Liza tejzanor e mostrave të Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster përdoret gjerësisht në laboratorë si organizëm model. Prandaj, hapat e përgatitjes para-analitike si liza, ndërprerja e qelizave, nxjerrja e proteinave dhe prerja e ADN-së e mostrave të Drosophila melanogaster duhet të kryhen shpesh. Shpërndarësit tejzanor janë të besueshëm dhe efikas dhe mund të përdoren për të kryer detyra të ndryshme si liza, nxjerrja e proteinave ose fragmentimi i ADN-së me lehtësi duke rregulluar vetëm parametrat e procesit tejzanor. Prandaj, homogjenizuesit tejzanor janë mjete fleksibël me një gamë të gjerë aplikimesh.

Liza me ultratinguj dhe nxjerrja e proteinave

Liza, tretja e qelizave, homogjenizimi i indeve dhe nxjerrja e proteinave janë detyra tipike për dismembatorët tejzanor në laboratorët biologjikë. Shpërndarësit tejzanor dhe përçarësit e qelizave janë të përshtatshme për të homogjenizuar indet e kafshëve, insektet (p.sh. Drosophila melanogaster, C. elegans) ose ekzemplarët bimorë. Aplikimet e mëvonshme të ultrazërit janë liza e suspensioneve dhe peletave qelizore si dhe nxjerrja e proteinave ndërqelizore.
Liza tejzanor dhe nxjerrja e proteinave janë procese shumë të besueshme dhe të riprodhueshme, të cilat mund të kryhen në bazë të protokolleve të vendosura. Meqenëse intensiteti i procesit tejzanor mund të rregullohet saktësisht përmes parametrave të sonikimit si amplituda, mënyra e ciklit / pulsit, temperatura dhe vëllimi i mostrës, pasi protokollet e vërtetuara mund të përsëriten me të njëjtin rezultat pa pushim.

Fragmentimi tejzanor i ADN-së dhe ARN-së

Pas lizës së qelizave dhe nxjerrjes së proteinave, një hap i zakonshëm i kërkuar në përgatitjen e mostrës është prerja dhe fragmentimi i ADN-së, ARN-së dhe kromatinës, p.sh. përpara imunoprecipitimit të kromatinës (ChIP). Fragmentimi i ADN-së dhe ARN-së mund të arrihet në mënyrë të besueshme duke thyer lidhjet kovalente që mbajnë së bashku ADN-në nga forcat fizike. Duke përdorur prerjen fizike siç është sonikimi, fillimisht fijet e ADN-së thyhen, më pas ADN-ja fragmentohet në copa më të vogla.
Fragmentimi tejzanor i ADN-së është i besueshëm dhe efikas në prerjen e ADN-së në një gjatësi të synuar, p.sh. 500 bp (çifte bazash). Përparësitë kryesore të fragmentimit tejzanor të ADN-së përfshijnë kontrollin e saktë të parametrave dhe intensitetit të procesit tejzanor. Parametrat e procesit tejzanor mund të rregullohen duke rregulluar me saktësi intensitetin e sonication, ciklet dhe kohën. Kjo bën të mundur krijimin e madhësive të dëshiruara të ADN-së dhe gjatësia e synuar e ADN-së mund të prodhohet dhe riprodhohet në mënyrë të besueshme. Prerja tejzanor e ADN-së është gjithashtu ideale për të krijuar fragmente të ADN-së me peshë të lartë molekulare.

Protokollet për Lizën tejzanor të Drosophila melanogaster

Më poshtë mund të gjeni protokolle të ndryshme për lizën e asistuar me ultratinguj, nxjerrjen e proteinave dhe fragmentimin e ADN-së ose kromatinës të mostrave të Drosophila.

Analiza e lizës tejzanore për imunoprecipitimin me ndërlidhje (CLIP).

Analiza CLIP u krye siç u raportua më parë me disa modifikime. Përafërsisht 20 mg vezore nga femrat e tipit të egër 0 deri në 1 ditë ishin të ndërlidhura me UV (3 × 2000 μJ/cm2), të homogjenizuara në akull në 1 ml tampon RCB (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM, 2,5 mM). MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM saharozë, 1 mM DTT, 1 × Frenues të Proteazës Komplete pa EDTA, 1 mM PMSF) plotësuar me 300 U RNAseOUT dhe vendoset në akull për 30 min. Homogjenati u sonikua në akull, me fuqi 80%, pesë herë në breshëri 20 s me një pushim 60 s në mes duke përdorur procesorin tejzanor Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) dhe centrifugohet (16000 × g për 5 minuta në 4°C). Ekstrakti i tretshëm u parapris me 20 μl rruaza proteine-G për 20 minuta në 4°C. Pas heqjes së mostrave për imunoblotting dhe sasisë së hyrjes së ARN-së (1%), HP1 u imunoprecipitua me antitrupa anti-HP1 9A9 nga 450 μl ekstrakt i paraprakisht i pastruar me inkubacion për 4 orë me 50 μl rruaza dinaprotein-G. Imunoprecipitatet u lanë 4 herë me RCB. Për të elutuar ARN-të e imunoprecipituara, rruazat e peletuara u zien në 100 μL Ujë të trajtuar me DEPC UltraPure për 5 minuta. 900 μL reagent Qiazol iu shtua supernatantit të rikuperuar për përgatitjen e ARN-së. ARN-ja e pastruar u përdor si një shabllon për të sintetizuar cDNA duke përdorur oligo dT, heksamera të rastësishëm dhe transkriptazën e kundërt SuperScript III sipas protokollit të prodhuesit.
(Cassale et al. 2019)

