Nxjerrja e proteinave me ultratinguj nga kulturat e indeve dhe qelizave
- Nxjerrja e proteinave është një hap thelbësor i përgatitjes së mostrës në proteomikë.
- Proteinat mund të nxirren nga indet bimore dhe shtazore, majatë dhe mikroorganizmat.
- Sonication është një metodë e besueshme dhe efikase e nxjerrjes së proteinave që jep rendimente të larta të proteinave brenda një kohe të shkurtër ekstraktimi.
Nxjerrja e proteinave nga indet dhe qelizat
Nxjerrja e proteinave nga indet dhe qelizat e kultivuara është një hap thelbësor i përgatitjes së kampionit i cili kryhet gjatë shumë teknikave biokimike dhe analitike si ELISA, PAGE, Western blotting, spektrometria e masës ose pastrimi i proteinave. Ndërprerja, liza dhe nxjerrja e qelizave tejzanor është një teknikë saktësisht e kontrollueshme, jo termike për të siguruar rendimente të larta të proteinave.
Nxjerrja e proteinave nga qelizat me sonda tejzanor UP200St
- E shpejte
- rendimentet e larta
- Shumë efikas
- Kontroll i saktë mbi parametrat
- rezultate të riprodhueshme
- shkallëzueshmëria lineare
Udhëzime të përgjithshme për lizën tejzanor dhe nxjerrjen e proteinave
- Kontrolli i temperaturës: Për të siguruar një rendiment të lartë të proteinave pa denatyrim termik, temperatura gjatë nxjerrjes duhet të kontrollohet. Homogjenizuesit tejzanor të teknologjisë së fundit të Hielscher – i quajtur edhe shpërbërës tejzanor ose ultrasonifier – janë saktësisht të kontrollueshme. Ato vijnë me një sensor të temperaturës me prizë. Në opsionet e cilësimeve të homogjenizuesit tejzanor, mund të vendoset një temperaturë maksimale. Kur arrihet kjo maksimum i temperaturës, aparati ultrasonik ndalon automatikisht derisa kampioni të ftohet.
- Tampon: Zgjedhja e një tamponi të përshtatshëm dhe vëllimi i duhur i tamponit ndryshon nga indi në ind dhe duhet të përcaktohet me anë të testimit të provës dhe gabimit.
- Izolimi / pastrimi: Lizatet e proteinave mund të përmbajnë një tepricë biomolekulash si ADN ose karbohidrate, të cilat mund të hiqen nga precipitimi i proteinave (acidi deoksikolat-trikloroacetik) ose shkëmbimi i tamponit.
Chittapalo dhe Noomhorm (2009) raportuan në studimin e tyre se rendimenti i proteinave u rrit duke përdorur sonikimin dhe se procesi i homogjenizimit dhe lizës së indeve tejzanor mund të përmirësojë ndjeshëm proceset ekzistuese të nxjerrjes. – duke mundësuar mundësi të reja të nxjerrjes tregtare.
Kupa tejzanor për përgatitjen e njëkohshme të mostrës shumë efikase të mostrave të shumta në të njëjtat kushte për izolimin e proteinave dhe fragmentimin e ADN-së.
Nxjerrja e proteinave nga indet e kafshëve
Për përgatitjen e indeve me përmasa të plota (p.sh. veshka, zemra, mushkëritë, muskujt etj.), indi duhet të ndahet në copa shumë të vogla me mjete të pastra, mundësisht në akull, dhe sa më shpejt që të jetë e mundur për të parandaluar degradimin nga proteazat (p.sh. tampon lize si RIPA ose tampon hipotonik i lizës që përmban koktej proteazë dhe frenues të fosfatazës). Pas disektimit, kampioni zhytet në azot të lëngshëm për ngrirje të menjëhershme. Mostra mund të ruhet në -80°C për përdorim të mëvonshëm ose të mbahet në akull për homogjenizim të menjëhershëm. Menjëherë përpara ekstraktimit me ultratinguj, tamponi i lizës së ftohtë në akull (me frenuesit e proteazës DTT, leupeptin dhe aprotinin) shtohet me shpejtësi në tubin e mostrës (për ~ 10 mg ind, përafërsisht ~ 600 μL tampon rekomandohen). Përafërsisht. Rekomandohet 20-60 mg ind për tub mostër.
