Përgatitja me ultratinguj e mostrave të C. Elegans

C. elegans, një krimb nematod, është një organizëm model që përdoret gjerësisht në biologji. Përgatitja e mostrave para analizës kërkon lizë, ekstraktim të proteinave dhe lipideve, si dhe fragmentim të ARN-së, të cilat mund të kryhen në mënyrë të besueshme përmes sonikimit. Pajisjet për shpërbërjen e qelizave me ultratinguj janë pajisje të besueshme, të sofistikuara dhe të lehta për t’u përdorur për përgatitjen e shpejtë të mostrave të C. elegans.

Përgatitja me ultratinguj e mostrave të C. elegans

C. elegans janë krimba të rrumbullakët, të cilët përdoren gjerësisht në laboratorët kërkimorë për të studiuar gjenomikën, biologjinë e zhvillimit dhe sëmundjet. Shumë gjene në gjenomin e C. elegans kanë gjene homologe funksionale te njerëzit. Prandaj, ky krimb nematod është një model jashtëzakonisht i dobishëm për sëmundjet njerëzore. Përparësi të tjera që shpjegojnë përdorimin e gjerë të C. elegans janë kultivimi i tij i lehtë dhe me kosto të ulët në pllaka që përmbajnë baktere (p.sh., E. coli), tejdukshmëria, manipulimi i lehtë, si dhe mundësia për t’i ngrirë dhe ruajtur krimbat për një periudhë më të gjatë.
Analiza e proteinave dhe lipideve është një procedurë e zakonshme në laboratorë dhe përgatitja e mostrave me ultratinguj është metoda e konsoliduar për lizën e nematodëve C. elegans në çdo fazë zhvillimi (d.m.th. embrione, larva L1–L4, të rritur). Meqë C. elegans përdoret gjithashtu si sistem i shprehjes së proteinave për të mbishprehur proteinat e synuara, nevojitet një metodë e besueshme dhe e riprodhueshme për lizën dhe ekstraktimin e proteinave, e cila siguron rendimente të larta proteinash. Sistemet për shpërbërjen e qelizave dhe ekstraktimin me ultratinguj janë të disponueshme si homogjenizues me sondë dhe si sonikatorë për shumë mostra. Duke mundësuar përgatitje të lehtë të mostrave për çdo madhësi dhe numër mostrash, Hielscher Ultrasonics ka pajisjen ideale për shpërbërjen e qelizave me ultratinguj për procedurën tuaj laboratorike.

Protokolle me ultratinguj për shpërbërjen dhe lizën e C. Elegans

Homogjenizimi dhe liza me ultratinguj e C. elegans dhe ekstraktimi pasues i proteinave dhe lipideve mund të kryhen sipas procedurave të ndryshme, duke përdorur solucione të ndryshme tampon për homogjenizim dhe lizë etj. Të gjitha protokollet e lizës kanë të përbashkët kërkesën që mostrat të mbahen vazhdimisht në akull për të parandaluar degradimin e proteinave. Më poshtë ju paraqesim disa protokolle të besueshme dhe të shpejta për lizën dhe ekstraktimin me ultratinguj për përgatitjen e mostrave të C. elegans me cilësi të lartë që përmbajnë proteina ose lipide.

Përparësitë e lizës me ultratinguj të C. elegans

• e besueshme
• e riprodhueshme
• me temperaturë të kontrolluar me saktësi
• kontroll i besueshëm i procesit
• metodë e butë
• e lehtë për t’u zbatuar
• e sigurt

Ekstraktimi i proteinave me ultratinguj nga mostrat e C. elegans

Liza dhe ekstraktimi i proteinave me ultratinguj nga krimbat C. elegans mund të kryhen sipas protokolleve të ndryshme. Më poshtë ju paraqesim disa protokolle të besueshme dhe të shpejta të lizës për rezultate të riprodhueshme të ekstraktimit të proteinave.

