Përgatitja e mostrave me ultratinguj për analizat ELISA

Analizat si ELISA përdoren gjerësisht për diagnostikimin in vitro, zbulimin e proteinave të lidhura me sëmundjet dhe kontrollin e cilësisë (p.sh. monitorimin e alergjenëve ushqimorë). Përgatitja e mostrave me ultratinguj është një teknikë e shpejtë, e besueshme dhe e riprodhueshme për lizën e qelizave dhe izolimin e proteinave brendaqelizore, DNA-së, RNA-së dhe organeleve. Hielscher Ultrasonics ofron zgjidhje të ndryshme me ultratinguj për përgatitjen e lehtë të mostrave individuale, të shumë flakonëve, si dhe të pllakave të mikrotitrimit dhe pllakave me 96 puse.

ELISA – Analiza imunosorbente e lidhur me enzimë

ELISA është shkurtesa për analizën imunosorbente të lidhur me enzimë dhe është një teknikë e analizës biokimike e përdorur gjerësisht, që i përket kategorisë së analizave të lidhjes së ligandëve. Në ELISA, një mostër e lëngshme shtohet mbi një fazë të ngurtë stacionare me veti të veçanta lidhëse. Zakonisht, faza e ngurtë stacionare aplikohet si veshje në një pllakë me puse ose pllakë ELISA. Më pas, reagentë të ndryshëm të lëngshëm shtohen njëri pas tjetrit, inkubohen dhe shpëlahen, në mënyrë që në fund të ndodhë një ndryshim optik (p.sh. zhvillimi i ngjyrës nga produkti i një reaksioni enzimatik) në lëngun përfundimtar në pus. Ndryshimi optik mundëson matjen e sasisë së analitit përmes një të ashtuquajturi “lexim” sasior. Për leximin sasior përdoret një spektrofotometër, fluorometër ose luminometër për të zbuluar dhe matur intensitetin e dritës së transmetuar. Ndjeshmëria e zbulimit ndikohet nga amplifikimi i sinjalit gjatë reaksioneve analitike. Meqenëse reaksionet enzimatike janë procese amplifikimi të studiuara mirë dhe të besueshme, enzimat përdoren për të krijuar sinjalin. Enzimat lidhen me reagentët e zbulimit në përpjesëtime fikse për të mundësuar përcaktimin e saktë sasior, gjë që shpjegon edhe emërtimin analizë imunosorbente “e lidhur me enzimë”.
Meqenëse analizat ELISA kryhen në pllaka mikrotitrimi / pllaka me 96 puse, kjo njihet si teknikë analize e bazuar në pllaka dhe përdoret, p.sh., në diagnostikimin klinik in vitro, kërkimin shkencor, zhvillimin e barnave etj., për zbulimin dhe përcaktimin sasior të antitrupave, peptideve, proteinave dhe hormoneve.
Teknika ELISA përdoret shpesh si mjet diagnostikues në mjekësi, bioteknologji dhe patologjinë e bimëve, dhe është gjithashtu një matje e rëndësishme e kontrollit të cilësisë në shumë industri.

Përgatitja e mostrave me ultratinguj përpara ELISA-s

Përpara se të kryhet analiza ELISA, mostrat kërkojnë hapa përgatitorë si liza e qelizave dhe ekstraktimi i proteinave brendaqelizore, DNA-së, RNA-së etj. Përparësia e lizës së qelizave dhe izolimit të proteinave me ultratinguj është efikasiteti i lartë, besueshmëria dhe riprodhueshmëria. Të gjithë këta faktorë janë të rëndësishëm për të përftuar rezultate diagnostikuese dhe kërkimore me cilësi të lartë

Protokoll për lizën e qelizave me ultratinguj përpara ELISA-s

• Për kulturat qelizore: Përpara lizës së qelizave me ultratinguj, centrifugoni qelizat për 5 minuta në 270 x g në një mikrocentrifugë. Hiqni supernatantin me aspirim dhe risuspendoni qelizat në 30 – 100 μL tretësirë tampon RIPA. Më pas, inkuboni sedimentin qelizor mbi akull për 30 min.
• Tani, mostra qelizore është gati për lizë me ultratinguj:
  Përdorni një pajisje ultrasonike me sondë (p.sh. UP200Ht me sondën S26d2) ose një pajisje ultrasonike për shumë mostra (p.sh. VialTweeter për sonikimin e njëkohshëm të deri në 10 flakonëve ose UIP400MPT për pllaka mikrotitrimi / pllaka me 96 puse), në varësi të numrit të mostrave që duhet të përgatitni.
  Për sonikimin me sondë të një mostre të vetme, vendosini qelizat në tuba mikrocentrifugimi 1,5 mL.
• Paracaktoni kohëzgjatjen e trajtimit me ultratinguj, energjinë totale të dhënë, mënyrën e ciklit dhe/ose kufijtë e temperaturës në menynë digjitale të pajisjes ultrasonike. Kjo siguron sonikim shumë të besueshëm dhe përsëritshmëri.
• Futni sonotrodën dhe ndizni pajisjen ultrasonike. Lëvizeni butësisht majën mikro të sondës ultrasonike nëpër mostër për ta trajtuar mostrën në mënyrë të njëtrajtshme me ultratinguj.
  Për shumicën e qelizave, liza ultrasonike do të përfundojë pas 2–4 cikleve trajtimi me ultratinguj nga 10 sekonda.
• Pas trajtimit me ultratinguj, hiqeni sonotrodën nga mostra. Mostrat duhet të inkubohen mbi akull për 5 min. Pastaj, centrifugojini në 10 000 x g për 20 min për të sedimentuar mbetjet. Transferojini supernatantet në një tub të ri mikrocentrifugimi. Etiketoni analitet dhe ruajini në -20°C.
• Sonotroda ultrasonike mund të pastrohet duke e fshirë mirë me alkool ose duke e trajtuar me ultratinguj në një gotë laboratorike të mbushur me alkool, p.sh. etanol 70%. Të gjitha sondat ultrasonike prej titani mund të sterilizohen në autoklavë.

• Shpëlajeni indin me PBS të ftohtë si akulli (0,01M, pH=7,4) për të larguar plotësisht gjakun e tepërt të hemolizuar.
• Peshojeni indin (veshkë, zemër, mushkëri, shpretkë etj.) dhe macerojeni në copa të vogla, të cilat homogjenizohen në PBS. Vëllimi i nevojshëm i PBS lidhet me peshën e indit. Si rregull praktik, 1g ind kërkon afërsisht 9mL PBS. Rekomandohet të shtohet një sasi frenuesi të proteazës në PBS. (Si alternativë mund të përdoret RIPA ose një tampon hipotonik për lizë që përmban një përzierje frenuesish të proteazave dhe fosfatazave.)
• Në varësi të madhësisë së indit, një trajtim i shkurtër me vorteks (afërsisht 1–2 min. me impulse prej 15 sekondash) mund të jetë i dobishëm për trajtimin paraprak të indit.
• Montoni një majë mikro, p.sh. S26d2, në aparatin tuaj ultrasonik. Vendoseni tubin e mostrës me indin në një banjë akulli.
• Trajtojeni mostrën me ultratinguj duke përdorur aparatin tuaj ultrasonik, p.sh. UP200St (amplitudë 80%), për 1 min. në modalitetin me impulse (15 sekonda aktiv, 15 sekonda pauzë). Mbajeni mostrën në banjën e akullit.
• Homogjenatet më pas centrifugohen për të përftuar fraksione specifike (citosolike, bërthamore, mitokondriale ose lizozomale), me qëllim pasurimin e proteinës për analizë. Duke e centrifuguar mostrën për 5 minuta në 5000×g, merret supernatanti.

Kontroll i besueshëm i temperaturës gjatë trajtimit me ultratinguj

Temperatura është një faktor vendimtar që ndikon në proces dhe ka rëndësi të veçantë për trajtimin e mostrave biologjike, p.sh. për të parandaluar degradimin termik të proteinave. Ashtu si të gjitha teknikat mekanike të përgatitjes së mostrave, trajtimi me ultratinguj gjeneron nxehtësi. Megjithatë, temperatura e mostrave mund të kontrollohet mirë kur përdoren pajisjet Hielscher Ultrasonics. Ju paraqesim mundësi të ndryshme për të monitoruar dhe kontrolluar temperaturën e mostrave tuaja gjatë përgatitjes së tyre para analizës me një aparat ultrasonik me sondë ose me VialTweeter.

1. Monitorimi i temperaturës së mostrës: Të gjithë procesorët ultrasonikë digjitalë Hielscher janë të pajisur me softuer inteligjent dhe një sensor temperature që lidhet me konektor. Lidheni sensorin e temperaturës me pajisjen ultrasonike (p.sh., UP200Ht, UP200St, VialTweeter, aparatin ultrasonik UIP400MTP për pllaka me shumë puse) dhe futeni majën e sensorit të temperaturës në njërin prej tubave të mostrave. Nëpërmjet ekranit digjital me ngjyra dhe me prekje, mund të caktoni në menynë e procesorit ultrasonik një interval specifik temperature për trajtimin e mostrës suaj me ultratinguj. Aparati ultrasonik do të ndalet automatikisht kur të arrihet temperatura maksimale dhe do të qëndrojë në pauzë derisa temperatura e mostrës të ulet në vlerën e poshtme të intervalit të caktuar të temperaturës ∆. Pastaj trajtimi me ultratinguj rifillon automatikisht. Kjo veçori inteligjente parandalon degradimin e shkaktuar nga nxehtësia.
2. Për sa i përket njësisë ultrasonike VialTweeter për shumë mostra, blloku i titanit, i cili mban tubat e mostrave, mund të ftohet paraprakisht. Vendoseni bllokun VialTweeter (vetëm sonotrodën pa transduktor!) në frigorifer ose në ngrirës për ta ftohur paraprakisht bllokun e titanit, gjë që ndihmon në vonimin e rritjes së temperaturës në mostër. Nëse është e mundur, edhe vetë mostra mund të ftohet paraprakisht.
3. Përdorni një banjë me akull ose akull të thatë për ftohje gjatë sonikimit. Gjatë sonikimit, vendoseni epruvetën ose epruvetat e mostrave në një banjë me akull. Për VialTweeter, përdorni një tabaka të cekët të mbushur me akull të thatë dhe vendoseni VialTweeter mbi akullin e thatë, në mënyrë që nxehtësia të mund të shpërndahet shpejt.

Klientët në mbarë botën përdorin sonikatorët me sondë Hielscher, si edhe njësitë e sonikimit të shumë mostrave VialTweeter dhe UIP400MTP, për punën e tyre të përditshme të përgatitjes së mostrave në laboratorë biologjikë, biokimikë, mjekësorë dhe klinikë. Falë softuerit inteligjent dhe kontrollit të temperaturës të procesorëve Hielscher, temperatura kontrollohet në mënyrë të besueshme dhe shmanget degradimi i mostrave i shkaktuar nga nxehtësia. Përgatitja e mostrave me ultratinguj me zgjidhjet ultrasonike Hielscher jep rezultate shumë të besueshme dhe të riprodhueshme!
Lexoni më shumë rreth sonikimit me kapacitet të lartë përpunimi të mostrave duke përdorur sonikatorin UIP400MTP për pllaka me shumë puseta për analiza!