Homogjenizimi tejzanor, liza dhe nxjerrja kryhet me një homogjenizues tejzanor siç është UP100H ose UP200Ht, i pajisur me një sonotrode mikro-maje. Kohëzgjatja e sonikacionit është 60-90 sek. në një modalitet cikli tejzanor prej 15 sekondash. sonikacion dhe 10 sek. koha e pushimit. Mostra duhet të mbahet në akull gjatë gjithë kohës.
Pas homogjenizimit / ekstraktimit me ultratinguj, lizati centrifugohet në 27,000 g për rreth. 20 min. Më pas mblidhet supernatenti, në mënyrë që përqendrimi i proteinës të mund të përcaktohet me një analizë proteine siç është analiza e proteinës Pierce BCA.
Nxjerrja e proteinave nga serumi i gjakut
Për një përzierje homogjene të serumit dhe tamponit të fosfatit, mostra vorbullohet së pari përpara lizës së qelizave tejzanor. Për lizën tejzanor, kampioni sonikohet me një homogjenizues laboratorik me ultratinguj si UP100H për 8 cikle me amplitudë 20%, për cikle me 5 sekonda dhe 15 sekonda fikur. Nxjerrja e proteinave kryhet duke sonikuar në cikle (modaliteti i pulsimit) dhe duke e vendosur kampionin në akull në mënyrë që të shmanget mbinxehja dhe degradimi termik i kampionit. Meqenëse serumi përmban një sasi të madhe të proteinave me peshë të lartë molekulare (si albumina, α1-antitripsina, transferina, haptoglobulina, imunoglobulina G dhe imunoglobulina A), të cilat ndërhyjnë në ndarjen e proteinave me peshë molekulare të ulët gjatë IEF, rekomandohet që ato të shterrohen. nga serumi duke përdorur një kolonë zbrazjeje.
Nxjerrja e proteinave nga indet bimore
Indet e freskëta, të buta bimore, p.sh. myshk etj., mund të prishen lehtësisht duke vendosur thjesht materialin e mostrës së copëtuar në tampon lize për sonikim. Indet bimore të forta, ligjene, të tilla si farat, gjilpërat e bredhit etj., duhet të bluhen të thata. Disa materiale bimore të forta, drunore duhet të ngrihen dhe bluhen në azot të lëngshëm përpara se të nxirren me anë të sonikimit. Për pezullimet e kulturës së qelizave bimore, një trajtim me ultratinguj midis 30 dhe 150 sekondash në një tampon lize është kryesisht i mjaftueshëm. Materiali më i fortë si farat e kungullit kërkojnë një sonikim më intensiv siç përshkruhet më poshtë.
Protokolli për nxjerrjen tejzanor të albuminës nga farat e kungullit
Për nxjerrjen e proteinave tejzanor të albuminës nga pluhuri i farës së kungullit të bluar imët, 10 g pluhur të farës së kungullit të çyndosur dhe 100 mL ujë të dejonizuar si tretës shtohen në një gotë qelqi 250 ml. Nxjerrja e proteinave konsiston në dy hapa: Së pari, kampioni sonikohet me një ultrasonikator i tipit sondë UP400St (400W, 24kHz) i pajisur me sonotrode S24d7. Gota e qelqit vendoset në një banjë me ujë të ftohtë gjatë homogjenizimit me ultratinguj. Sensori i temperaturës me mbyllje dhe cilësimet e kontrollit të temperaturës të ultrasonikatorit UP400St sigurojnë që temperatura e kampionit të mbahet gjithmonë nën 30°C. Me kontrollin e saktë të temperaturës gjatë sonikimit, shmanget denatyrimi i albuminës. Së dyti, nxjerrja u krye me mikser me shpejtësi 200 rpm dhe në 30°C. Më pas gota transferohet në një tundës termostatik. Globulina hiqet me anë të dializës me ujë të distiluar. Pas heqjes së globulinës, ekstrakti i proteinës mund të merret kampion për përcaktimin e profilit të albuminës dhe më pas rregullohet në pI=3.0 duke përdorur 0.1 M HCl për koagulimin e albuminës. Faza e ngurtë ndahet me centrifugim në 5000g, 20°C dhe rishpërndahet në ujë të dejonizuar. Koagulimi i albuminës kryhet dy herë për të rritur raportin e proteinave në koncentratin e albuminës.
Nxjerrja tejzanor e proteinave alkaline për përgatitjen e koncentratit të proteinave nga krundet e orizit tregon se trajtimi me ultratinguj rezulton në rendiment më të lartë të proteinave në një kohë ekstraktimi dukshëm më të shkurtër – krahasuar me metodat konvencionale të nxjerrjes.
Protokolli i përgatitjes së mostrës për enzimën funksionale iNOS
Për të marrë enzimën iNOS plotësisht funksionale (p.sh. për ekzaminimin e barnave), rekomandohet protokolli i mëposhtëm: Suspensioni i qelizave duhet të vendoset në akull dhe të sonikohet me një UP100H në amplitudë 10µm në modalitetin e ciklit prej 5 sekondash. sonikacion dhe 25 sek. pushoni në akull. Procedura duhet të përsëritet përafërsisht. 3 herë. Koha e pushimit ndërmjet cikleve të sonikimit redukton rritjen e temperaturës dhe për këtë arsye do të zvogëlojë rrezikun e denatyrimit.
tretshmëria e proteinave me ultratinguj
Sonicizimi mund të përshpejtojë procesin e tretjes së proteinave, i cili zakonisht kërkon disa orë. Për të mos mbinxehur kampionin dhe për të parandaluar degradimin e proteinave dhe modifikimet në solucionet që përmbajnë ure, shpërthimet tejzanor nuk duhet të zgjasin më shumë se disa sekonda.
Ultrasonikator UP200Ht me mikromajë 2mm S26d2 për sonikimin e mostrave të vogla.
Pajisjet me ultratinguj për nxjerrjen e proteinave
Hielscher Ultrasonics ofron një gamë të gjerë homogjenizuesish tejzanor për shpërbërjen e qelizave, indeve, baktereve, mikroorganizmave, majave dhe sporeve.
Ultrasonikët e laboratorit Hielscher janë të fuqishëm dhe të lehtë për t'u përdorur. Të ndërtuara për funksionim 24/7, ato janë të dizajnuara si pajisje të forta dhe efikase laboratorike dhe tavoline. Për të gjitha pajisjet, prodhimi i energjisë dhe amplituda mund të kontrollohen saktësisht. Gama e gjerë e aksesorëve hap opsione të tjera të konfigurimit. Ultrasonikët dixhitalë si VialTweeter, UP200Ht, UP200St dhe UP400St kanë një kontroll të integruar të temperaturës dhe një kartë SD të integruar për regjistrimin automatik të të dhënave.
Për sonikimin indirekt, pa kontaminim të kryqëzuar dhe të njëkohshëm të mostrave të shumta, ne ofrojmë VialTweeter ose CupHorn ultrasonik.
Tabela më poshtë ju jep një përmbledhje mbi ultrasonikët tanë për përgatitjen e mostrës, përçarjen dhe nxjerrjen e qelizave. Klikoni në llojin e pajisjes për të marrë më shumë informacion mbi secilin homogjenizues tejzanor. Stafi ynë teknik i trajnuar mirë dhe me përvojë të gjatë do të jetë i lumtur t'ju ndihmojë të zgjidhni ultrasonikatorin më të përshtatshëm për përgatitjen tuaj të mostrës!
| Vëllimi i grupit | Shkalla e rrjedhjes | Pajisjet e rekomanduara |
|---|---|---|
| deri në 10 shishka ose tuba | na | VialTweeter |
| pllaka me shumë pus / mikrotitër | na | UIP400MTP |
| tuba / anije të shumta | na | bori i kupës |
| 1 deri në 500 ml | 10 deri në 200 ml/min | UP100H |
| 10 deri në 1000 ml | 20 deri në 200 ml/min | UP200Ht, UP200 St |
| 10 deri në 2000 ml | 20 deri në 400 ml/min | UP400 St |
Në varësi të aplikimit, materialit dhe vëllimit të mostrës, ne do t'ju rekomandojmë konfigurimin më të përshtatshëm për përgatitjen tuaj të mostrës. Na kontaktoni sot!
Na kontaktoni! / Na pyesni!
Ultrasonikët dixhitalë Hielscher kanë një telekomandë të shfletuesit dhe protokollimin automatik të të dhënave në një kartë SD të integruar.
VialTweeter për sonikacion indirekt.
Fakte që ia vlen të dihen
proteomika
Proteomics është fusha kërkimore që heton proteinat dhe proteomën. Proteinat plotësojnë një gamë të gjerë funksionesh jetësore brenda organizmave. Proteoma është tërësia e proteinave të shprehura nga një gjenom, qelizë, ind ose organizëm në një kohë të caktuar. Proteoma ndryshon me kohën dhe kërkesat ose streset e veçanta që i nënshtrohet një qelize ose organizmi. Më konkretisht, është grupi i proteinave të shprehura në një lloj të caktuar qelize ose organizmi, në një kohë të caktuar, në kushte të përcaktuara. Termi është një përzierje e proteinave dhe gjenomit. Proteomika është studimi i proteomës.
proteina
Proteinat janë biomolekula të mëdha, të ashtuquajturat makromolekula – të cilat përbëhen nga një ose më shumë zinxhirë të gjatë mbetjesh aminoacide. Proteinat janë të pranishme në të gjithë organizmat me origjinë bimore dhe shtazore dhe ato janë thelbësore për shumicën e funksioneve biologjike. Meqenëse proteinat përmbajnë shumë informacion biologjik, ato nxirren për qëllime analitike, p.sh. për kërkime proteomike. Funksioni më i rëndësishëm i kryer nga proteinat përfshin katalizimin e reaksioneve metabolike, replikimin e ADN-së, përgjigjen ndaj stimujve dhe transportin e molekulave nga një vend në tjetrin. Proteinat ndryshojnë nga njëra-tjetra kryesisht në sekuencën e tyre të aminoacideve, e cila diktohet nga sekuenca nukleotide e gjeneve të tyre dhe që zakonisht rezulton në palosjen e proteinave në një strukturë specifike tre-dimensionale që përcakton aktivitetin e saj. Proteinat janë – përveç peptideve – një nga komponentët kryesorë të ushqimit. Prandaj, proteomika është një mjet i fuqishëm në shkencën e ushqimit për të optimizuar proceset, sigurinë ushqimore dhe vlerësimin ushqyes.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction është një procedurë paraanalitike për ndarjen dhe parakoncentrimin e analitëve. Në kombinim me ultratingullin, nxjerrja e pikës së resë mund të intensifikohet duke e bërë procesin më efikas, më të shpejtë dhe më miqësor ndaj mjedisit. Me ultratinguj, nxjerrja e pikës së resë është një metodë dukshëm më efikase e përgatitjes së analitit. Lexoni më shumë rreth nxjerrjes së pikës së resë me ndihmën tejzanor!Elektroforeza me xhel
Elektroforeza me xhel është metoda kryesore për ndarjen dhe analizën e makromolekulave si ADN, ARN dhe proteinat si dhe fragmentet e tyre, bazuar në madhësinë dhe ngarkesën e tyre. Përdoret në kiminë klinike për të ndarë proteinat sipas ngarkesës dhe/ose madhësisë (agaroza IEF, në thelb e pavarur nga madhësia) dhe në biokimi, biologji molekulare dhe proteomikë për të ndarë një popullatë të përzier të fragmenteve të ADN-së dhe ARN-së sipas gjatësisë, për të vlerësuar madhësinë e ADN-së. dhe fragmente të ARN-së ose për të ndarë proteinat me ngarkesë.
kulturat qelizore
Kultura e qelizave është procesi i kontrolluar i rritjes me të cilin qelizat kultivohen në kushte të kontrolluara. Kushtet e kulturës së qelizave ndryshojnë për çdo lloj qelize. Në përgjithësi, mjedisi i një kulture qelizore përbëhet nga një enë e përshtatshme (p.sh. enë Petri) me substrat ose medium që furnizon lëndët ushqyese thelbësore (aminoacide, karbohidrate, vitamina, minerale), faktorët e rritjes, hormonet dhe gazrat (CO2, O2), dhe rregullon mjedisin fiziko-kimik (pH bufer, presion osmotik, temperaturë). Shumica e qelizave kanë nevojë për një sipërfaqe ose një substrat artificial, ndërsa kulturat e tjera qelizore mund të kultivohen të lira lundruese në mjedisin e kulturës (kultura e pezullimit, suspensioni qelizor).
Kulturat masive të linjave qelizore të kafshëve përdoren në prodhimin industrial të vaksinave virale dhe produkteve të tjera me prejardhje bioteknologjike. Qelizat burimore njerëzore kultivohen për të zgjeruar numrin e qelizave dhe për të diferencuar qelizat në lloje të ndryshme të qelizave somatike për qëllime transplantimi.
Mostrat e indeve
Termi ind përshkruan një ndërmjetës qelizor, ku materiali qelizor është në një nivel organizativ midis qelizave dhe një organi të plotë. Në inde, grumbullohen qeliza të ngjashme, nga e njëjta origjinë që së bashku kryejnë një funksion specifik. Nga grupimi funksional i indeve të shumta, formohen strukturat komplekse të organeve.
Indet merren për kërkime në biologji, histologji/histopatologji, parazitologji, biokimi, imunohistokimi, si dhe për kultivimin dhe nxjerrjen e ADN-së. Mund të dallohet midis indeve shtazore (nënndarja: indet e gjitarëve) dhe indeve bimore. Indet e kafshëve grupohen në katër llojet bazë të indit lidhor, muskulor, nervor dhe epitelial. Indet bimore ndahen në tre sistemet e mëposhtme të indeve: epidermë, ind tokësor dhe ind vaskular.
Mostrat e indeve mund të përgatiten nga pjesë të kafshëve ose bimëve, p.sh. kockat, muskujt, gjethet, etj.
Lëngjet e trupit
Gjaku, serumi, plazma, lëngu cerebrospinal, pështyma dhe lëngu sinovial janë lëngje trupore, të cilat ofrojnë një burim të madh informacioni të rëndësishëm diagnostikues. Prandaj, një përgatitje e sofistikuar e mostrave të lëngjeve trupore për analizë është e rëndësishme. Vështirësia e parë lidhet me gamën e gjerë dinamike të komponentëve të pranishëm në lëngjet e trupit.
Përcaktimi i përqendrimit të proteinave
Analiza Bradford, analiza Lowry dhe analiza e acidit bicinkoninik (BCA) janë analiza të zakonshme për të përcaktuar përqendrimin e proteinave. Albumina e serumit të gjedhit (BSA) është një nga standardet e proteinave më të përdorura.
tampon lisis
Buferi i lizës duhet të zgjidhet në përputhje me materialin ose indin qelizor (kultura e indeve, bimët, bakteret, kërpudhat, etj.) dhe nëse qelizat janë në një strukturë dhe llojin e strukturës. Një gamë e gjerë e buferëve të lizës për nxjerrjen e proteinave, membranave dhe organeleve janë formuluar me një ose më shumë detergjentë. Detergjenti zakonisht zgjidhet nëpërmjet testeve të provës dhe gabimit ose – nëse në dispozicion – sipas një protokolli ekzistues të nxjerrjes së proteinave. Detergjenti duhet të jetë i pajtueshëm me burimin e indeve dhe proteinat. Në përgjithësi, detergjenti më i butë që funksionon për një ind/proteinë specifike, zgjidhet për të ruajtur funksionalitetin maksimal të ekstraktit. Për më tepër, në rast të nxjerrjes së membranave dhe organeleve, një detergjent i butë e mban membranën të paprekur. Detergjentët e përdorur zakonisht në tamponët e lizës janë kryesisht jojonikë ose zwitterionikë, p.sh. CHAPS, deoksikolat, Triton™ X-100, NP40 dhe Tween 20.
Për shembull, indet si truri, mëlçia, zorrët, veshkat, shpretka etj. mund të mbulohen thjesht me RIPA – megjithatë duhet të përfshihen inhibitorët e proteazës dhe DTT (p.sh. për elektroforezën e xhelit).
Tampon i lizës për indet e muskujve skeletorë (i ftohtë): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) glicerinë, 1 mM EDTA , 1 mM dithiothreitol i plotësuar me koktej frenues të proteazës dhe fosfatazës
Tabela e buferëve të zakonshëm dhe diapazoni i pH-së së tyre. Në përgjithësi, këta buferë zakonisht përdoren në përqendrime 20-50 mM.
| tampon | diapazoni i pH |
|---|---|
| Acid citrik – NaOH | 2.2 – 6.5 |
| Citrati i natriumit – Acid citrik | 3.0 – 6.2 |
| Acetat natriumi – acid acetik | 3.6 – 5.6 |
| Kripë natriumi të acidit kakodilik – HCl | 5.0 – 7.4 |
| MASH – NaOH | 5.6 – 6.8 |
| Dihidrogjen fosfat natriumi – hidrogjen fosfat dinatriumi | 5.8 – 8.0 |
| imidazol – HCl | 6.2 – 7.8 |
| MOPS – KOH | 6.6 – 7.8 |
| Hidrokloridi i trietanolaminës – NaOH | 6.8 – 8.8 |
| Tris – HCl | 7.0 – 9.0 |
| HEPES – NaOH | 7.2 – 8.2 |
| Tricine – NaOH | 7.6 – 8.6 |
| Tetraborat natriumi – acid borik | 7.6 – 9.2 |
| Bicinë – NaOH | 7.7 – 8.9 |
| glicinë – NaOH | 8.6 – 10.6 |
Shumica e tamponëve tregojnë një varësi nga pH me temperaturën. Kjo është veçanërisht e vërtetë për buferët Tris. PKa ndryshon nga 8.06 në 25°C në 8.85 në 0°C.
(pH dhe pKa e një tamponi: pH mat përqendrimin e joneve të hidrogjenit në një tretësirë ujore. pKa (= konstanta e disociimit të acidit) është një masë e lidhur, por më specifike, në atë që ndihmon për të parashikuar se si do të veprojë një molekulë në një masë specifike. vlera e pH.)
TRIZol
TRIZol është një solucion kimik që përdoret për të nxjerrë ARN/ADN/proteinë gjatë nxjerrjes së guanidiniumit tiocianat-fenol-kloroform. Përdorimi i ekstraktimit të TRIzol me asistencë ultrasonike rezulton në rendimente të larta të ADN-së, ARN-së dhe proteinave nga e njëjta mostër dhe në këtë mënyrë shquhet për metodat e tjera të nxjerrjes.
Literatura/Referencat
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.