Përgatitja e shpejtë e ekstraktit citosolik nga krimbat C. elegans përmes sonikimit

Me protokollin e mëposhtëm mund të përgatitni lizate të C. elegans në më pak se 30 minuta.
Mbledhja e C. elegans
Mblidhini krimbat e dëshiruar C. elegans në një tub 1,5ml me solucion fiziologjik të tamponuar me fosfat (PBS) ose shpëlajini nga një pllakë me 1,5ml PBS. Centrifugojini për 1min në 2000rpm për të formuar sedimentin.  Mbajini mostrat gjatë gjithë kohës në akull.
Pastaj, lajini krimbat dy herë me PBS.
Më pas, lajini krimbat dy herë me ddH₂O.
Risuspendojini krimbat në të paktën 500ul solucion tampon homogjenizimi (HB). Mostrat e krimbave tani janë gati për lizën me ultratinguj.
Për cilësi më të lartë të ekstraktit proteinik, mund të dëshironi të reduktoni ndotjen bakteriale duke i larë krimbat për 5min në secilin prej solucioneve, PBS dhe ujë steril ultrapastër (ddH₂O), ose duke kryer flotacion me saharozë. Mbajini mostrat e krimbave vazhdimisht në akull.

Protokolli i lizës me ultratinguj të C. elegans

• Sigurohuni që ta përgatitni sonikatorin paraprakisht, në mënyrë që homogjenizuesi me ultratinguj të jetë gati për përdorim (sonda e montuar, programi i sonikimit i paracaktuar). 

Nëse sonikatori juaj është i montuar në stativ, vendoseni banjën me akull me epruvetat e mostrave tuaja nën sondën ultrasonike dhe futeni sondën ultrasonike në epruvetën 1,5ml.

• Për lizën e C. elegans me UP200St ose UP200Ht, sonikimi duhet të kryhet duke përdorur një mikromajë (p.sh., sondën 2mm S26d2; shihni figurën majtas) me amplitudë 40% për 1sec me pushime prej 30sec ndërmjet tyre. 5 cikle sonikimi, secili nga 1 sekondë, me pushime prej 30sec janë ideale për lizën e C. elegans. Nëse e kryeni lizën për herë të parë, mund të kontrolloni ecurinë e lizës në alikuota të vogla të mostrës pas çdo pulsi duke përdorur një mikroskop.
• Liza përfundon me sukses kur krimbat janë shpërbërë. Sonikimi i tepërt shkakton çarjen e bërthamave dhe bëhet i dukshëm kur mostra bëhet viskoze ose shkumëzon. Për të parandaluar degradimin e mostrës, përdorni më shumë pulse nëse është e nevojshme. Mos e zgjatni kohën e çdo cikli pulsi ultrasonik, në mënyrë që të përftoni ekstrakte proteinike me cilësi të lartë.
• Kthjellojeni lizatin qelizor duke centrifuguar krimbat e lizuar me ultratinguj me 14 000rpm për 10min në 4ºC.
• Më pas, transferojeni supernatantin në një epruvetë të re dhe përgatiteni për imunoprecipitim ose analiza të tjera.

Shënim për tamponin e homogjenizimit: Përgatiteni tamponin e homogjenizimit për protokollin e mësipërm të lizës ultrasonike si më poshtë:

Lizë e C. elegans me kapacitet të lartë përpunimi në pllaka me 96 puse duke përdorur sonikatorin për pllaka UIP400MTP

Liza e C. elegans (nematoda të rritura)
UIP400MTP amplitudë 80%, 20 cikle (çdo cikël sonikimi: 30 sec AKTIV, 30 sec JOAKTIV)
Tamponi i lizës:

• Alternativa 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Alternativa 2) për koimunoprecipitim (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (koktej i plotë inhibitorësh të proteinazës)

Fragmentim i ADN-së me kapacitet të lartë përpunimi
ADN e C. elegans (nematoda të rritura) 200–300bp: sonikatori për pllaka UIP400MTP – vendosni amplitudën në 80%, 30pulse – secili 30sec aktiv, 30sec joaktiv

Sonikatori për pllaka UIP400MTP për përgatitjen e mostrave me kapacitet të lartë përpunimi i sonikon në mënyrë të njëtrajtshme mostrat në pllaka me shumë puse, pllaka mikrotitrimi dhe pllaka me 96 puse

Lizë ultrasonike e C. elegans për analiza sasiore të pastrimit me afinitet

Embrionet e C. elegans (∼2 milionë për përsëritje) u mblodhën të freskëta në tri përsëritje biologjike duke trajtuar me zbardhues hermafroditë të rinj që mbartnin vezë dhe u sonikuan mbi akull (cikli: 0,5 s, amplituda: 40–45%, 5 pulse/seancë, 5 seanca, intervali ndërmjet seancave: 30 s; procesori ultrasonik UP200S me mikromajën S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) në tampon lize (vëllimi i përgjithshëm: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% glicerol, përzierje inhibitorësh të proteazës, 0,1% Nonidet P-40 Substitute). Pas sonikimit, u shtua Nonidet P-40 Substitute deri në 1% dhe lizati u inkubua me rrotullim nga njëri skaj në tjetrin në 4°C për 30 min, pasuar nga centrifugimi me 20 000 × g për 20 min në 4°C. Lizati i kthjelluar më pas u aspirua pa trazuar shtresën e sipërme lipidike dhe u nda në dy gjysma, njëra për mikrosferat e agarozës anti-GFP dhe tjetra për mikrosferat e kontrollit të bllokuara (40–50 μl). Pas rrotullimit nga njëri skaj në tjetrin në 4°C për 60–90 min, mikrosferat u lanë një herë me tampon lize që përmbante 0,1% Nonidet P-40 Substitute, pasuar nga dy larje në tamponin I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) ose në tamponin II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2), ose në të dy. Për kapjen me afinitet të GFP:MBK-2, u kryen dy eksperimente të veçanta duke përdorur kushte të ndryshme larjeje. Proteinat u eluuan me tundje orbitale në 50 μl ure 6 m/tioure 2 M në temperaturën e dhomës. Për eksperimentet e kapjes me afinitet të MBK-1::GFP, proteinat u eluuan dy herë me tundje në 50μl klorur guanidini 8 m në 90°C, pasuar nga precipitimi me etanol. Mostrat e proteinave të eluuara më pas iu nënshtruan tretjes enzimatike në tretësirë.
(krahaso Chen et al., 2016)

Homogjenizimi dhe liza e krimbave me ultratinguj

Për procedurën e lizës dhe të ekstraktimit të proteinave nga C.elegans, për çdo mostër u mblodhën 30 000 nematode të stadit përkatës dhe u lanë në mjedis S-basal të ftohtë si akulli, u përqendruan me centrifugim në 1500 rpm për 2 min., u lanë gjashtë herë me S-basal të ftohtë si akulli për të larguar bakteret e mbetura dhe më pas u mbajtën mbi akull deri në përdorim. Për ekstraktimin e proteinave, krimbat e rritur me vezë u lanë të formonin një sediment kompakt pas larjes së fundit me S-basal. Sedimentet e krimbave më pas u risuspenduan në 1 ml tampon ekstraktimi të ftohtë si akulli [20 mM fosfat kaliumi, pH 7,4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, inhibitorë të proteazave (Sigma P2714)] dhe u përpunuan menjëherë.
∼30 000 krimba të rritur me vezë (që korrespondojnë me ∼100 mg peshë të lagësht) u trajtuan me ultratinguj mbi akull duke përdorur një aparat ultrasonik me sondë (p.sh. UP50H me mikro-majën MS2), me amplitudë 40%, për 10 cikle me 3 sec aktiv dhe 30 sec joaktiv, në 1 ml tampon ekstraktimi të ftohtë si akulli. (shih Baskharan et al. 2012)

Ekstraktimi i lipideve nga C. elegans me ultratinguj

Në lipidomikë, një degë e metabolomikës, karakterizohet dhe analizohet tërësia e lipideve të sistemeve biologjike. C. elegans përdoren gjerësisht në lipidomikë për të hulumtuar ndërveprimin e lipideve metabolike dhe efektet e tyre në shëndet dhe jetëgjatësi.
Liza dhe ekstraktimi me ultratinguj përdoren për të çliruar lipide, si sfingolipidet, nga embrionet, larvat dhe krimbat e rritur të C. elegans. Trajtimi me ultratinguj përdoret për të përgatitur homogjenate të krimbave dhe më pas për të ekstraktuar lipidet nga mostra.
Protokolli për ekstraktimin e lipideve nga C. elegans me ultratinguj
Shkrini sedimentin e C. elegans mbi akull dhe risuspendojeni me 0,5 ml ujë ultra të pastër. 
Trajtojini mostrat e C. elegans me ultratinguj në epruveta 1,5mL, duke i mbajtur vazhdimisht mbi akull.
Trajtimi me ultratinguj mund të kryhet duke përdorur një aparat ultrasonik me sondë, si UP200Ht, njësinë ultrasonike të përgatitjes së mostrave VialTweeter (trajtimi i njëkohshëm me ultratinguj i 10 mostrave) ose UIP400MTP (për trajtimin me ultratinguj të pllakave me shumë puse, si pllakat me 96 puse).
Për lizën me ultratinguj me UP200Ht, përdorni mikro-majën S26d2. Paracaktoni modalitetin e cikleve ultrasonike në menynë digjitale. Vendosni amplitudën në 10% dhe modalitetin e cikleve të trajtimit me ultratinguj në 20 cikle me impulse prej 2 sec, me një pauzë prej 30 sec. ndërmjet çdo impulsi ultrasonik.
Transferojini supernatantet në epruveta qelqi me kapak me fileto. 
Kryeni ekstraktimin Folch duke shtuar 1 ml ujë ultra të pastër në secilën epruvetë qelqi, e më pas duke shtuar 6 ml 
përzierje kloroform/metanol (raporti = 2:1) në secilën epruvetë qelqi.
Përziejeni me vorteks secilën epruvetë qelqi për 30 sec, 4 herë. 
Centrifugojini epruvetat në 1 258 x g për 15 min (Eppendorf, 5810 R) për të përmirësuar më tej ndarjen e fazave. 
Transferojeni fraksionin e poshtëm hidrofob në një epruvetë qelqi të pastër duke përdorur një pipetë Pasteur prej qelqi. 
Thajeni fraksionin e poshtëm hidrofob nën rrjedhë azoti në një avullues me azot. 
Ruajeni sedimentin e tharë në një ngrirës në -80 °C deri në përdorim. 


Përgatitja e lizateve të krimbave me ultratinguj

Lizati i krimbave: Krimbat e stadit L4 u mblodhën dhe u lanë tri herë me tampon M9 (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl dhe 0,87 mM MgSO₄) për të larguar të gjitha bakteret. Pas largimit të sa më shumë tamponi M9 që ishte e mundur, krimbat u risuspenduan në tampon lizimi: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM fosfat β-gliceroli, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM fluorur natriumi, 1 mM ortovanadat natriumi, 5 mM pirofosfat natriumi, 0,2 mM fluorur fenilmetansulfonili dhe inhibitor proteazash. Krimbat u ngrinë në azot të lëngshëm dhe u shkrinë në 37°C tri herë, pastaj u trajtuan me ultratinguj mbi akull të thatë me një njësi ultrasonike VialTweeter për përgatitjen e njëkohshme të 10 epruvetave me mostra. Trajtimi me ultratinguj u krye me amplitudë 50% në 10 cikle nga 2 sec. me pauza prej 30 sec ndërmjet impulseve të ultratingujve. Më pas, mostrat u centrifuguan me 12 000 rpm në 4°C për 15 min. Supernatanti u mblodh dhe u ruajt në -70°C. Një alikuotë u përdor për përcaktimin sasior të proteinave me analizën Bradford.
Përcaktimi i glutationit total, GSH dhe GSSG: Për përcaktimin sasior të glutationit, përgatitja e lizateve dhe përcaktimi u kryen në të njëjtën ditë. Larvat L4 të ushqyera me glukozë dhe ato të kontrollit u mblodhën dhe u lanë tri herë me tampon M9. Pas largimit të sa më shumë tamponi M9 që ishte e mundur, krimbat u risuspenduan në acid metafosforik të ftohtë si akulli (5% w/v), pastaj u trajtuan në akull me një VialTweeter ultrasonik me amplitudë 50% në dhjetë cikle trajtimi me ultratinguj nga 2 sec. me pauza prej 30 sec. ndërmjet çdo cikli. Më pas, u centrifuguan me 12 000 rpm në 4 ̊C për 15 min.
(krahaso Alcántar-Fernández et al., 2018)

Përgatitja e mostrave të C. elegans përpara imunoprecipitimit dhe Western blotting

Shkurtimisht, për ekstraktet embrionale, larvat L1 të C. elegans u rritën deri në moshën e rritur në kultura të lëngshme në shkallë të gjerë me mjedis S. Embrionet u mblodhën duke përdorur metodën standarde me zbardhues dhe u suspenduan në tampon lizimi (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% glicerol, 0,05% NP-40, 1􏰅 përzierje inhibitorësh të proteazave dhe 1􏰅 përzierje inhibitorësh të fosfatazave I dhe II), u ngrinë shpejt në azot të lëngshëm dhe u lizuan nëpërmjet shpërbërjes qelizore me ultratinguj duke përdorur një aparat ultrasonik me mikromajë, si UP200Ht me S26d2 për 10 impulse gjatë 10 s me amplitudë 30%. Nëse duhet të përgatitet një numër më i madh mostrash, pajisja ultrasonike VialTweeter ose aparati ultrasonik për shumë mostra UIP400MTP për pllaka me puse rekomandohen. Pas trajtimit me ultratinguj, ekstraktet u kthjelluan paraprakisht me centrifugim në 30 000g për 20 min në 4°C. Ekstrakti i kthjelluar paraprakisht (300µg proteina totale) u inkubua me 40µ􏰂g antitrup anti-CDC-25.1 të pastruar me afinitet (ky studim), të lidhur në mënyrë të kryqëzuar me proteinë A-agarozë, ose, si kontroll, u përdor një sasi e ngjashme imunoglobuline (Ig)G lepuri të lidhur në mënyrë të kryqëzuar me proteinë A-agarozë, në një vëllim total prej 200µl tamponi lizimi që përmbante 1% NP-40, shtimi i të cilit reduktoi lidhjen jospecifike të proteinave me matricën. Mostrat u rrotulluan për 1 h në 4°C, rruazat u lanë tri herë me tampon lizimi dhe u eluuan me 30µl glicinë/HCl dhe 200 mM NaCl, pH 2,2. Pas imunoprecipitimit, eluatet u holluan në 30µ􏰂l tamponi SDS për mostra, u ngrohën në 95°C për 4 min dhe zakonisht 3% e sasisë totale për mostrën hyrëse dhe 30% për eluatet u aplikuan në SDS-PAGE, e ndjekur nga Western blotting me antitrupa anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubikuitinë (1:1000), anti-GSK3􏰁 (1:500) ose anti-􏰁β-aktinë (1:2000). Kur ekstraktet nuk iu nënshtruan imunoprecipitimit, e njëjta sasi proteinash totale e përftuar nga ato ekstrakte u risuspendua në tampon SDS për mostra, u ngroh në 95°C dhe më pas u aplikua drejtpërdrejt në SDS-PAGE dhe u analizua me Western blotting. (krahaso Segref et al. 2020)

Lizimi me ultratinguj nën kontroll të saktë të temperaturës

Kontrolli i saktë dhe i besueshëm i temperaturës është thelbësor gjatë trajtimit të mostrave biologjike. Temperaturat e larta nisin degradimin e proteinave në mostra të shkaktuar nga nxehtësia.
Ashtu si të gjitha teknikat mekanike të përgatitjes së mostrave, sonikimi gjeneron nxehtësi. Megjithatë, temperatura e mostrave mund të kontrollohet mirë kur përdoret VialTweeter. Ju paraqesim mundësi të ndryshme për të monitoruar dhe kontrolluar temperaturën e mostrave tuaja ndërsa i përgatitni ato me VialTweeter dhe VialPress për analizë.

1. Monitorimi i temperaturës së mostrës: Procesori ultrasonik UP200St, i cili vë në punë VialTweeter, është i pajisur me softuer inteligjent dhe një sensor temperature që lidhet me prizë. Lidheni sensorin e temperaturës me UP200St dhe futeni majën e sensorit të temperaturës në një nga epruvetat e mostrave. Nëpërmjet ekranit dixhital me prekje me ngjyra, mund të caktoni në menynë e UP200St një interval specifik temperature për sonikimin e mostrës suaj. Sonikatori do të ndalojë automatikisht kur të arrihet temperatura maksimale dhe do të qëndrojë në pauzë derisa temperatura e mostrës të ulet në vlerën e poshtme të diferencës së caktuar të temperaturës ∆. Pastaj sonikimi rifillon automatikisht. Ky funksion inteligjent parandalon degradimin e shkaktuar nga nxehtësia.
2. Blloku i VialTweeter mund të ftohet paraprakisht. Vendoseni bllokun e VialTweeter (vetëm sonotrodën pa transduktor!) në frigorifer ose në ngrirës për të ftohur paraprakisht bllokun e titanit, gjë që ndihmon në vonimin e rritjes së temperaturës në mostër. Nëse është e mundur, edhe vetë mostra mund të ftohet paraprakisht.
3. Përdorni akull të thatë për ftohje gjatë sonikimit. Përdorni një tabaka të cekët të mbushur me akull të thatë dhe vendoseni VialTweeter mbi akullin e thatë në mënyrë që nxehtësia të mund të shpërndahet shpejt.

Gjeni dezintegruesin ultrasonik optimal të qelizave për aplikimin tuaj të lizës

Hielscher Ultrasonics është një prodhues me përvojë shumëvjeçare i dezintegruesve ultrasonikë të qelizave dhe homogjenizuesve me performancë të lartë për laboratorë, sisteme në shkallë tavoline pune dhe sisteme në shkallë industriale. Madhësia e kulturës suaj të qelizave bakteriale, objektivi juaj kërkimor ose i prodhimit dhe vëllimi i qelizave që duhen përpunuar në orë ose në ditë janë faktorë thelbësorë për të gjetur dezintegruesin e duhur ultrasonik të qelizave për aplikimin tuaj.
Hielscher Ultrasonics ofron zgjidhje të ndryshme për sonikimin e njëkohshëm të shumë mostrave (deri në 10 flakonë), si dhe të mostrave në numër të madh (d.m.th., pllaka mikrotitri / pllaka me 96 puse), nga sonikatori klasik laboratorik me sondë me nivele të ndryshme fuqie nga 50 deri në 400 vat deri te procesorët ultrasonikë plotësisht industrialë me deri në 16,000vat për njësi për dezintegrimin komercial të qelizave dhe nxjerrjen e proteinave në prodhim në shkallë të gjerë. Të gjithë sonikatorët Hielscher janë ndërtuar për funksionim 24/7/365 me ngarkesë të plotë. Qëndrueshmëria dhe besueshmëria janë veçori thelbësore të pajisjeve tona ultrasonike.
Të gjithë homogjenizuesit ultrasonikë dixhitalë janë të pajisur me softuer inteligjent, ekran me prekje me ngjyra dhe regjistrim automatik të të dhënave, të cilat e bëjnë pajisjen ultrasonike një mjet pune praktik në laborator dhe në mjediset e prodhimit.
Na tregoni çfarë lloj qelizash, çfarë vëllimi, me çfarë shpeshtësie dhe me çfarë objektivi duhet t’i përpunoni mostrat tuaja biologjike. Ne do t’ju rekomandojmë dezintegruesin ultrasonik të qelizave më të përshtatshëm për kërkesat e procesit tuaj.

Tabela më poshtë ju jep një ide për kapacitetin e përafërt të përpunimit të sistemeve tona ultrasonike, nga homogjenizuesit kompaktë që mbahen në dorë dhe sonikatorët për shumë mostra deri te procesorët ultrasonikë industrialë për aplikime komerciale: