Përgatitja e mostrës tejzanor për analizat ELISA

Analizat si ELISA përdoren gjerësisht për diagnostikimin in-vitro, zbulimin e proteinave të lidhura me sëmundjen dhe kontrollin e cilësisë (p.sh. monitorimi i alergeneve ushqimore). Përgatitja e mostrës tejzanor është një teknikë e shpejtë, e besueshme dhe e riprodhueshme për lizimin e qelizave dhe izolimin e proteinave ndërqelizore, ADN-së, ARN-së dhe organeleve. Hielscher Ultrasonics ofron zgjidhje të ndryshme tejzanor për përgatitjen e përshtatshme të mostrave të vetme, flakoneve të shumëfishta, si dhe për pllaka mikrotitërore dhe pllaka 96 pusesh.

ELISA – Analiza imunosorbente e lidhur me enzimën

ELISA qëndron për analizën imunosorbente të lidhur me enzimën dhe është një teknikë analize biokimike e përdorur gjerësisht e kategorisë së analizave të lidhjes së ligandit. Në ELISA, një mostër e lëngshme shtohet në një fazë të ngurtë të palëvizshme me veti të veçanta lidhëse. Normalisht, faza e ngurtë e palëvizshme aplikohet si veshje në një pllakë pusi ose pllakë ELISA. Më pas, reagentë të ndryshëm të lëngshëm shtohen në mënyrë sekuenciale, inkubohen dhe lahen, në mënyrë që më në fund të ndodhë një ndryshim optik (p.sh. zhvillimi i ngjyrës nga produkti i një reaksioni enzimatik) në lëngun përfundimtar në pus. Ndryshimi optik lejon matjen e sasisë së analitit me një të ashtuquajtur sasior “duke lexuar”. Për leximin sasior, përdoret një spektrofotometër, fluorometër ose luminometër për të zbuluar dhe matur intensitetin e dritës së transmetuar. Ndjeshmëria e zbulimit ndikohet nga përforcimi i sinjalit gjatë reaksioneve analitike. Meqenëse reaksionet enzimë janë hetuar mirë dhe procese të besueshme të amplifikimit, enzimat përdoren për të krijuar sinjalin. Enzimat janë të lidhura me reagentët e zbulimit në përmasa fikse për të lejuar kuantifikimin e saktë, gjë që shpjegon edhe emrin analizë imunosorbente "e lidhur me enzimën".
Duke qenë se analizat ELISA kryhen në pllaka mikrotitërore / pllaka 96 pusesh, ajo njihet si teknikë e analizës së bazuar në pllakë dhe përdoret p.sh. në diagnostikimin klinik in-vitro, kërkimin, zhvillimin e barnave etj. për zbulimin dhe përcaktimin sasior të antitrupave, peptideve, proteinave, dhe hormonet.
Teknika ELISA përdoret shpesh si një mjet diagnostikues në mjekësi, bioteknikë, patologji bimore dhe është gjithashtu një matje e rëndësishme e kontrollit të cilësisë në industri të shumta.

Përgatitja e mostrës me ultratinguj përpara ELISA

Përpara se të kryhet analiza ELISA, mostrat kërkojnë hapa të përgatitjes si liza e qelizave dhe nxjerrja e proteinave ndërqelizore, ADN, ARN etj. Avantazhi i lizës së qelizave tejzanor dhe izolimit të proteinave është efikasiteti, besueshmëria dhe riprodhueshmëria e lartë. Të gjithë këta faktorë janë të rëndësishëm për të marrë rezultate diagnostikuese dhe kërkimore me cilësi të lartë

Protokolli për Lizën e Qelizës Ultrasonike Pre-ELISA

• Për kulturat e qelizave: Përpara lizës së qelizave tejzanor, centrifugoni qelizat për 5 minuta në 270 xg në një mikrocentrifugë. Hiqeni supernatantin me aspirim dhe risuspendoni qelizat në 30 – 100 μL bufer RIPA. Më pas, inkuboni peletin e qelizave në akull për 30 minuta.
• Tani, kampioni i qelizave është gati për lizë tejzanor:
  Përdorni një ultrasonikator të tipit sondë (p.sh UP200Ht me sondë S26d2) ose një pajisje tejzanor me shumë mostra (p.sh. VialTweeter për sonikimin e njëkohshëm të deri në 10 flakone ose UIP400MPT për pllaka mikrotitërore / pllaka 96 pusesh) në varësi të sasisë së mostrave që duhet të përgatitni.
  Për sonikimin e tipit sondë të një kampioni të vetëm, vendosni qelizat në tuba mikrocentrifuge 1,5 mL.
• Paracaktoni kohëzgjatjen tuaj tejzanor, hyrjen totale të energjisë, mënyrën e ciklit dhe/ose kufijtë e temperaturës në menynë dixhitale të aparatit ultrasonik. Kjo siguron sonication dhe përsëritshmëri shumë të besueshme.
• Fusni sonotrode dhe ndizni pajisjen tejzanor. Lëvizni butësisht mikro-majën e sondës tejzanor përmes kampionit për të sonikuar mostrën në mënyrë të njëtrajtshme.
  Për shumicën e qelizave, liza tejzanor do të përfundojë pas 2 -4 cikleve të sonikacionit 10 sekonda.
• Pas sonikacionit, hiqni sonotrode nga kampioni. Mostrat duhet të inkubohen në akull për 5 minuta. Më pas, centrifugoni në 10,000 xg për 20 minuta për të grumbulluar mbeturinat. Transferoni supernatantët në një tub të ri mikrocentrifuge. Etiketoni analitet dhe ruani në -20°C.
• Sonotrode tejzanor mund të pastrohet duke e fshirë siç duhet me alkool ose sonikate në një gotë të mbushur me alkool, p.sh. 70% etanol. Të gjitha sondat tejzanor të bëra nga titani janë të autoklavueshme.

• Shpëlajeni indin me PBS të ftohtë në akull (0.01M, pH=7.4) për të hequr plotësisht gjakun e tepërt të hemolizës.
• Peshoni indin (veshkat, zemrën, mushkëritë, shpretkën etj.) dhe maceroni në copa të vogla, të cilat homogjenizohen në PBS. Vëllimi i kërkuar i PBS lidhet me peshën e indit. Si rregull i përgjithshëm, 1 g inde kërkon përafërsisht. 9 ml PBS. Rekomandohet të shtoni një frenues të proteazës në PBS. (RIPA ose buferi i lizës hipotonike që përmban koktej proteazë dhe frenues fosfatazë mund të përdoret në mënyrë alternative.)
• Në varësi të madhësisë së indit, një trajtim i shkurtër me vorbull (afërsisht 1-2 min. në pulse 15 sekondash) mund të jetë i dobishëm për para-trajtimin e indit.
• Montoni një mikro-majë, p.sh. S26d2, në aparatin tuaj ultrasonik. Vendoseni tubin e mostrës së bashku me petkun në një banjë akulli.
• Sonikojeni kampionin me aparatin tuaj ultrasonik, p.sh. UP200St (amplitudë 80%) për 1 min. në modalitetin e pulsit (15 sekonda ndezur, 15 sekonda pauzë). Mbajeni kampionin në banjë akulli.
• Homogjenatet më pas centrifugohen për të përftuar grupe specifike (citozolike, bërthamore, mitokondriale ose lizozomale) në mënyrë që të pasurojnë proteinën për analizë. Duke centrifuguar kampionin për 5 minuta në 5000×g, merret supernatanti.

Kontroll i besueshëm i temperaturës gjatë sonikimit

Temperatura është një faktor vendimtar që ndikon në procesin që është veçanërisht i rëndësishëm për trajtimin e mostrave biologjike, p.sh. për të parandaluar degradimin termik të proteinave. Si të gjitha teknikat mekanike të përgatitjes së mostrës, sonikimi krijon nxehtësi. Megjithatë, temperatura e mostrave mund të kontrollohet mirë kur përdorni pajisjet Hielscher Ultrasonics. Ne ju paraqesim opsione të ndryshme për të monitoruar dhe kontrolluar temperaturën e mostrave tuaja gjatë përgatitjes së tyre me një ultrasonikator të tipit sondë ose VialTweeter në mënyrë paraanalitike.

1. Monitorimi i temperaturës së mostrës: Të gjithë procesorët tejzanor dixhital Hielscher janë të pajisur me një softuer inteligjent dhe një sensor të temperaturës që mund të mbyllet. Futni sensorin e temperaturës në pajisjen tejzanor (p.sh. UP200Ht, UP200 St, VialTweeter, Sonicator me shumë pllakë UIP400MTP) dhe futni majën e sensorit të temperaturës në një nga tubat e mostrës. Nëpërmjet ekranit me prekje dixhitale me ngjyra, mund të vendosni në menynë e procesorit tejzanor një gamë specifike të temperaturës për sonikimin e mostrës tuaj. Ultrasonikatori do të ndalojë automatikisht kur të arrihet temperatura maksimale dhe do të ndalojë derisa temperatura e mostrës të bjerë në vlerën më të ulët të temperaturës së caktuar ∆. Pastaj sonication fillon automatikisht përsëri. Kjo veçori inteligjente parandalon degradimin e shkaktuar nga nxehtësia.
2. Për sa i përket njësisë tejzanor me shumë mostra VialTweeter, blloku i titanit, i cili mban tubat e mostrës, mund të ftohet paraprakisht. Vendosni bllokun VialTweeter (vetëm sonotrode pa dhënës!) në frigorifer ose ngrirës për të ftohur paraprakisht bllokun e titanit, ndihmon për të shtyrë rritjen e temperaturës në mostër. Nëse është e mundur, edhe vetë kampioni mund të ftohet paraprakisht.
3. Përdorni një banjë akulli ose akull të thatë për t'u ftohur gjatë sonikimit. Vendoseni tubin(t) tuaj të mostrës gjatë sonikimit në një banjë akulli. Për VialTweeter, përdorni një tabaka të cekët të mbushur me akull të thatë dhe vendoseni VialTweeter në akullin e thatë në mënyrë që nxehtësia të mund të shpërndahet me shpejtësi.

Klientët në mbarë botën përdorin ultrasonikët e tipit sondë Hielscher, si dhe njësitë e sonikimit me shumë mostra VialTweeter dhe UIP400MTP për punën e tyre të përditshme të përgatitjes së mostrave në laboratorët biologjikë, biokimikë, mjekësorë dhe klinikë. Softueri inteligjent dhe kontrolli i temperaturës së përpunuesve Hielscher, temperatura kontrollohet në mënyrë të besueshme dhe shmanget degradimi i mostrës i shkaktuar nga nxehtësia. Përgatitja e mostrës tejzanor me solucione tejzanor Hielscher jep rezultate shumë të besueshme dhe të riprodhueshme!
Lexoni më shumë rreth sonikimit me performancë të lartë duke përdorur sonikatorin me pllaka me shumë pllakë UIP400MTP për analiza!