Teknologjia e ultrazërit Hielscher

Nxjerrja tejzanor e proteinave nga indet dhe kulturat e qelizave

  • Ekstraktimi i proteinave është një hap thelbësor i përgatitjes së mostrës në proteomik.
  • Proteinat mund të nxirren nga indet bimore dhe shtazore, maja dhe mikroorganizmat.
  • Sonication është një metodë e besueshme dhe e efektshme e nxjerrjes së proteinave që jep jepnin e lartë të proteinave brenda një kohe të shkurtër ekstraktimi.

 

Nxjerrja e proteinave nga indet dhe qelizat

Nxjerrja e proteinave nga indet dhe qelizat e kultivuara është një hap thelbësor i përgatitjes së mostrës që kryhet gjatë shumë teknikave biokimike dhe analitike si ELISA, PAGE, Western blotting, spektrometria masive ose pastrimi i proteinave. tejzanor përçarje qelizore, liza dhe nxjerrje është një teknikë e kontrolluar saktësisht për të siguruar rendiment të lartë të proteinave.

Ekstraktimi i proteinave nga indet e kafshëve

Për përgatitjen e indeve me përmasa të plota (p.sh. veshkave, zemrës, mushkërive, muskujve etj.), Indi duhet të shpërndahet në copa shumë të vogla me mjete të pastra, mundësisht në akull, dhe sa më shpejt që të jetë e mundur për të parandaluar degradimin nga proteazat (p.sh. tampon lizash siç është RIPA ose tamponi hipotalonik i lizës që përmban proteina dhe koktej frenues fosfataza). Pas shpërndarjes, mostra është zhytur në azot të lëngshëm për ngrirje të parakohshme. Kampioni mund të ruhet në -80 ° C për përdorim të mëvonshëm ose të jetë i pastër në akull për homogjenizim të menjëhershëm. Menjëherë para ekstraktimit tejzanor, bufferi i lizës së akullit (me frenues të proteinazës DTT, leupeptin dhe aprotinin) shtohet me shpejtësi në tubin e mostrës (rekomandohen për mg 10 mg inde përafërsisht ~ 600 μL tampon). Përafërsisht. Rekomandohen 20-60mg inde për tubin e mostrës.
Homogjenizimi tejzanor, liza dhe nxjerrja kryhet me një homogenizues tejzanor siç është UP200Ht ose UP200St, të pajisur me një sonotrode mikro-tip. Kohëzgjatja e zërit është 60-90 sek. në një mënyrë të ciklit tejzanor prej 15 sec. sonication dhe 10 sek. pushimi i kohës. Mostra duhet të mbahet në akull gjatë gjithë kohës.
Pas homogjenizimit / nxjerrjes tejzanor, lizat centrifugohen në 27,000g për përafërsisht. 20 min. Më pas, supernatenti mblidhet, kështu që përqendrimi i proteinave mund të përcaktohet nga një analizë e proteinave siç është analiza e proteinës Pierce BCA.

Sonication e proteinave është një metodë e rëndësishme e përgatitjes së mostrës

Nxjerrja e proteinave tejzanor nga qelizat me UP200St

Kërkesë informacioni





Ekstraktimi i proteinës nga serumi i gjakut

Për një përzierje homogjene të serumit dhe buferit të fosfateve, mostër vortohet para së gjithash para lizës qelizore ultratinguj. Për lizën tejzanore, mostra është sonicated me një homogenizer tejzanor laborator të tilla si UP100H për 8 cikle me amplitudë 20%, për ciklet e çdo 5 sekonda dhe 15 sekonda. Sonocation kryhet nga sonicationg në cikle dhe duke e vendosur mostrën në akull në mënyrë që të shmanget një mbinxehje dhe degradimi termik i mostrës. Meqenëse serumi përmban një sasi të madhe të proteinave të peshës molekulare të lartë (të tilla si albumina, α1-antitripsina, transferriini, haptoglobulina, imunoglobulina G dhe imunoglobulina A), të cilat ndërhyjnë në ndarjen e proteinave me peshë molekulare të ulët gjatë IEF-së, rekomandohet t'i zbrazni ato nga serumi duke përdorur një kolonë shterimi.

Ekstraktimi i proteinave nga indet bimore

Indet e freskëta, të buta të bimëve, p.sh. myshk etj., Mund të prishen lehtësisht duke e vendosur thjesht materialin e copëtuar të mostrës në tampon për lizëzim. Indet e forta, të rrjedhshme të bimëve, të tilla si farat, hala bredhi etj., Duhet të jenë të thata në tokë. Disa materiale bimore të forta, me dru, duhet të jenë të ngrira dhe të grumbullohen në azot të lëngshëm përpara se të nxirren nga zërit. Për pezullimet e kulturës së qelizave bimore, një trajtim tejzanor midis 30 dhe 150 sekondave në një tampon lizi është kryesisht i mjaftueshëm. Materiali më i fortë siç janë farat e kungullit kërkojnë një zërit më intensiv siç përshkruhet më poshtë.

Protokolli për ekstraktimin tejzanor të albuminës nga farat e kungujve

Homogenizues tejzanor UP400St me S24d40 - për nxjerrjen e proteinave nga bimët dhe indet e kafshëve (Kliko për ta zmadhuar!)Për ekstraktimin tejzanor të proteinave të albuminës nga pluhuri i farës së kungujve me gjobë terren, 10 g farë pluhur i derdhur i kungujve dhe 100 ml ujë të deionizuar si tretës shtohen në një gotë qelqi 250 ml. Ekstraktimi i proteinave konsiston në dy hapa: Së pari, mostra është e sonikuar me një ultrasonicator të llojit të sondës UP400St (400W, 24kHz) me sonotrode montuar S24d7. Gota e qelqit vendoset në një banjë me ujë të ftohtë gjatë homogjenizimit tejzanor. Vendosja e ultrasonicator UP400St me sensor të temperaturës së integruar sigurohet që temperatura e mostrës të jetë gjithmonë nën 30 ° C. Me kontrollin e saktë të temperaturës gjatë sonikimit, shmanget një denaturim i albuminës. Së dyti, nxjerrja u krye me një mikser me shpejtësi 200 rpm dhe në 30 ° C. Më pas, gota u transferua në një shaker termostatik. Globulin hiqet nëpërmjet dializës me ujë të distiluar. Pas heqjes së globulines, ekstrakti i proteinës mund të provohet për përcaktimin e profilit të albuminës dhe më pas përshtatet me pI = 3.0 duke përdorur 0.1 M HCl për koagulimin e albuminës. Faza e ngurtë ndahet me centrifugim në 5000g, 20 ° C dhe rilizet në ujë të deionizuar. Koagulimi i albuminës kryhet dy herë për të rritur raportin e proteinës në koncentratin e albuminës.

Ekstraktimi tejzanor i proteinave alkaline për përgatitjen e koncentratit të proteinës nga krunda e orizit tregon se trajtimi tejzanor rezulton me një rendiment më të lartë proteina në një kohë shumë më të shkurtër të nxjerrjes – krahasuar me metodat e nxjerrjes konvencionale.

VialTweeter tejzanor për nxjerrjen e proteinave nga mostra të indeve (Kliko për ta zmadhuar!)

VialTweeter për sonication indirekt.

Përparësitë

  • i shpejtë
  • rendimentet e larta
  • shumë efikas
  • Kontroll i saktë mbi parametrat
  • Rezultatet e riprodhueshme
  • Skalabilitet linear

Protokolli i përgatitjes së mostrës për enzimë funksionale iNOS

Për të marrë enzimë plotësisht funksional iNOS (p.sh. për ekzaminimin e ilaçeve), rekomandohet protokolli i mëposhtëm: Suspensioni i qelizës duhet të vendoset në akull dhe sonik me një UP100H në amplitudë 10μm në mënyrë të ciklit prej 5 sec. sonication dhe 25 sek. pushoni në akull. Procedura duhet të përsëritet përafërsisht. 3 herë. Koha e pushimit në mes të cikleve të zërit redukton rritjen e temperaturës dhe prandaj do të zvogëlojë rrezikun e denaturimit.

Solubilizimi tejzanor i proteinave

Sonication mund të përshpejtojë procesin e solubilizimit të proteinave, që zakonisht kërkon disa orë. Në mënyrë që të mos overheat mostër dhe për të parandaluar degradimin e proteinave dhe modifikimet në zgjidhje që përmbajnë ure, breshëri tejzanor nuk duhet të zgjasë më shumë se disa sekonda.

Udhëzimet e Përgjithshme

Kontrolli i temperaturës: Për të siguruar një yield të lartë proteinash pa denaturation termike, temperatura gjatë nxjerrjes duhet të kontrollohet. Homogenizuesit tejzanor të Hielscher-it – i quajtur edhe disintegrator tejzanor ose sonificator – janë saktësisht të kontrollueshme. Ata vijnë me një sensor të temperaturë të integruar. Në opsionet e vendosjes së homogenizuesit tejzanor, mund të vendoset një temperaturë maksimale. Kur arrihet maksimumi i temperaturës, ultrasonicator ndalet automatikisht derisa kampioni të jetë ftohur.
Buffer: Zgjedhja e një tampon të përshtatshëm dhe vëllimi i duhur i tamponëve ndryshon nga indi tek indeksi dhe duhet të figurojë nga testimi i testimit dhe gabimit.
Izolimi / pastrimi: Lizatet e proteinave mund të përmbajnë një tepërt të biomolekulave të tilla si ADN ose karbohidratet, të cilat mund të hiqen nga reshjet e proteinave (acid deoksikolati-trikloroacetik) ose shkëmbimi i tamponëve.

Chittapalo dhe Noomhorm (2009) raportuan se rritja e proteinave u rrit duke përdorur sonication dhe se homogjenizimi i indeve të tejzanor dhe procesi i lizës mund të përmirësojnë proceset ekzistuese të nxjerrjes në mënyrë të konsiderueshme – duke bërë të mundur për mundësi të reja nxjerrëse tregtare.

Mbrojtje me zë me mbylljen e zërit të Hielscher SPB-L dhe pajisjen tejzanor UP200St. (Kliko per te zmadhuar!)

Homogenizues tejzanor i indeve UP200St për nxjerrjen efikase të proteinave

Kontroll i saktë i trajtimit tejzanor (Kliko për ta zmadhuar!)

Kontrolli i shfletuesit për funksionimin e saktë dhe monitorimin e procesit të zërit

Pajisje tejzanor për nxjerrjen e proteinave

Hielscher Ultrasonics ofrojnë një gamë të gjerë të homogjenizuesve tejzanorë për shpërbërjen e qelizave, indeve, baktereve, mikroorganizmave, maja dhe spore.
Hielscher laboratorë ultrasonicators janë të fuqishme dhe të lehtë për të vepruar. Ndërtuar për funksionimin 24/7, ato janë projektuar si laboratore të fuqishme dhe efikase të laboratorëve dhe të stolit. Për të gjitha pajisjet, prodhimi i energjisë dhe amplitudë mund të kontrollohen saktësisht. Gamë të gjerë të aksesorë hap opsionet e mëtejshme të konfigurimit. Pajisjet digjitale të tilla si VialTweeter, UP200Ht, UP200St, dhe UP400St kanë një kontroll të integruar të temperaturës dhe një kartë të integruar SD për regjistrimin automatik të të dhënave.
Për indikacionin, sonication pa ndërthurje dhe simultan të mostrave të shumta, ne ofrojmë VialTweeter ose Kornizë tejzanor.
Në varësi të vëllimit të aplikacionit, materialit dhe mostrës, ne do t'ju rekomandojmë konfigurimin më të përshtatshëm për përgatitjen tuaj të mostrës. Na kontaktoni sot!

Na kontaktoni! / Pyet Na!

Ju lutemi përdorni formularin e mëposhtëm, nëse dëshironi të kërkoni informacione shtesë rreth homogjenizimit tejzanor. Ne do të jemi të lumtur t'ju ofrojmë një sistem tejzanor që plotëson kërkesat tuaja.









Ju lutem vini re tonë Politika e privatësisë.


Letërsi / Referencat

  • Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ekstraktimi i alkali i tejdukshëm i proteinave nga krundja e orizit të dëmtuar dhe vetitë e proteinave të përqëndruara. Int J Food Sci Technol 44: 1843-1849.
  • Simões, André ES:; Pereira, Diane M .; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofje E .; Rodrigues, Pedro M .; Lo, Adrian C .; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J .; Thibodeau, Stephen N .; Borralho, Pedro M .; Rodrigues, Cecília MP (2013): Rimëkëmbja e efektshme e proteinave nga mostrat e burimit të shumëfishtë pas nxjerrjes së trizolit ose trizolit LS RNA dhe ruajtjes afatgjatë. BMC Genomics 2013, 14: 181.


Fakte të vlefshme

proteomics

Proteomika është fusha e hulumtimit që heton proteinat dhe proteomin. Proteinat mbushin një grup të gjerë të funksioneve vitale brenda organizmave. Proteomi është i tërë grupi i proteinave të shprehura nga një gjenom, qelizë, indet ose organizëm në një kohë të caktuar. Proteomi ndryshon me kohën dhe kërkesat e veçanta, ose thekson, se një qelizë ose organizëm i nënshtrohet. Më konkretisht, është grupi i proteinave të shprehura në një lloj të caktuar të qelizës ose organizmit, në një kohë të dhënë, nën kushte të përcaktuara. Termi është një përzierje e proteinave dhe gjenomit. Proteomika është studimi i proteomës.

proteinë

Proteinat janë biomolekula të mëdha, të ashtuquajtura makromolekula – të cilat përbëhen nga një ose më shumë zinxhirë të gjatë të mbetjeve të aminoacideve. Proteinat janë të pranishme në të gjitha organizmat me prejardhje bimore dhe shtazore dhe ato janë vendimtare për shumicën e funksioneve biologjike. Pasi që proteinat përmbajnë shumë informacione biologjike, ato nxirren për qëllime analitike, p.sh. për hulumtime proteomike. Funksioni më i rëndësishëm i kryer nga proteinat përfshin katalizmin e reaksioneve metabolike, replikimin e ADN-së, përgjigjen ndaj stimujve dhe transportin e molekulave nga një vend në tjetrin. Proteinat ndryshojnë nga njëri-tjetri kryesisht në sekuencën e tyre të aminoacideve, gjë që diktohet nga sekuenca nukleotide e gjeneve të tyre dhe që zakonisht rezulton në mbështjelljen e proteinave në një strukturë tre-dimensionale specifike që përcakton aktivitetin e saj. Proteinat janë – përveç peptideve – një nga komponentët kryesorë të ushqimit. Prandaj, proteomika është një mjet i fuqishëm në shkencën ushqimore për të optimizuar proceset, sigurinë e ushqimit dhe vlerësimin ushqimor.

Elektroforeza e Gel

Elektroforeza e geleve është metoda kryesore për ndarjen dhe analizën e makromolekulave të tilla si ADN, ARN dhe proteinat, si dhe fragmente të tyre, bazuar në madhësinë dhe ngarkimin e tyre. Përdoret në kimin klinike për të ndarë proteinat nga ngarkesa dhe / ose madhësia (IEF agaroza, në thelb madhësia e pavarur) dhe në biokimi, biologji molekulare dhe proteomika për të ndarë një popullatë të përzier të fragmenteve të ADN-së dhe RNA-së sipas gjatësisë, për të vlerësuar madhësinë e ADN-së dhe fragmenteve të ARN-së ose për të ndarë proteinat nga ngarkesa.

Kulturat e qelizave

Kultura e qelizave është procesi i kontrolluar i rritjes me anë të të cilit qelizat kultivohen në kushte të kontrolluara. Kushtet e kulturës së qelizës ndryshojnë për secilën tip qelizash. Në përgjithësi, mjedisi i një kulture qelizore përbëhet nga një enë e përshtatshme (p.sh. gjellë Petri) me substrat ose medium që furnizon ushqyesve thelbësor (aminoacidet, karbohidratet, vitaminat, mineralet), faktorët e rritjes, hormonet dhe gazrat (CO2, O2), dhe rregullon mjedisin fiziko-kimik (pH buffer, presion osmotik, temperatura). Shumica e qelizave kanë nevojë për një sipërfaqe ose substrate artificiale, ndërsa kulturat e tjera të qelizave mund të kultivohen pa lundrues në mjedisin e kulturës (kultura e pezullimit, pezullimi i qelizave).
Kulturat masive të linjave të qelizave shtazore përdoren në prodhimin industrial të vaksinave virale dhe produkteve të tjera që rrjedhin nga bioteknologjia. Qelizat burimore njerëzore kultivohen për të zgjeruar numrin e qelizave dhe për t'i diferencuar qelizat në lloje të ndryshme qelizash somatike për qëllime transplantimi.

Mostrat e indit

Indeksi i termit përshkruan një ndërmjetësim qelizor, ku materiali i qelizës është në një nivel organizativ midis qelizave dhe një organi të plotë. Në inde, qelizat e ngjashme, nga e njëjta origjinën që bashkërisht kryejnë një funksion të veçantë, grumbullohen. Nga grupimi funksional i indeve të shumëfishta, formohen strukturat komplekse të organeve.
Indet merren për hulumtime në biologji, histologji / histopatologji, parazitologji, biokimi, imunohistokimi si dhe për të kultivuar dhe nxjerrë ADN. Mund të bëhet dallimi midis kafshëve (nënndarja: indi i gjitarëve) dhe indet bimore. Indet e kafshëve grupohen në katër llojet themelore të indit lidhës, muskulor, nervor dhe epitelial. Indet bimore ndahen në tre sistemet e mëposhtme të indeve: epidermën, indin tokësor dhe indin vaskular.
Mostrat e indit mund të përgatiten nga pjesët e kafshëve ose të bimëve, p.sh. kocka, muskuj, gjethe etj.

Lëngjet e trupit

Gjaku, serumi, plazma, lëngu cerebrospinal, pështymë dhe lëngu synovial janë lëngjet e trupit, të cilat ofrojnë një burim të madh të informacionit diagnostikues relevant. Prandaj, një përgatitje e sofistikuar e mostrave të lëngjeve trupore për analiza është e rëndësishme. Vështirësia e parë lidhet me gamën e gjerë dinamike të komponentëve të pranishëm në lëngjet e trupit.

Përcaktimi i përqendrimit të proteinave

Analiza Bradford, analiza Lowry dhe analiza BCA (bicinchoninic acid) janë analiza të zakonshme për të përcaktuar përqendrimin e proteinave. Albumina serum e gjedhit (BSA) është një nga standardet më të përdorura të proteinave.

Lysis Buffer

Tensusi i lizës duhet të zgjidhet në përputhje me materialin qelizor ose indet (kultura e indeve, bimët, bakteret, kërpudhat etj) dhe nëse qelizat janë në një strukturë dhe llojin e strukturës. Një gamë e gjerë e mbulesave të lizës për nxjerrjen e proteinave, membranave dhe organeleve janë formuluar me një ose më shumë detergjente. Detergjenti zakonisht zgjidhet nëpërmjet testeve të provës dhe gabimit ose – nëse në dispozicion – sipas një protokolli ekzistues të nxjerrjes së proteinave. Pastruesi duhet të jetë në përputhje me burimin e indeve dhe proteinat. Në përgjithësi, detergjenti më i butë që punon për një indet / proteinë specifike, zgjidhet për të ruajtur funksionalitetin maksimal të ekstraktit. Për më tepër, në rast të nxjerrjes së membranave dhe organeleve, një pastrues i butë e mban membranën të paprekur. Detergjentët e zakonshëm që përdoren në lëngëzimin e lizës janë kryesisht joionik ose zwitterionik, p.sh. CHAPS, deoksikolat, Triton ™ X-100, NP40 dhe Tween 20.
Për shembull, indet si truri, mëlçia, zorrët, veshka, shpretka etj mund të thjeshtohen me RIPA – megjithatë, inhibitorët e proteazës dhe DTT (p.sh. për elektroforezën e xhelit) duhet të përfshihen.
Tensili i lizës për indet e muskujve skeletor (akulli i ftohtë): 20 mM Tris (pH 7.8), 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 10% (w / v) glicerinë, 1 mM EDTA , 1 mM dithiothreitol plotësohet me proteazë dhe koktej frenues të fosfatazës
Tabela e buferëve të përbashkët dhe diapazoni i tyre i pH. Në përgjithësi, këto puffers zakonisht përdoren në përqëndrime prej 20-50 mM.

zbutës varg pH
Acid citrik – NaOH 2.2 – 6.5
Citrate sodium – Acid citrik 3.0 – 6.2
Acetat natriumi – acid acetik 3.6 – 5.6
Kripë natriumi acid cacajlik – HCl 5.0 – 7.4
MASH – NaOH 5.6 – 6.8
Fosfat dihidrogjen natriumi – fosfat hidrogjen dinatriumi 5.8 – 8.0
imidazole – HCl 6.2 – 7.8
mOPS – KOH 6.6 – 7.8
Hidroklorid trietanolamine – NaOH 6.8 – 8.8
Tris – HCl 7.0 – 9.0
HEPES – NaOH 7.2 – 8.2
Tricine – NaOH 7.6 – 8.6
Sodium tetraborate – acid borik 7.6 – 9.2
Bicine – NaOH 7.7 – 8.9
Glycine – NaOH 8.6 – 10.6

Shumica e mbulesave tregojnë një varësi pH-je me temperaturën. Kjo është veçanërisht e vërtetë për mbulesat Tris. PKa ndryshon nga 8,06 në 25 ° C në 8,85 në 0 ° C.
(pH dhe pKa e një tampon: pH e mat përqendrimin e joneve të hidrogjenit në një solucion ujor. pKa (= konstanta e shpërndarjes së acidit) është një masë e lidhur, por më e veçantë, në atë që ndihmon për të parashikuar se si një molekulë do të veprojë në një vlera e pH.)

TRIzol

TRIzol është një zgjidhje kimike e përdorur për nxjerrjen e ARN / ADN / proteina gjatë nxjerrjes së thiocianatit-fenol-kloroformit guanidinium. Përdorimi i nxjerrjes ultravjollcë të TRIzol rezulton në nivel të lartë të ADN-së, ARN-së dhe proteinave nga e njëjta mostër dhe shkëlqen në këtë mënyrë në metodat e tjera të nxjerrjes.