shumë më të lehtë. Pas provave të trajtimit me ultratinguj ose përgatitjes së mostrave, mund të shqyrtoni lehtësisht parametrat e secilit cikël trajtimi me ultratinguj dhe t’i krahasoni ato.
Përmes menysë intuitive, shumë parametra mund të paracaktohen përpara trajtimit me ultratinguj: Për shembull, për të kontrolluar temperaturën në mostër dhe për të parandaluar degradimin e saj termik, mund të vendoset një kufi i sipërm për temperaturën e mostrës. Një sensor temperature që lidhet me prizë dhe që jepet bashkë me njësinë me ultratinguj i dërgon procesorit me ultratinguj të dhëna mbi temperaturën aktuale të trajtimit. Kur arrihet kufiri i sipërm i temperaturës, pajisja me ultratinguj ndalon përkohësisht derisa të arrihet kufiri i poshtëm i ∆T të caktuar dhe pastaj rifillon automatikisht trajtimin me ultratinguj.
Nëse kërkohet trajtim me ultratinguj me një sasi specifike energjie të dhënë, mund të paracaktoni energjinë përfundimtare të ultratingujve për ciklin e trajtimit. Natyrisht, edhe pulsimi i ultratingujve dhe modaliteti i ciklit mund të caktohen individualisht.
Për të ripërdorur parametrat tuaj më të suksesshëm të trajtimit me ultratinguj, mund të ruani modalitete të ndryshme trajtimi (p.sh. kohën e trajtimit me ultratinguj, intensitetin, modalitetin e ciklit etj.) si modalitete të paracaktuara, në mënyrë që të mund të aktivizohen sërish lehtë dhe shpejt.
Për lehtësi më të madhe përdorimi, të gjitha njësitë dixhitale me ultratinguj mund të komandohen në distancë përmes çdo shfletuesi të zakonshëm (p.sh. InternetExplorer, Safari, Chrome etj.). Lidhja LAN konfigurohet thjesht duke e lidhur dhe përdorur menjëherë pajisjen dhe nuk kërkon instalimin e ndonjë softueri shtesë.
Ne te Hielscher e dimë se trajtimi i suksesshëm i mostrave biologjike me ultratinguj kërkon saktësi dhe përsëritshmëri. Prandaj, i kemi projektuar ultrasonikatorët tanë si pajisje inteligjente me të gjitha funksionet që mundësojnë përgatitje efikase, të besueshme, të riprodhueshme dhe të lehtë të mostrave.

Tabela më poshtë ju jep një ide për kapacitetin e përafërt të përpunimit të sistemeve tona me ultratinguj, nga majat mikro me ultratinguj dhe homogjenizuesit klasikë me ultratinguj deri te ultrasonikatorët MultiSample për përgatitjen e lehtë dhe të besueshme të një numri të madh mostrash: