Ekstraktimi me ultratinguj i proteinave nga indet dhe kulturat qelizore
- Ekstraktimi i proteinave është një hap thelbësor i përgatitjes së mostrave në proteomikë.
- Proteinat mund të ekstraktohen nga indet bimore dhe shtazore, majatë dhe mikroorganizmat.
- Sonikimi është një metodë e besueshme dhe efikase për ekstraktimin e proteinave, që jep rendimente të larta proteinash brenda një kohe të shkurtër ekstraktimi.
Ekstraktimi i proteinave nga indet dhe qelizat
Ekstraktimi i proteinave nga indet dhe qelizat e kultivuara është një hap thelbësor i përgatitjes së mostrave, i cili kryhet gjatë shumë teknikave biokimike dhe analitike, si ELISA, PAGE, Western blotting, spektrometria e masës ose pastrimi i proteinave. Shkatërrimi i qelizave, liza dhe ekstraktimi me ultratinguj përbëjnë një teknikë jotermike, të kontrollueshme me saktësi, për të siguruar rendimente të larta proteinash.
Ekstraktimi i proteinave nga qelizat me sondën ultrasonike UP200St
- Shpejtësi
- Rendimente të larta
- Efikasitet shumë i lartë
- Kontroll i saktë i parametrave
- Rezultate të riprodhueshme
- Shkallëzueshmëri lineare
Udhëzime të përgjithshme për lizën dhe ekstraktimin e proteinave me ultratinguj
- Kontrolli i temperaturës: Për të siguruar një rendiment të lartë proteinash pa denatyrim termik, temperatura gjatë ekstraktimit duhet të kontrollohet. Homogjenizuesit ultrasonikë të teknologjisë më të fundit të Hielscher – të quajtur edhe dezintegrues ultrasonikë ose ultrasonifikues – mund të kontrollohen me saktësi. Ata pajisen me një sensor temperature që mund të lidhet në pajisje. Në opsionet e konfigurimit të homogjenizuesit ultrasonik mund të caktohet një temperaturë maksimale. Kur arrihet kjo temperaturë maksimale, sonikatori ndalon automatikisht derisa mostra të jetë ftohur.
- Tretësira tampon: Zgjedhja e një tretësire tampon të përshtatshme dhe e vëllimit të duhur të saj ndryshon nga njëri ind te tjetri dhe duhet të përcaktohet përmes provave dhe gabimeve.
- Izolimi / pastrimi: Lizatet proteinike mund të përmbajnë një tepricë biomolekulash, si ADN-ja ose karbohidratet, të cilat mund të largohen përmes precipitimit të proteinave (deoksikolat–acid trikloroacetik) ose ndërrimit të tretësirës tampon.
Chittapalo dhe Noomhorm (2009) raportuan në studimin e tyre se rendimenti i proteinave u rrit duke përdorur sonikimin dhe se procesi i homogjenizimit dhe lizës së indeve me ultratinguj mund t’i përmirësojë ndjeshëm proceset ekzistuese të ekstraktimit – duke krijuar mundësi të reja për ekstraktim në shkallë tregtare.
CupHorn ultrasonik për përgatitjen e njëkohshme dhe shumë të efektshme të disa mostrave në të njëjtat kushte për izolimin e proteinave dhe fragmentimin e ADN-së.
Ekstraktimi i proteinave nga indet shtazore
Për përgatitjen e indit të plotë (p.sh. veshkë, zemër, mushkëri, muskul etj.), indi duhet të pritet në copa shumë të vogla me mjete të pastra, mundësisht mbi akull dhe sa më shpejt që të jetë e mundur, për të parandaluar degradimin nga proteazat (p.sh. tretësirë tampon për lizë si RIPA ose tretësirë tampon hipotonike për lizë që përmban një përzierje inhibitorësh të proteazave dhe fosfatazave). Pas prerjes, mostra zhytet në azot të lëngshëm për ngrirje të menjëhershme. Mostra mund të ruhet në -80°C për përdorim të mëvonshëm ose të mbahet mbi akull për homogjenizim të menjëhershëm. Menjëherë përpara ekstraktimit me ultratinguj, në tubin e mostrës shtohet me shpejtësi tretësirë tampon për lizë, e ftohtë si akulli (me inhibitorët e proteazave DTT, leupeptinë dhe aprotininë) (për ~10 mg ind rekomandohen afërsisht ~600 μL tretësirë tampon). Për çdo tub mostre rekomandohen afërsisht 20–60mg ind.
Homogjenizimi, liza dhe ekstraktimi me ultratinguj kryhen me një homogjenizues ultrasonik si UP100H ose UP200Ht, të pajisur me një sonotrodë me mikromajë. Kohëzgjatja e sonikimit është 60–90 sek. në një regjim ciklik ultrasonik me 15 sek. sonikim dhe 10 sek. pushim. Mostra duhet të mbahet në akull gjatë gjithë kohës.
Pas homogjenizimit / ekstraktimit me ultratinguj, lizati centrifugohet në 27 000g për afërsisht 20 min. Më pas mblidhet supernatanti, në mënyrë që përqendrimi i proteinave të mund të përcaktohet me një analizë proteinash si analiza BCA e proteinave Pierce.
Ekstraktimi i proteinave nga serumi i gjakut
Për të përftuar një përzierje homogjene të serumit dhe tamponit fosfat, mostra fillimisht përzihet në vorteks përpara lizës qelizore me ultratinguj. Për lizën me ultratinguj, mostra trajtohet me një homogjenizues laboratorik me ultratinguj, si UP100H, për 8 cikle me amplitudë 20%, ku çdo cikël përbëhet nga 5 sekonda trajtim dhe 15 sekonda pushim. Ekstraktimi i proteinave kryhet duke trajtuar me ultratinguj në cikle (regjim pulsimi) dhe duke e vendosur mostrën mbi akull, në mënyrë që të shmangen mbinxehja dhe degradimi termik i mostrës. Meqenëse serumi përmban një sasi të madhe proteinash me masë të lartë molekulare (si albumina, α1-antitripsina, transferina, haptoglobulina, imunoglobulina G dhe imunoglobulina A), të cilat pengojnë ndarjen e proteinave me masë të ulët molekulare gjatë IEF, rekomandohet largimi i tyre nga serumi duke përdorur një kolonë për largimin selektiv të tyre.
Ekstraktimi i proteinave nga indet bimore
Indet bimore të freskëta dhe të buta, p.sh. myshku etj., mund të shpërbëhen lehtësisht thjesht duke e vendosur materialin e copëtuar të mostrës në tampon lize për trajtim me ultratinguj. Indet bimore të forta dhe të drunjëzuara, si farat, gjilpërat e bredhit etj., duhet të bluhen në gjendje të thatë. Disa materiale bimore të forta dhe drunore duhet të ngrihen dhe të bluhen në azot të lëngshëm përpara ekstraktimit me ultratinguj. Për suspensionet e kulturave qelizore bimore, një trajtim me ultratinguj nga 30 deri në 150 sekonda në një tampon lize është përgjithësisht i mjaftueshëm. Materialet më të forta, si farat e kungullit, kërkojnë një trajtim më intensiv me ultratinguj, siç përshkruhet më poshtë.
Protokoll për ekstraktimin e albuminës nga farat e kungullit me ultratinguj
Për ekstraktimin e albuminës me ultratinguj nga pluhuri i farave të kungullit të bluara imët, në një gotë kimike prej qelqi me vëllim 250mL shtohen 10 g pluhur farash kungulli të çyndyrosura dhe 100 mL ujë të dejonizuar si tretës. Ekstraktimi i proteinave përbëhet nga dy hapa: Së pari, mostra trajtohet me ultratinguj duke përdorur një aparat me ultratinguj të tipit sondë UP400St (400W, 24kHz), të pajisur me sonotrodën S24d7. Gota kimike prej qelqi vendoset në një banjë me ujë të ftohtë gjatë homogjenizimit me ultratinguj. Sensori i temperaturës që lidhet me prizë dhe cilësimet e kontrollit të temperaturës të aparatit me ultratinguj UP400St sigurojnë që temperatura e mostrës të mbahet gjithmonë nën 30°C. Kontrolli i saktë i temperaturës gjatë trajtimit me ultratinguj shmang denatyrimin e albuminës. Së dyti, ekstraktimi u krye me një përzierës me shpejtësi 200 rpm dhe në 30°C. Më pas, gota kimike transferohet në një tundës termostatik. Globulina largohet nëpërmjet dializës me ujë të distiluar. Pas largimit të globulinës, nga ekstrakti proteinik mund të merret një mostër për përcaktimin e profilit të albuminës dhe më pas ekstrakti rregullohet në pI=3,0 duke përdorur HCl 0,1 M për koagulimin e albuminës. Faza e ngurtë ndahet me centrifugim në 5000g, 20°C dhe tretet sërish në ujë të dejonizuar. Koagulimi i albuminës kryhet dy herë për të rritur përqindjen e proteinave në koncentratin e albuminës.
Ekstraktimi alkalin i proteinave me ultratinguj për përgatitjen e koncentratit proteinik nga krundet e orizit tregon se trajtimi me ultratinguj jep një rendiment më të lartë proteinash në një kohë ekstraktimi dukshëm më të shkurtër – krahasuar me metodat konvencionale të ekstraktimit.
Protokoll për përgatitjen e mostrës për enzimën funksionale iNOS
Për të përftuar enzimën iNOS plotësisht funksionale (p.sh. për testimin paraprak të barnave), rekomandohet protokolli vijues: Suspensioni qelizor duhet të vendoset mbi akull dhe të trajtohet me ultratinguj me një UP100H me amplitudë 10µm, në regjim ciklik me 5 sek. trajtim me ultratinguj dhe 25 sek. pushim mbi akull. Procedura duhet të përsëritet afërsisht 3 herë. Koha e pushimit ndërmjet cikleve të trajtimit me ultratinguj zvogëlon rritjen e temperaturës dhe, për rrjedhojë, do të zvogëlojë rrezikun e denatyrimit.
Solubilizimi i proteinave me ultratinguj
Trajtimi me ultratinguj mund të përshpejtojë procesin e solubilizimit të proteinave, i cili zakonisht kërkon disa orë. Për të mos e mbinxehur mostrën dhe për të parandaluar degradimin dhe modifikimet e proteinave në tretësirat që përmbajnë ure, pulset e ultratingujve nuk duhet të zgjasin më shumë se disa sekonda.
Aparati me ultratinguj UP200Ht me majë mikro S26d2 prej 2mm për trajtimin e mostrave të vogla me ultratinguj.
Pajisje me ultratinguj për ekstraktimin e proteinave
Hielscher Ultrasonics ofron një gamë të gjerë homogjenizuesish me ultratinguj për shpërbërjen e qelizave, indeve, baktereve, mikroorganizmave, majave dhe sporeve.
Pajisjet laboratorike me ultratinguj të Hielscher janë të fuqishme dhe të lehta për t’u përdorur. Të ndërtuara për funksionim 24/7, ato janë projektuar si pajisje laboratorike dhe tavoline të qëndrueshme dhe efikase. Për të gjitha pajisjet, energjia në dalje dhe amplituda mund të kontrollohen me saktësi. Gama e gjerë e aksesorëve mundëson konfigurime të tjera. Pajisjet digjitale me ultratinguj, si VialTweeter, UP200Ht, UP200St dhe UP400St, kanë kontroll të integruar të temperaturës dhe një kartë SD të integruar për regjistrimin automatik të të dhënave.
Për sonikimin e tërthortë, të njëkohshëm dhe pa kontaminim të kryqëzuar të disa mostrave, ne ofrojmë VialTweeter ose CupHorn me ultratinguj.
Tabela më poshtë ju jep një përmbledhje të pajisjeve tona me ultratinguj për përgatitjen e mostrave, shpërbërjen e qelizave dhe ekstraktimin. Klikoni mbi llojin e pajisjes për të marrë më shumë informacion për secilin homogjenizues me ultratinguj. Stafi ynë teknik i trajnuar mirë dhe me përvojë shumëvjeçare do t’ju ndihmojë me kënaqësi të zgjidhni pajisjen me ultratinguj më të përshtatshme për përgatitjen e mostrave tuaja!
| Vëllimi i serisë | Prurja | Pajisjet e rekomanduara |
|---|---|---|
| deri në 10 flakonë ose epruveta | nuk zbatohet | VialTweeter |
| pllaka me shumë puse / mikrotitrimi | nuk zbatohet | UIP400MTP |
| disa epruveta / enë | nuk zbatohet | CupHorn |
| 1 deri në 500mL | 10 deri në 200mL/min | UP100H |
| 10 deri në 1000mL | 20 deri në 200mL/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 deri në 2000mL | 20 deri në 400mL/min | UP400St |
Në varësi të aplikimit, materialit dhe vëllimit të mostrës suaj, ne do t’ju rekomandojmë konfigurimin më të përshtatshëm për përgatitjen e mostrave tuaja. Na kontaktoni sot!
Na kontaktoni! / Na pyesni!
Pajisjet digjitale me ultratinguj të Hielscher ofrojnë kontroll në distancë nëpërmjet shfletuesit dhe regjistrim automatik të të dhënave në një kartë SD të integruar.
VialTweeter për sonikim të tërthortë.
Fakte që ia vlen të dihen
Proteomika
Proteomika është fusha e kërkimit që studion proteinat dhe proteomën. Proteinat kryejnë një gamë të gjerë funksionesh jetësore brenda organizmave. Proteoma është tërësia e proteinave të shprehura nga një gjenom, qelizë, ind ose organizëm në një moment të caktuar. Proteoma ndryshon me kalimin e kohës dhe sipas kërkesave të veçanta ose streseve që përjeton një qelizë apo organizëm. Më konkretisht, ajo është tërësia e proteinave të shprehura në një lloj të caktuar qelize ose organizmi, në një moment të caktuar, në kushte të përcaktuara. Termi është një ndërthurje e fjalëve proteina dhe gjenom. Proteomika është studimi i proteomës.
Proteina
Proteinat janë biomolekula të mëdha, të ashtuquajtura makromolekula – të cilat përbëhen nga një ose më shumë zinxhirë të gjatë mbetjesh aminoacidesh. Proteinat janë të pranishme në të gjithë organizmat me origjinë bimore dhe shtazore dhe janë thelbësore për shumicën e funksioneve biologjike. Meqenëse proteinat përmbajnë shumë informacion biologjik, ato ekstraktohen për qëllime analitike, p.sh. për kërkime proteomike. Funksionet më të rëndësishme që kryejnë proteinat përfshijnë katalizën e reaksioneve metabolike, replikimin e ADN-së, përgjigjen ndaj stimujve dhe transportin e molekulave nga një vend në tjetrin. Proteinat ndryshojnë nga njëra-tjetra kryesisht në sekuencën e aminoacideve të tyre, e cila përcaktohet nga sekuenca nukleotidike e gjeneve të tyre dhe zakonisht bën që proteina të paloset në një strukturë specifike tredimensionale që përcakton aktivitetin e saj. Proteinat janë – krahas peptideve – një nga përbërësit kryesorë të ushqimit. Prandaj, proteomika është një mjet i fuqishëm në shkencën e ushqimit për optimizimin e proceseve, sigurisë ushqimore dhe vlerësimit ushqimor.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction është një procedurë paraanalitike për ndarjen dhe parapërqendrimin e analitëve. Në kombinim me trajtimin me ultratinguj, ekstraktimi në pikën e turbullimit mund të intensifikohet, duke e bërë procesin më efikas, më të shpejtë dhe më miqësor ndaj mjedisit. Me trajtimin me ultratinguj, ekstraktimi në pikën e turbullimit është një metodë dukshëm më efikase për përgatitjen e analitëve. Lexoni më shumë rreth ekstraktimit në pikën e turbullimit të asistuar me ultratinguj!
Elektroforeza në xhel
Elektroforeza në xhel është metoda kryesore për ndarjen dhe analizën e makromolekulave si DNA, RNA dhe proteinat, si dhe të fragmenteve të tyre, bazuar në madhësinë dhe ngarkesën e tyre. Ajo përdoret në kiminë klinike për të ndarë proteinat sipas ngarkesës dhe/ose madhësisë (IEF në agarozë, në thelb e pavarur nga madhësia) dhe në biokimi, biologji molekulare dhe proteomikë për të ndarë sipas gjatësisë një popullatë të përzier fragmentesh të DNA-së dhe RNA-së, për të vlerësuar madhësinë e fragmenteve të DNA-së dhe RNA-së ose për të ndarë proteinat sipas ngarkesës.
Kulturat qelizore
Kultura qelizore është procesi i kontrolluar i rritjes, përmes të cilit qelizat kultivohen në kushte të kontrolluara. Kushtet e kulturës qelizore ndryshojnë për secilin lloj qelize. Në përgjithësi, mjedisi i një kulture qelizore përbëhet nga një enë e përshtatshme (p.sh. pjatë Petri) me substrat ose mjedis ushqyes që siguron lëndët ushqyese thelbësore (aminoacide, karbohidrate, vitamina, minerale), faktorët e rritjes, hormonet dhe gazet (CO2, O2), dhe rregullon mjedisin fizikokimik (tamponi i pH-së, presioni osmotik, temperatura). Shumica e qelizave kanë nevojë për një sipërfaqe ose substrat artificial, ndërsa kultura të tjera qelizore mund të kultivohen duke qëndruar pezull lirisht në mjedisin e kulturës (kulturë në suspension, suspension qelizor).
Kulturat në masë të linjave qelizore shtazore përdoren në prodhimin industrial të vaksinave virale dhe produkteve të tjera të përftuara me bioteknologji. Qelizat staminale njerëzore kultivohen për të rritur numrin e qelizave dhe për t’i diferencuar ato në lloje të ndryshme qelizash somatike për qëllime transplantimi.
Mostrat e indeve
Termi ind përshkruan një strukturë qelizore të ndërmjetme, ku materiali qelizor ndodhet në një nivel organizimi midis qelizave dhe një organi të plotë. Në ind bashkohen qeliza të ngjashme, me të njëjtën prejardhje, që së bashku kryejnë një funksion të caktuar. Nga grupimi funksional i disa indeve formohen strukturat komplekse të organeve.
Mostrat e indeve merren për kërkime në biologji, histologji/histopatologji, parazitologji, biokimi, imunohistokimi, si dhe për kultivim dhe nxjerrjen e DNA-së. Mund të bëhet dallimi midis indeve shtazore (nënndarje: indet e gjitarëve) dhe indeve bimore. Indet shtazore grupohen në katër llojet bazë: indi lidhor, muskulor, nervor dhe epitelial. Indet bimore ndahen në këto tri sisteme indore: epiderma, indi themelor dhe indi përçues.
Mostrat e indeve mund të përgatiten nga pjesë shtazore ose bimore, p.sh. kocka, muskuj, gjethe etj.
Lëngjet trupore
Gjaku, serumi, plazma, lëngu cerebrospinal, pështyma dhe lëngu sinovial janë lëngje trupore që ofrojnë një burim të pasur informacioni me rëndësi diagnostike. Prandaj, përgatitja e sofistikuar e mostrave të lëngjeve trupore për analizë është e rëndësishme. Vështirësia e parë lidhet me diapazonin e gjerë dinamik të përbërësve të pranishëm në lëngjet trupore.
Përcaktimi i përqendrimit të proteinave
Testi Bradford, testi Lowry dhe testi me acid bikinkoninik (BCA) janë teste të zakonshme për përcaktimin e përqendrimit të proteinave. Albumina e serumit të gjedhit (BSA) është një nga standardet proteinike më të përdorura.
Tamponi i lizës
Tamponi i lizës duhet të zgjidhet në përputhje me materialin qelizor ose indin (kulturë indore, bimë, baktere, kërpudha etj.), si dhe duke marrë parasysh nëse qelizat ndodhen në një strukturë dhe llojin e kësaj strukture. Një gamë e gjerë tamponësh të lizës për ekstraktimin e proteinave, membranave dhe organeleve formulohen me një ose më shumë detergjentë. Detergjenti zakonisht zgjidhet përmes provave me përpjekje dhe gabime ose – nëse është i disponueshëm – sipas një protokolli ekzistues për ekstraktimin e proteinave. Detergjenti duhet të jetë i përputhshëm me burimin indor dhe proteinat. Në përgjithësi, zgjidhet detergjenti më i butë që funksionon për një ind / proteinë të caktuar, për të ruajtur funksionalitetin maksimal të ekstraktit. Për më tepër, në rastin e ekstraktimit të membranave dhe organeleve, një detergjent i butë e mban membranën të paprekur. Detergjentët që përdoren zakonisht në tamponët e lizës janë kryesisht jojonikë ose cviterionikë, p.sh. CHAPS, deoksikolat, Triton™ X-100, NP40 dhe Tween 20.
Për shembull, inde si truri, mëlçia, zorra, veshka, shpretka etj. mund të tamponohen thjesht me RIPA – megjithatë, duhen përfshirë inhibitorë të proteazave dhe DTT (p.sh. për elektroforezën në xhel).
Tampon lize për indin muskulor skeletor (i ftohtë si akulli): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) glicerol, 1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitol, i plotësuar me një përzierje inhibitorësh të proteazave dhe fosfatazave
Tabela e tamponëve të zakonshëm dhe e intervalit të tyre të pH-së. Në përgjithësi, këta tamponë përdoren zakonisht në përqendrime prej 20–50 mM.
| Tamponi | Intervali i pH-së |
|---|---|
| Acid citrik – NaOH | 2,2 – 6,5 |
| Citrat natriumi – acid citrik | 3,0 – 6,2 |
| Acetat natriumi – acid acetik | 3,6 – 5,6 |
| Kripë natriumi e acidit kakodilik – HCl | 5,0 – 7,4 |
| MES – NaOH | 5,6 – 6,8 |
| Dihidrogjenfosfat natriumi – hidrogjenfosfat dinatriumi | 5,8 – 8,0 |
| Imidazol – HCl | 6,2 – 7,8 |
| MOPS – KOH | 6,6 – 7,8 |
| Hidroklorur trietanolamine – NaOH | 6,8 – 8,8 |
| Tris – HCl | 7,0 – 9,0 |
| HEPES – NaOH | 7,2 – 8,2 |
| Tricinë – NaOH | 7,6 – 8,6 |
| Tetraborat natriumi – acid borik | 7,6 – 9,2 |
| Bicinë – NaOH | 7,7 – 8,9 |
| Glicinë – NaOH | 8,6 – 10,6 |
Shumica e tamponëve shfaqin varësi të pH-së nga temperatura. Kjo vlen veçanërisht për tamponët Tris. pKa ndryshon nga 8,06 në 25°C në 8,85 në 0°C.
(pH dhe pKa e një tamponi: pH mat përqendrimin e joneve të hidrogjenit në një tretësirë ujore. pKa (= konstanta e disocimit të acidit) është një madhësi e lidhur me të, por më specifike, pasi ndihmon të parashikohet se si do të sillet një molekulë në një vlerë të caktuar të pH-së.)
TRIzol
TRIzol është një tretësirë kimike që përdoret për të ekstraktuar ARN/ADN/proteina gjatë ekstraktimit me tiocianat guanidini–fenol–kloroform. Përdorimi i ekstraktimit me TRIzol të asistuar me ultratinguj jep rendimente të larta të ADN-së, ARN-së dhe proteinave nga e njëjta mostër dhe, në këtë mënyrë, ua kalon metodave të tjera të ekstraktimit.
Literaturë/Referenca
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.