Përgatitja e mostrës tejzanor për analizat ELISA

Analizat si ELISA përdoren gjerësisht për diagnostikimin in-vitro, zbulimin e proteinave në lidhje me sëmundjen dhe kontrollin e cilësisë (p.sh. monitorimi i alergjenëve ushqimorë). Përgatitja e mostrës tejzanor është një teknikë e shpejtë, e besueshme dhe e riprodhueshme për të lyzuar qelizat dhe për të izoluar proteinat intraqelizore, ADN-në, ARN-në dhe organelet. Hielscher Ultrasonics ofron zgjidhje të ndryshme tejzanor për përgatitjen e përshtatshme të mostrave të vetme, shisheve të shumëfishta, si dhe për pllakat mikrotiter dhe pllakat 96-pusesh.

ELISA – Analiza imunosorbente e lidhur me enzimat

ELISA qëndron për provën imunosorbente të lidhur me enzimat dhe është një teknikë e përdorur gjerësisht e analizës biokimike të kategorisë së provave të lidhjes së ligandit. Në ELISA, një mostër e lëngshme shtohet në një fazë të palëvizshme të palëvizshme me veti të veçanta të lidhjes. Normalisht, faza e palëvizshme e palëvizshme zbatohet si veshje në një pllakë pusi ose pllakë ELISA. Pastaj, reagens të ndryshëm të lëngshëm shtohen në mënyrë sekuenciale, inkubohen dhe lahen, në mënyrë që më në fund të ndodhë një ndryshim optik (p.sh., zhvillimi i ngjyrës nga produkti i një reaksioni enzimatik) në lëngun përfundimtar në pus. Ndryshimi optik lejon të matet sasia e analizës me një të ashtuquajtur sasiore “lexim ”. Për leximin sasior, përdoret një spektrofotometër, fluorometër ose luminometër për të zbuluar dhe matur intensitetin e dritës së transmetuar. Ndjeshmëria e zbulimit ndikohet nga amplifikimi i sinjalit gjatë reaksioneve analitike. Meqenëse reaksionet e enzimave janë të hetuara mirë dhe procese të besueshme të amplifikimit, enzimat përdoren për të krijuar sinjalin. Enzimat janë të lidhura me reagensët e zbulimit në proporcione fikse për të lejuar sasinë e saktë, e cila shpjegon edhe emrin e imunosorbentit të lidhur me enzimat.
Ndërsa analizat ELISA kryhen në pllaka mikrotiteri / pllaka 96 pusesh, ajo njihet si teknikë e vlerësimit të bazuar në pllaka dhe përdoret p.sh. në diagnostikimin, hulumtimin klinik, zhvillimin e ilaçeve etj. Për zbulimin dhe vlerësimin e antitrupave, peptideve, proteinave, dhe hormonet.
Teknika ELISA përdoret shpesh si një mjet diagnostikues në mjekësi, bioteknologji, patologji bimore dhe është gjithashtu një matje e rëndësishme e kontrollit të cilësisë në shumë industri.

Përgatitja e mostrës tejzanor para ELISA

Para se të kryhet analiza ELISA, mostrat kërkojnë hapa të përgatitjes si liza qelizore dhe nxjerrja e proteinave brendaqelizore, ADN-ja, ARN-ja etj. Përparësia e lizës tejzanor të qelizave dhe izolimi i proteinave është efikasiteti, besueshmëria dhe riprodhueshmëria e saj e lartë. Të gjithë këta faktorë janë të rëndësishëm në mënyrë që të merrni rezultate të diagnostikimit dhe kërkimit me cilësi të lartë

Protokolli për Analizën e Qelizave Ultrasonike Pre-ELISA

• Për kulturat qelizore: Para lizës së qelizave tejzanor, centrifugoni qelizat për 5 minuta në 270 xg në një mikrocentrifugë. Hiqni supernatantin me anë të thithjes dhe rishpërtheni qelizat në 30 - 100 μL tampon RIPA. Pastaj, inkuboni pelletin qelizor në akull për 30 min.
• Tani, mostra e qelizës është e gatshme për lizë tejzanor:
  Përdorni një ultrasonicator të tipit sondë (p.sh. UP200Ht me sondë S26d2) ose një pajisje me shumë mostra tejzanor (p.sh. VialTweeter për sonifikim të njëkohshëm deri në 10 shishka ose UIP400MPT për pllaka mikrotiteri / pllaka 96-pusesh) në varësi të sasisë së mostrave që duhet të përgatitni.
  Për sonifikimin e tipit sondë të një mostre të vetme, vendosni qelizat në tuba mikrocentrifugë 1,5 ml.
• Vendosni paraprakisht kohëzgjatjen tuaj tejzanor, hyrjen totale të energjisë, modalitetin e ciklit dhe / ose kufijtë e temperaturës në menunë dixhitale të ultrasonicatorit. Kjo siguron sonifikim dhe përsëritshmëri shumë të besueshme.
• Vendosni sonotrodën dhe ndizni pajisjen tejzanor. Butësisht lëvizni mikro-majën e sondës tejzanor përmes kampionit për të sonifikuar mostrën në mënyrë uniforme.
  Për shumicën e qelizave, liza ultrasonike do të përfundojë pas 2 -4 cikleve me sonifikim prej 10 sekondash.
• Pas zërit, hiqni sonotrodën nga mostra. Mostrat duhet të inkubohen në akull për 5 min. Pastaj, centrifugoni në 10,000 xg për 20 min për të pelet mbeturinat. Transferoni supernatantët në një tub të ri mikrocentrifuge. Etiketoni analitët dhe ruani në -20 ° C.
• Sonotroda tejzanor mund të pastrohet duke e fshirë atë siç duhet me alkool ose sonikat në një gotë të mbushur me alkool, p.sh. 70% etanol. Të gjithë sondat tejzanor të bëra nga titani janë të autoklavueshme.

Për homogjenetet e indeve:

• Shpëlajeni indin me PBS të ftohtë në akull (0,01M, pH = 7,4) për të hequr tërësisht gjakun e tepërt të hemolizës.
• Peshoni indet (veshka, zemra, mushkëritë, shpretka etj.) Dhe makerojeni ato në copa të vogla, të cilat homogjenizohen në PBS. Vëllimi i PBS-së së kërkuar lidhet me peshën e indeve. Si rregull, 1g ind kërkon rreth. 9 ml PBS. Rekomandohet të shtoni disa frenues të proteazës në PBS. (RIPA ose tampon hipotonik i lizës që përmban koktej frenues të proteazës dhe fosfatazës mund të përdoret në mënyrë alternative.)
• Në varësi të madhësisë së indeve, një trajtim i shkurtër i vorbullës (afro 1-2 min. Në impulse 15 sek.) Mund të jetë i dobishëm për të para-trajtuar indin.
• Montoni një mikro-tip, p.sh. S26d2, në ultrasonicatorin tuaj. Vendoseni tubin e mostrës me indet në një banjë akulli.
• Sonifikoni mostrën me ultrasonicatorin tuaj, p.sh. UP200St (amplituda 80%) për 1 min. në modalitetin e impulsit (15 sekonda ndezur, 15 sekonda pauzë). Mbajeni kampionin në banjën e akullit.
• Homogjenet pastaj centrifugohen për të marrë pellgje specifike (citosolik, bërthamor, mitokondrial ose lizosomal) në mënyrë që të pasurohet proteina për analizë. Duke centrifuguar kampionin për 5 minuta në 5000 × g, supernatanti merret.

Kontroll i besueshëm i temperaturës gjatë sonifikimit

Temperatura është një faktor vendimtar që ndikon në proces, i cili është veçanërisht i rëndësishëm për trajtimin e mostrave biologjike, p.sh. për të parandaluar degradimin termik të proteinave. Si të gjitha teknikat mekanike të përgatitjes së mostrës, sonifikimi krijon nxehtësi. Sidoqoftë, temperatura e mostrave mund të kontrollohet mirë kur përdorni pajisjet Hielscher Ultrasonics. Ne ju paraqesim mundësi të ndryshme për të monitoruar dhe kontrolluar temperaturën e mostrave tuaja ndërsa i përgatisni ato me një ultrasonicator të një sondë ose VialTweeter para-analitikisht.

1. Monitorimi i temperaturës së mostrës: Të gjithë procesorët dixhitalë ultrasonikë të Hielscher janë të pajisur me një softuer inteligjent dhe një sensor të temperaturës të mbyllur. Lidhni sensorin e temperaturës në pajisjen tejzanor (p.sh., UP200Ht, UP200St, VialTweeter, UIP400MTP) dhe futni majën e sensorit të temperaturës në një nga tubat e mostrës. Përmes ekranit me prekje dixhitale me ngjyrë, mund të vendosni në menunë e procesorit tejzanor një gamë specifike të temperaturës për sonifikimin tuaj të mostrës. Ultrasonicator automatikisht do të ndalet kur të arrihet temperatura maksimale dhe të ndalojë derisa temperatura e mostrës të ulet në vlerën më të ulët të temperaturës së caktuar. Pastaj sonifikimi fillon përsëri automatikisht. Kjo veçori inteligjente parandalon degradimin e shkaktuar nga nxehtësia.
2. Lidhur me njësinë tejzanor me shumë mostra VialTweeter, blloku i titanit, i cili mban tubat e mostrës, mund të ftohet paraprakisht. Vendosni bllokun VialTweeter (vetëm sonotrode pa këmbyes!) Në frigorifer ose frigorifer për të ftohur paraprakisht bllokun e titanit ndihmon në shtyrjen e rritjes së temperaturës në mostër. Nëse është e mundur, vetë kampioni mund të ftohet gjithashtu paraprakisht.
3. Përdorni një banjë akulli ose akull të thatë për t’u ftohur gjatë sonifikimit. Vendosni tubat (et) tuaj të mostrës gjatë zërit në një banjë akulli. Për VialTweeter, përdorni një tabaka të cekët të mbushur me akull të thatë dhe vendoseni VialTweeter në akull të thatë në mënyrë që nxehtësia të shpërndahet shpejt.

Klientët në mbarë botën përdorin sondën Hielscher-ultrasonicators si dhe njësitë shumëkampionuese të sonikimit VialTweeter dhe UIP400MTP për punën e tyre ditore të përgatitjes së mostrës në laboratorë biologjikë, biokimikë, mjekësorë dhe klinikë. Programi inteligjent dhe kontrolli i temperaturës së procesorëve Hielscher, temperatura kontrollohet në mënyrë të besueshme dhe shmanget degradimi i mostrës i nxitur nga nxehtësia. Përgatitja tejzanor e mostrës me zgjidhje ultrasonike Hielscher jep rezultate shumë të besueshme dhe të riprodhueshme!