Liza tejzanor për analizën e imunoprecipitimit të kromatinës

Imunoprecipitimi i kromatinës u krye sipas metodës së përshkruar nga Menet me modifikime të vogla. Përafërsisht 20 mg vezore nga femrat e tipit të egër 0 deri në 1 ditë u homogjenizuan në 1 mL bufer NEB (10 mM HEPES-Na në pH 8.0, 10 mM NaCl, 0.1 mM EGTA-Na në pH 8, 0.5 m EDTA-Na në pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM spermidinë, 0,15 mM sperminë, 1 × Frenues të plotë të proteazës pa EDTA) me një homogjenizues / shpërndarës zhytjeje 1 min (në 3000 rpm). Homogjenati u transferua në një gotë qelqi të ftohur paraprakisht dhe u aplikuan 15 goditje të plota me një shtypës të ngushtë. Bërthamat e lira u centrifuguan më pas në 6000xg për 10 minuta në 4°C. Peletat që përmbajnë bërthama u risuspenduan në 1 mL NEB dhe u centrifuguan në 20000 × g për 20 minuta në gradient saharozë (0.65 mL saharozë 1.6 M në NEB, 0.35 mL saharozë 0.8 M në NEB). Peleti u risuspendua në 1 mL NEB dhe formaldehid në një përqendrim përfundimtar prej 1%. Bërthamat u ndërlidhën për 10 minuta në temperaturën e dhomës dhe u shuan duke shtuar 1/10 vol 1,375 M glicinë. Bërthamat u mblodhën me centrifugim në 6000 × g për 5 min. Bërthamat u lanë dy herë në 1 mL NEB dhe u risuspenduan në 1 mL bufer Lisis (15 mM HEPES-Na në pH 7.6, 140 mM NaCl, 0.5 mM EGTA, 1 mM EDTA në pH 8, 1% Triton X-100, 0. mM DTT, 0,1% Na deoksikolat, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroilsarkozinë dhe 1 × Frenues të Proteazës Komplete pa EDTA). Bërthamat u sonikuan duke përdorur një procesor tejzanor Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) gjashtë herë për 20 sekonda dhe 1 min në akull. Bërthamat e sonikuara u centrifuguan në 13000 × g për 4 minuta në 4°C. Shumica e kromatinës së sonikuar ishte 500 deri në 1000 çifte bazash (bp) në gjatësi. Për çdo imunoprecipitim, 15 μg kromatinë u inkubuan në prani të 10 μg të antitrupit monoklonal HP1 9A9 (3 orë në 4°C në një rrotë rrotulluese). Më pas, u shtuan 50 μl proteina të dinabeads G dhe inkubimi vazhdoi gjatë natës në 4°C. Supernatantët u hodhën dhe mostrat u lanë dy herë në Lisis Buffer (çdo larje 15 min në 4 ° C) dhe dy herë në TE Buffer (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl në pH 8). Kromatina u elua nga rruaza në dy hapa; fillimisht në 100 μl Eluition Buffer 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl në pH 8) në 65°C për 15 minuta, e ndjekur nga centrifugimi dhe rikuperimi i supernatantit. Materiali i rruazave u riekstraktua në 100 μl TE + 0.67% SDS. Eluati i kombinuar (200 μl) u inkubua gjatë natës në 65°C për të kthyer ndërlidhjet e kundërta dhe u trajtua me 50 μg/ml RNaseA për 15 minuta në 65°C dhe me 500 μg/ml Proteinazë K për 3 orë në 65°C. Mostrat u nxorrën fenol-kloroform dhe u precipituan me etanol. ADN-ja u risuspendua në 25 μl ujë. Për maksimizimin e analizave molekulare me ADN të imunoprecipituar, gjenet kandidate u përforcuan në çifte përmes një protokolli të optimizuar duplex-PCR duke përdorur dy grupe të ndryshme primerësh që kanë temperatura të ngjashme shkrirjeje në një reagim të vetëm.
(Casale et al. 2019)
 

Ndërprerës të qelizave tejzanor me performancë të lartë për mostrat biologjike

Hielscher Ultrasonics është partneri juaj me përvojë të gjatë kur bëhet fjalë për ultratinguj me performancë të lartë për ndërprerjen e qelizave, lizën, nxjerrjen e proteinave, ADN-në, ARN-në dhe fragmentimin e kromatinës, si dhe hapat e tjerë të përgatitjes së mostrës para-analitike. Duke ofruar një portofol të plotë të homogjenizuesve laboratorikë tejzanor dhe njësive të përgatitjes së mostrave, Hielscher ka pajisjen ideale ultrasonike për aplikimin dhe kërkesat tuaja biologjike.
Ultrasonikator klasik i tipit sondë me mikromajë si p.sh UP200 St (200W; shih foton majtas) ose një nga njësitë e përgatitjes së mostrës me ultratinguj VialTweeter ose UP200ST_TD_CupHorn me VialHolder janë modelet e preferuara në laboratorët kërkimorë dhe analitikë. Sonda klasike tejzanor është ideale, kur përgatiten më pak mostra duhet të lizohen, të nxirren ose të fragmentohen. Njësitë e përgatitjes së mostrës VialTweeter dhe UP200St_TD_CupHorn lejojnë sonikimin e njëkohshëm të deri në 10 ose 5 flakone, përkatësisht.
Nëse duhet të përpunohen numra të lartë të mostrave (p.sh. pllaka 96 pusesh, pllaka mikrotitërore etj.), UIP400MTP është konfigurimi ideal i sonikacionit. UIP400MTP funksionon si një kupë më e madhe, e cila është e mbushur me ujë dhe ka hapësirë të mjaftueshme për të mbajtur pllakat e mikropuseve. Mundësuar nga një procesor ultrasonik i fuqishëm 400 watts, UIP400MTP jep një sonikacion shumë uniform dhe intensiv të pllakave me shumë pus për të prishur qelizat, lizimin e mostrave, tretjen e peletave, nxjerrjen e proteinave ose prerjen e ADN-së.

Kontroll i saktë nëpërmjet Softuerit të zgjuar

Të gjitha zgjidhjet e hielscher sonication nga 200 watts e lart janë të pajisura me një ekran me prekje dixhitale me ngjyra dhe një softuer inteligjent. Nëpërmjet protokollimit të të dhënave inteligjente, të gjithë parametrat e procesit tejzanor ruhen automatikisht si skedar CSV në një kartë SD të integruar sapo të ndizet aparati ultrasonik. Kjo e bën kërkimin dhe protokollimin shumë më të përshtatshëm. Pas sprovave të sonikimit ose përgatitjes së mostrës, thjesht mund të rishikoni parametrat e sonikimit të çdo ekzekutimi të sonikimit dhe t'i krahasoni ato.
Nëpërmjet menysë intuitive, mund të paracaktohen parametra të shumtë përpara sonikimit: Për shembull, për të kontrolluar temperaturën në kampion dhe për të parandaluar degradimin termik të saj, mund të vendoset një kufi i sipërm i temperaturës së mostrës. Një sensor i temperaturës me prizë, i cili vjen me njësinë tejzanor, i jep procesorit tejzanor reagime mbi temperaturën aktuale të tingullit. Kur arrihet kufiri i sipërm i temperaturës, pajisja tejzanor ndalon derisa të arrihet kufiri i poshtëm i cilësimit ∆T dhe fillon më pas automatikisht sonikimin përsëri.
Nëse kërkohet sonikacion me një hyrje specifike të energjisë, mund të paracaktoni energjinë përfundimtare tejzanor të funksionit të sonikimit. Sigurisht, pulsimi tejzanor dhe mënyra e ciklit mund të vendosen gjithashtu individualisht.
Për të ripërdorur parametrat tuaj më të suksesshëm të tingullit, mund të ruani mënyra të ndryshme të tingullit (p.sh. koha e tingullit, intensiteti, modaliteti i ciklit etj.) si modalitete të paracaktuara, në mënyrë që ato të mund të rifillojnë lehtësisht dhe me shpejtësi.
Për më shumë lehtësi funksionale, të gjitha njësitë dixhitale ultrasonike mund të operohen nëpërmjet telekomandës së shfletuesit në çdo shfletues të zakonshëm (p.sh. InternetExplorer, Safari, Chrome etj.). Lidhja LAN është një konfigurim i thjeshtë plug-n-play dhe nuk kërkon instalim softueri shtesë.
Ne në Hielscher e dimë se sonikimi i suksesshëm i mostrave biologjike kërkon saktësi dhe përsëritshmëri. Prandaj, ne projektuam ultrasonikët tanë si pajisje inteligjente me të gjitha veçoritë që mundësojnë një përgatitje efikase, të besueshme, të riprodhueshme dhe të përshtatshme të mostrës.

Tabela më poshtë ju jep një tregues të kapacitetit të përafërt të përpunimit të sistemeve tona tejzanor nga mikro-maja tejzanor dhe homogjenizuesit klasikë ultrasonikë deri te ultrasonikët MultiSample për përgatitjen e përshtatshme dhe të besueshme të mostrave të shumta: