Përgatitja me ultratinguj e mostrave të C. Elegans

C. elegans, një krimb nematod, është një organizëm model i përdorur gjerësisht në biologji. Përgatitja e mostrës përpara analizës kërkon lizën, nxjerrjen e proteinave dhe lipideve si dhe fragmentimin e ARN-së, të cilat mund të kryhen në mënyrë të besueshme nëpërmjet sonikimit. Ndërprerësit e qelizave tejzanor janë pajisje të besueshme, të sofistikuara dhe të lehta për t'u përdorur për përgatitjen e shpejtë të mostrave të C. elegans.

Përgatitja me ultratinguj e mostrave të C. Elegans

C. elegans janë krimba të rrumbullakët, të cilët përdoren gjerësisht në laboratorët kërkimorë për të hetuar gjenomikën, biologjinë zhvillimore dhe sëmundjet. Shumë gjene në gjenomën e C. elegans kanë homologe funksionale te njerëzit. Kështu, krimbi nematod është një model jashtëzakonisht i dobishëm për sëmundjet njerëzore. Përparësi të tjera për përdorimin e gjerë të C. elegans janë kultivimi i tij i lehtë dhe i lirë në pjata që përmbajnë baktere (p.sh. E. coli), transparenca e tij, trajtimi i përshtatshëm, si dhe mundësia për të ngrirë dhe ruajtur krimbat për një periudhë më të gjatë.
Analiza e proteinave dhe lipideve janë procedura të rregullta në laboratorë dhe përgatitja e mostrës me ultratinguj është metoda e vendosur për lizimin e nematodave C. elegans në çdo fazë zhvillimi (dmth. embrionet, larvat L1-L4, të rriturit). Meqenëse C. elegans përdoret gjithashtu si sistem i shprehjes së proteinave për të mbishprehur proteinat e synuara, kërkohet një metodë e besueshme, e riprodhueshme e lizës dhe ekstraktimit të proteinave, e cila jep rendimente të larta proteinash. Sistemet e ndërprerjes dhe nxjerrjes së qelizave tejzanor janë të disponueshme si homogjenizues të tipit sondë dhe si ultrasonikë me shumë mostra. Duke u përshtatur me përgatitjen e përshtatshme të mostrës dhe të gjitha llojet e numrave të madhësive të mostrës, Hielscher Ultrasonics ka ndërprerësin ideal të qelizave tejzanor për procedurën tuaj laboratorike.

Protokollet tejzanor për Çrregullimin dhe Lizën e C. Elegans

Homogjenizimi dhe liza me ultratinguj e C. elegans dhe ekstraktimi pasues i proteinave dhe lipideve mund të kryhen duke përdorur procedura të ndryshme duke përdorur buferë të ndryshëm homogjenizimi dhe lize etj. Të gjitha protokollet e lizës kanë të përbashkët që mostrat duhet të mbahen vazhdimisht në akull për të parandaluar degradimin e proteinave. Më poshtë, ju paraqesim disa protokolle të besueshme dhe të shpejtë të lizës dhe ekstraktimit tejzanor për përgatitjen e mostrave të C. elegans me përmbajtje proteinash ose lipide të cilësisë së lartë.

Përparësitë e ultrazërit C. elegans Lysis

• E besueshme
• të riprodhueshme
• saktësisht e kontrolluar nga temperatura
• kontroll i besueshëm i procesit
• metodë e butë
• lehtë për tu aplikuar
• I sigurt

Nxjerrja e proteinave me ultratinguj nga mostrat e C. elegans

Liza tejzanor dhe nxjerrja e proteinave të krimbave C. elegans mund të kryhet duke përdorur protokolle të ndryshme. Më poshtë ju paraqesim disa protokolle të besueshme dhe të shpejtë të lizës për rezultate të riprodhueshme të nxjerrjes së proteinave.

Përgatitja e shpejtë e ekstraktit citosolik nga C. elegans Worms nga Sonication

Me protokollin e mëposhtëm mund të përgatisni lizatet e C. elegans në më pak se 30 minuta.
Koleksioni i C. elegans
Zgjedhni krimbat e dëshiruar të C. elegans në një tub 1,5 ml të kripur me fosfat (PBS) ose lajini ato nga një pjatë me 1,5 ml PBS. Centrifugoni në për 1 minutë në 2000 rpm në pelet. Mbani mostrat gjatë gjithë kohës në akull.
Më pas, lani krimbat dy herë me PBS.
Më pas, lani krimbat dy herë me ddH₂O.
Risuspendoni krimbat në të paktën 500 ul buffer homogjenizimi (HB). Mostrat e krimbave tani janë gati për lizë tejzanor.
Për cilësi më të lartë të ekstraktit të proteinave, mund të dëshironi të reduktoni ndotjen bakteriale duke i larë krimbat për 5 minuta secili në PBS dhe ujë steril, ultra të pastër (ddH₂O) ose kryeni lundrimin e saharozës. Mbani mostrat e krimbave vazhdimisht në akull.

Protokolli i Lysis C. elegans me ultratinguj

• Sigurohuni që të përgatisni paraprakisht aparatin ultrasonik në mënyrë që homogjenizuesi tejzanor të jetë gati për përdorim (i montuar në sondë, programi i sonikimit i paracaktuar).

Nëse aparati juaj me ultratinguj është i montuar në këmbë, vendoseni banjën me akull me tubat e mostrës tuaj nën sondën tejzanor dhe futeni sondën tejzanor në tubin 1,5 ml.

• Për lizën e C. elegans me UP200St ose UP200Ht, ultratingulli duhet të kryhet duke përdorur një mikromajë (p.sh. sonda 2 mm S26d2; shih figurën majtas) në amplitudë 40% për 1 sek me pauza 30 sek. 5 cikle sonikimi për çdo 1 sekondë me pauza 30 sekonda janë ideale për C. elegans lysis. Nëse e kryeni lizën për herë të parë, mund të kontrolloni përparimin e lizës në pjesë të vogla të mostrës pas çdo pulsi duke përdorur një mikroskop.
• Liza përfundon me sukses kur krimbat janë ndërprerë. Sonicizimi i tepërt rezulton në thyerjen e bërthamave dhe bëhet e dukshme kur mostra bëhet viskoze ose shkumëzohet. Për të parandaluar degradimin e mostrës, përdorni më shumë impulse nëse është e nevojshme. Mos e rritni kohën e çdo cikli pulsi tejzanor për të marrë ekstrakte proteinash me cilësi të lartë.
• Pastroni lizimin e qelizave duke centrifuguar krimbat e lizuar me ultratinguj në 14,000 rpm për 10 minuta në 4ºC.
• Më pas, transferojeni supernatantin në një tub të freskët dhe përgatituni për imunoprecipitim ose analiza të tjera.

Shënim për tampon homogjenizimi: Përgatitni buferin e homogjenizimit për protokollin e lizës tejzanor të mësipërm si më poshtë:

Lizë me fuqi të lartë të C. elegans në pllaka 96 pusesh duke përdorur Sonicatorin e pllakave UIP400MTP

C. elegans Lysis (nematodë të rritur)
UIP400MTP 80% amplitudë, 20 cikle (çdo cikël sonikimi: 30 sek AKTIV, 30 sek FAKT)
Buferi i lizës:

• Opsioni 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Opsioni 2) për bashkë-imunoprecipitimin (bashkë-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (koktej frenues i plotë i proteinazës)

Fragmentimi i ADN-së me performancë të lartë
C. elegans (nematodë të rritur) ADN 200-300 bp: sonikator i pllakave UIP400MTP – vendosur amplitudë 80%, 30 pulse – çdo 30 sekonda e ndezur, 30 sekonda e fikur

Sonicatori i pllakave UIP400MTP për përgatitjen e mostrës me fuqi të lartë sonikon në mënyrë të njëtrajtshme mostrat në pllaka me shumë pusi, mikrotitra dhe pllaka 96 pusesh

Liza tejzanor e C. elegans për analizat sasiore të pastrimit të afinitetit

Embrionet e C. elegans (rreth 2 milionë për përsëritje) u korrën rishtazi në trefishin biologjik duke zbardhur hermafroditët e rinj gravid dhe u sonikuan në akull (cikli: 0,5 s, amplituda: 40-45%, 5 goditje/sesion, 5 seanca, intervali midis seancave : 30 s; Procesor tejzanor UP200S me mikro-majë S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) në tampon lize (vëllimi i përgjithshëm: ~600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% , përzierje frenuesi i proteazës, 0,1% zëvendësues Nonidet P-40). Pas sonikimit, Nonidet P-40 Substitute u shtua deri në 1% dhe lizat u inkubuan me rrotullim kokë mbi bisht në 4°C për 30 minuta, e ndjekur nga centrifugimi në 20,000 × g për 20 minuta në 4°C. Lizati i pastruar më pas u aspirua pa shqetësuar shtresën e sipërme lipidike dhe u nda përgjysmë ose në rruaza agarozë anti-GFP ose në rruaza kontrolli të bllokuara (40-50 μl). Pas rrotullimit kokë mbi bisht në 4°C për 60-90 min, rruazat u lanë një herë me tampon lize që përmban 0,1% Nonidet P-40 Zëvendësues, e ndjekur nga dy herë larje në secilin tampon I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) ose tampon II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) ose të dyja. Për tërheqjet GFP:MBK-2, u kryen dy eksperimente të veçanta duke përdorur kushte të ndryshme larjeje. Proteinat u eluan me lëkundje orbitale në 50 μl 6 m ure / 2 M tiourea në temperaturën e dhomës. Për eksperimentet e tërheqjes MBK-1::GFP, proteinat u eluan dy herë duke u tundur në 50 μl klorur guanidinium 8 m në 90°C, e ndjekur nga precipitimi me etanol. Mostrat e proteinave të elura u tretën më pas në tretësirë.
(krh. Chen et al., 2016)

Homogjenizimi dhe liza e krimbave tejzanor

Për procedurën e lizës dhe nxjerrjes së proteinave të C.elegans, 30,000 nemotodë të fazës përkatëse u mblodhën për mostër dhe u lanë në S-bazal të ftohtë, të koncentruar me centrifugim në 1500 rpm për 2 minuta, larë gjashtë herë me S- të ftohtë në akull. bazale për të hequr bakteret e mbetura, dhe më pas ruhet në akull derisa të jetë gati për përdorim. Për nxjerrjen e proteinave, krimbat e të rriturve gravid u lejuan të formonin një pelet kompakt pas larjes së fundit S-bazale. Peletat e krimbave u risuspenduan më pas në 1 ml tampon ekstraktimi të ftohtë në akull [20 mM fosfat kaliumi, pH 7.4, 2 mM EDTA, 1% Triton-X-100, frenuesit e proteazës (Sigma P2714)] dhe u përpunuan menjëherë.
~ 30,000 krimba të rritur në gravid (që korrespondojnë me ~ 100 mg peshë të lagësht), u sonikuan në akull duke përdorur ultrasonikë të tipit sondë aa (p.sh. UP50H me mikromajë MS2) në amplitudë 40% për 10 cikle me 3 sekonda fikje, në 30 sek. 1 ml tampon ekstraktimi në akull të ftohtë. (krh. Baskharan et al. 2012)

Nxjerrja e lipideve me ultratinguj nga C. elegans

Në lipidomikë, një degë e metabolomikës, karakterizohet dhe analizohet komplementi lipidik i sistemeve biologjike. C. elegans përdoret gjerësisht në lipidomikë për të hetuar ndërveprimin e lipideve metabolike dhe efektet e tyre në shëndet dhe jetëgjatësi.
Liza dhe nxjerrja tejzanor përdoret për lirimin e lipideve si sfingolipide nga embrionet, larvat dhe krimbat e rritur të C. elegans. Ultratingulli përdoret për të përgatitur homogjenat e krimbave dhe më pas për të nxjerrë lipidet nga kampioni.
Protokolli për nxjerrjen e lipideve me ultratinguj nga C. elegans
Shkrini peletin C. elegans në akull dhe risuspendoni me 0,5 ml ultra ujë. Sonicizoni mostrat e C. elegans në epruveta 1,5 ml, duke i mbajtur mostrat vazhdimisht në akull.
Sonicizimi mund të kryhet duke përdorur një sondë-tejzanor si p.sh UP200Ht, njësia e përgatitjes së mostrës tejzanor VialTweeter (sonikimi i njëkohshëm i 10 mostrave) ose UIP400MTP (për sonikimin e pllakave me shumë pusi si pllakëzat 96 pusesh). Për lizën tejzanor me UP200Ht përdorni mikro-majë S26d2. Paracaktoni modalitetin e ciklit tejzanor në menynë dixhitale. Cakto amplituda në 10% dhe modalitetin e ciklit të tingullit prej 2 sekondash pulsesh prej 20 ciklesh me një pauzë prej 30 sek. ndërmjet çdo shpërthimi pulsimi tejzanor.
Transferoni supernatantët në tuba qelqi me kapak me vidë. Kryeni ekstraktimin Folch duke shtuar 1 ml ultraujë në çdo tub qelqi, më pas duke shtuar 6 ml përzierje kloroform/metanol (raporti = 2:1) në çdo tub qelqi.
Vortizoni çdo tub qelqi për 30 sekonda për 4 herë. Centrifugoni tubat në 1258 xg për 15 minuta (Eppendorf, 5810 R) për të përmirësuar më tej ndarjen e fazës. Transferoni fraksionin e ulët hidrofobik në një tub qelqi të pastër me një pipetë qelqi Pasteur. Thajeni fraksionin e ulët hidrofobik nën rrjedhën e azotit në një avullues azoti. Ruajeni peletin e tharë në frigorifer -80 °C deri në përdorim.

Përgatitja me ultratinguj e lizave të krimbave

Lizati i krimbave: Krimbat e fazës L4 u korrën dhe u lanë tre herë me tampon M9 (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl dhe 0,87 mM MgSO₄) në mënyrë që të largohen të gjitha bakteret. Pas heqjes sa më të madhe të buferit M9, krimbat u risuspenduan në tampon lize: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 5 mM fosfat β-glicerol, 0.1% (v/v) Triton X-100, 50 mM fluorid natriumi, 1 mM ortovanadat natriumi, 5 mM pirofosfat natriumi, 0,2 mM fenilmetansulfonilfluoride dhe frenues proteaze. Krimbat u ngrinë në azot të lëngshëm dhe u shkrinë në 37°C për tre herë, më pas krimbat u sonikuan në akull të thatë me një njësi VialTweeter tejzanor për përgatitjen e njëkohshme të 10 tubave të mostrës. Sonicizimi u krye në amplitudë 50% në 10 cikle prej 2 sekondash. me 30 sekonda pauzë ndërmjet shpërthimeve të sonikacionit. Më pas, mostrat u centrifuguan në 12000 rpm në 4°C për 15 min. Supernatanti u mblodh dhe u ruajt në -70°C. Një sasi e vogël u përdor për përcaktimin e sasisë së proteinave nga analiza Bradford.
Përcaktimi i glutationit total, GSH dhe GSSG: Për përcaktimin e sasisë së glutationit, lizatet dhe përcaktimi u bënë në të njëjtën ditë. Larvat L4 të ushqyera me glukozë dhe ato të kontrollit u mblodhën dhe u lanë me bufer M9 tre herë. Pas heqjes sa më shumë të mundshme të tamponit M9, krimbat u risuspenduan në acid metafosforik të ftohtë (5% w/v), më pas krimbat u sonikuan në akull me një VialTweeter tejzanor në amplitudë 50% në dhjetë cikle sonikimi prej 2 sekondash. me 30 sek. pauzë ndërmjet çdo cikli. Më pas, centrifugohet në 12000 rpm në 4 ̊C për 15 min.
(krh. Alcántar-Fernández et al., 2018)

C. elegans Përgatitja e mostrës përpara imunoprecipitimit dhe Western Blotting

Shkurtimisht, për ekstraktet embrionale, larvat C. elegans L1 u rritën në kultura të lëngshme në shkallë të gjerë S-medium deri në moshën madhore. Embrionet u mblodhën duke përdorur metodën standarde të zbardhuesit dhe u pezulluan në tampon lize (50 mM Tris, pH 7.5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8.7% glicerinë, 0.05% NP-40, 1 Intaile, ~hibicket. 1 * Koktej frenuesi i fosfatazës I dhe II), i ngrirë shpejt në azot të lëngshëm dhe lizohet nga ndërprerja e qelizave tejzanor duke përdorur një aparat ultrasonik me mikromajë si p.sh. UP200Ht me S26d2 për 10 impulse mbi 10 s në amplitudë 30%. Nëse duhet të përgatitet një numër më i madh i mostrave, tejzanor VialTweeter ose rekomandohet MultiSample-Ultrasonicator UIP400MTP për pllaka të puseve. Pas sonikimit, ekstraktet u pastruan paraprakisht me centrifugim në 30,000 g për 20 minuta në 4°C. Ekstrakti i pastruar paraprakisht (300 μg proteina totale) u inkubua me 40 μ*g të antitrupit të pastruar me afinitet anti-CDC-25.1 (ky studim) i ndërlidhur me proteinën A-agarozë, ose si kontroll, një sasi e ngjashme imunoglobuline lepuri (Ig)G e ndërlidhur me proteinën A-agaroze u përdor në një vëllim total prej 200 μl tampon lize që përmban 1% NP-40, përfshirja e të cilit reduktoi lidhjen jospecifike të proteinave me matricën. Mostrat u rrotulluan për 1 orë në 4°C, rruazat u lanë tre herë me tampon lize dhe u eluan me 30 μl glicine/HCl dhe 200 mM NaCl, pH 2.2. Pas imunoprecipitimit, eluatet u holluan në 30 μ * l të tamponit të mostrës SDS, u ngrohën në 95°C për 4 minuta, dhe zakonisht 3% e totalit për hyrje dhe 30% për eluatet u aplikuan në SDS-PAGE pasuar nga Western blotting me anti. -CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubiquitin (1:1000), anti-GSK3 *500 (1:500) ose anti- * * * β-aktinë (1: 2000) antitrupa. Aty ku ekstraktet nuk iu nënshtruan imunoprecipitimit, e njëjta sasi e proteinës totale e përftuar nga ato ekstrakte u risuspendua në tampon kampion SDS, u ngroh në 95°C dhe më pas u aplikua drejtpërdrejt në SDS-PAGE dhe u analizua me Western blotting. (krh. Segref et al. 2020)

Lizë tejzanor nën kontrollin e saktë të temperaturës

Kontrolli i saktë dhe i besueshëm i temperaturës është thelbësor gjatë trajtimit të mostrave biologjike. Temperaturat e larta nisin degradimin e proteinave të induktuara termikisht në mostra.
Si të gjitha teknikat mekanike të përgatitjes së mostrës, sonikimi krijon nxehtësi. Megjithatë, temperatura e mostrave mund të kontrollohet mirë kur përdorni VialTweeter. Ne ju paraqesim opsione të ndryshme për të monitoruar dhe kontrolluar temperaturën e mostrave tuaja gjatë përgatitjes së tyre me VialTweeter dhe VialPress për analizë.

1. Monitorimi i temperaturës së mostrës: Procesori tejzanor UP200St, i cili drejton VialTweeter, është i pajisur me një softuer inteligjent dhe një sensor të temperaturës që mund të mbyllet. Futni sensorin e temperaturës në UP200St dhe futni majën e sensorit të temperaturës në një nga tubat e mostrës. Nëpërmjet ekranit me prekje dixhitale me ngjyra, mund të vendosni në menynë e UP200St një gamë specifike të temperaturës për sonikacionin tuaj të mostrës. Ultrasonikatori do të ndalojë automatikisht kur të arrihet temperatura maksimale dhe do të ndalojë derisa temperatura e mostrës të bjerë në vlerën më të ulët të temperaturës së caktuar ∆. Pastaj sonication fillon automatikisht përsëri. Kjo veçori inteligjente parandalon degradimin e shkaktuar nga nxehtësia.
2. Blloku VialTweeter mund të ftohet paraprakisht. Vendosni bllokun VialTweeter (vetëm sonotrode pa dhënës!) në frigorifer ose ngrirës për të ftohur paraprakisht bllokun e titanit, ndihmon për të shtyrë rritjen e temperaturës në mostër. Nëse është e mundur, edhe vetë kampioni mund të ftohet paraprakisht.
3. Përdorni akull të thatë për t'u ftohur gjatë sonikimit. Përdorni një tabaka të cekët të mbushur me akull të thatë dhe vendosni VialTweeter në akullin e thatë në mënyrë që nxehtësia të mund të shpërndahet me shpejtësi.

Gjeni ndërprerësin optimal të qelizave tejzanor për aplikacionin tuaj Lysis

Hielscher Ultrasonics është prodhues me përvojë për një kohë të gjatë të ndërprerësve dhe homogjenizuesve të qelizave ultrasonike me performancë të lartë për laboratorë, sisteme të shtratit dhe në shkallë industriale. Madhësia e kulturës suaj të qelizave bakteriale, qëllimi juaj i kërkimit ose prodhimit dhe vëllimi i qelizës për t'u përpunuar në orë ose ditë janë faktorë thelbësorë për të gjetur ndërprerësin e duhur të qelizave tejzanor për aplikimin tuaj.
Hielscher Ultrasonics ofron zgjidhje të ndryshme për sonikimin e njëkohshëm të mostrave të shumëfishta (deri në 10 shishe) si dhe mostrat masive (p.sh., pllaka mikrotitërore / pllaka 96 pusesh), ultrasonikatorin klasik laboratorik të tipit sondë me nivele të ndryshme fuqie nga 50 në 400 watts deri në procesorë ultrasonikë plotësisht industrialë me deri në 16,000 vat për njësi për ndërprerjen e qelizave komerciale dhe nxjerrjen e proteinave në prodhim të madh. Të gjithë ultrasonikët Hielscher janë ndërtuar për funksionimin 24/7/365 nën ngarkesë të plotë. Qëndrueshmëria dhe besueshmëria janë tiparet kryesore të pajisjeve tona ultrasonike.
Të gjithë homogjenizuesit dixhitalë tejzanor janë të pajisur me softuer inteligjentë, ekran me prekje me ngjyra dhe protokollim automatik të të dhënave, të cilat e bëjnë pajisjen tejzanor në një mjet pune të përshtatshëm në laborator dhe në ambientet e prodhimit.
Na tregoni se çfarë lloj qelizash, çfarë vëllimi, me çfarë frekuence dhe me çfarë objektivi keni për të përpunuar mostrat tuaja biologjike. Ne do t'ju rekomandojmë ndërprerësin më të përshtatshëm të qelizave tejzanor për kërkesat tuaja të procesit.

Tabela më poshtë ju jep një tregues të kapacitetit të përafërt të përpunimit të sistemeve tona tejzanor nga homogjenizuesit kompakt me dorë dhe ultrasonikët MultiSample deri tek procesorët industrialë ultrasonikë për aplikime komerciale: