Liza me ultratinguj e qelizave të modifikuara me bioinxhinieri në prodhimin industrial

Speciet bakteriale të modifikuara me bioinxhinieri, si E. coli, si dhe llojet e qelizave të gjitarëve dhe të bimëve të modifikuara gjenetikisht, përdoren gjerësisht në bioteknologji për të shprehur molekula. Për të çliruar këto biomolekula të sintetizuara, nevojitet një teknikë e besueshme e shpërbërjes së qelizave. Trajtimi me ultratinguj me performancë të lartë është një metodë e provuar për lizën efikase dhe të besueshme të qelizave – që mund të shkallëzohet lehtësisht për kapacitete të mëdha përpunimi. Hielscher Ultrasonics ju ofron pajisje me ultratinguj me performancë të lartë për lizën efektive të qelizave, me qëllim prodhimin e vëllimeve të mëdha të biomolekulave me cilësi të lartë.

Ekstraktimi i molekulave nga fabrikat qelizore

Për prodhimin e një game të gjerë biomolekulash, mikrobe të ndryshme dhe qeliza bimore të modifikuara me inxhinieri mund të përdoren si fabrika qelizore mikrobike, duke përfshirë Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana dhe algat, ndër shumë të tjera. Këto fabrika qelizore mund të prodhojnë proteina, lipide, substanca biokimike, polimere, biokarburante dhe oleokimikate, të cilat përdoren si ushqim ose lëndë e parë për aplikime industriale. Qelizat e përdorura si fabrika qelizore kultivohen në bioreaktorë të mbyllur, ku mund të arrijnë efikasitet dhe specifikë të lartë dhe kërkesa të ulëta për energji.
Për të izoluar molekulat e synuara nga kulturat e qelizave të modifikuara me bioinxhinieri, qelizat duhet të shpërbëhen në mënyrë që të çlirohet materiali brendaqelizor. Shpërbërësit e qelizave me ultratinguj janë tashmë të konsoliduar si një teknikë shumë e besueshme dhe efikase për dezintegrimin e qelizave dhe çlirimin e përbërjeve.

Fabrikat qelizore mikrobike janë qeliza të modifikuara përmes inxhinierisë metabolike, të përdorura për sintezën e përbërjeve të ndryshme me vlerë. Shpërbërja e qelizave me ultratinguj është një metodë efikase dhe e besueshme për çlirimin e përbërjeve me vlerë nga brendësia e qelizave.
studimi dhe grafika: ©Villaverde, 2010.

Përparësitë e shpërbërësve të qelizave me ultratinguj

Si një teknologji jotermike, e butë, por shumë efikase, shpërbërësit me ultratinguj përdoren në laborator dhe industri për lizën e qelizave dhe për prodhimin e ekstrakteve me cilësi të lartë, të përdorura, për shembull, për izolimin e molekulave nga fabrikat qelizore.

Ultratinguj me fuqi të lartë për shpërbërjen efikase të fabrikave qelizore mikrobike

Mekanizmi dhe efektet e shpërbërësve të qelizave me ultratinguj:
Shpërbërja qelizore me ultratinguj përdor fuqinë e valëve ultrasonike. Homogjenizuesi ultrasonik / shpërbërësi qelizor është i pajisur me një sondë (të njohur edhe si sonotrodë) prej aliazhi titani, e cila lëkundet me një frekuencë të lartë prej afërsisht 20 kHz. Kjo do të thotë se sonda ultrasonike transmeton 20 000 dridhje në sekondë në lëngun që trajtohet me ultratinguj. Valët ultrasonike të transmetuara në lëng karakterizohen nga cikle të alternuara presioni të lartë / presioni të ulët. Gjatë një cikli presioni të ulët, lëngu zgjerohet dhe formohen flluska të imëta vakumi. Këto flluska shumë të vogla rriten gjatë disa cikleve të alternuara të presionit, derisa nuk mund të përthithin më energji. Në këtë pikë, flluskat e kavitacionit shemben vrullshëm drejt brendësisë dhe krijojnë lokalisht një mjedis me dendësi jashtëzakonisht të lartë energjie. Ky fenomen njihet si kavitacion akustik dhe karakterizohet nga temperatura shumë të larta lokale, presione shumë të larta dhe forca prerëse. Këto sforcime prerëse çajnë me efikasitet muret qelizore dhe rrisin transferimin e masës ndërmjet brendësisë së qelizës dhe tretësit përreth. Si një teknikë thjesht mekanike, përdorimi i forcave prerëse të gjeneruara me ultratinguj është i përhapur gjerësisht dhe është procedura e rekomanduar për shpërbërjen e qelizave bakteriale, si edhe për izolimin e proteinave. Si një metodë e thjeshtë dhe e shpejtë e shpërbërjes qelizore, trajtimi me ultratinguj është ideal për izolimin në vëllime të vogla, të mesme dhe të mëdha. Pajisjet digjitale të Hielscher për trajtim me ultratinguj janë të pajisura me një meny të qartë cilësimesh për kontrollin e saktë të trajtimit me ultratinguj. Të gjitha të dhënat e trajtimit me ultratinguj ruhen automatikisht në një kartë SD të integruar dhe janë lehtësisht të aksesueshme. Mundësitë e sofistikuara të largimit të nxehtësisë, si ftohja e jashtme, trajtimi me ultratinguj në regjim pulsues etj., gjatë procesit të shpërbërjes me ultratinguj sigurojnë ruajtjen e temperaturës ideale të procesit dhe, në këtë mënyrë, paprekshmërinë e përbërjeve të ekstraktuara të ndjeshme ndaj nxehtësisë.

Kërkimet theksojnë pikat e forta të shpërbërjes qelizore dhe ekstraktimit me ultratinguj

Prof. Chemat et al. (2017) përmbledhin në studimin e tyre se “ekstraktimi i asistuar me ultratinguj është një alternativë ekologjike dhe ekonomikisht e qëndrueshme ndaj teknikave konvencionale për ushqimet dhe produktet natyrore. Përfitimet kryesore janë ulja e kohës së ekstraktimit dhe përpunimit, e sasisë së energjisë dhe tretësve të përdorur, e numrit të operacioneve njësi dhe e emetimeve të CO₂ .”
Gabig-Ciminska et al. (2014) përdorën një homogjenizues me presion të lartë dhe një shpërbërës qelizor ultrasonik në studimin e tyre për lizën e sporeve me qëllim çlirimin e ADN-së. Duke krahasuar të dyja metodat e shpërbërjes qelizore, ekipi kërkimor arrin në përfundimin se, lidhur me lizën qelizore për ADN-në e sporeve, “analiza është kryer duke përdorur lizate qelizore nga homogjenizimi me presion të lartë. Më pas, kuptuam se shpërbërja qelizore me ultratinguj ka përparësi të jashtëzakonshme për këtë qëllim. Ajo është mjaft e shpejtë dhe mund të kryhet për vëllime të vogla mostrash.” (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Biomolekulat nga fabrikat qelizore për prodhimin e ushqimeve

Fabrikat qelizore mikrobike janë një metodologji e zbatueshme dhe efikase prodhimi që përdor organizma mikrobikë për të prodhuar rendimente të larta metabolitësh natyrorë dhe jonatyrorë përmes bioinxhinierisë metabolike të mikroorganizmave mikrobikë si bakteret, majatë, kërpudhat etj. Enzimat në sasi të mëdha prodhohen, për shembull, duke përdorur mikroorganizma si Aspergillus oryzae, kërpudha dhe baktere. Këto enzima përdoren për prodhimin e ushqimeve dhe pijeve, si dhe në bujqësi, bioenergji dhe mirëmbajtjen e shtëpisë.
Disa baktere si Acetobacter xylinum dhe Gluconacetobacter xylinus prodhojnë celulozë gjatë procesit të fermentimit, ku nanofibrat sintetizohen përmes një procesi nga poshtë lart. Celuloza bakteriale (e njohur edhe si celulozë mikrobike) është kimikisht e barasvlershme me celulozën bimore, por ka një shkallë të lartë kristaliniteti dhe pastërti të lartë (pa linjinë, hemicelulozë, pektinë dhe përbërës të tjerë biogjenë), si dhe një strukturë unike rrjetore tredimensionale (3D) të endur nga nanofibrat e celulozës. (shih Zhong, 2020) Krahasuar me celulozën me prejardhje bimore, celuloza bakteriale është më e qëndrueshme nga ana mjedisore dhe celuloza e prodhuar është e pastër, pa kërkuar hapa të ndërlikuar pastrimi. Trajtimi me ultratinguj dhe ekstraktimi me tretës duke përdorur NaOH ose SDS (dodecil sulfat natriumi) janë shumë efektivë për izolimin e celulozës bakteriale nga qelizat bakteriale.

Biomolekulat nga fabrikat qelizore për prodhimin e barnave dhe vaksinave

Një nga produktet farmaceutike më të spikatura që përftohen nga fabrikat qelizore është insulina njerëzore. Për prodhimin e insulinës me anë të bioinxhinierisë përdoren kryesisht E. coli dhe Saccharomyces cerevisiae. Meqë molekulat me përmasa nanometrike të sintetizuara biologjikisht ofrojnë biopërputhshmëri të lartë, nanogrimcat biologjike si ferritina janë të favorshme për zbatime të shumta në bioprodhim. Gjithashtu, prodhimi në mikrobe të modifikuara përmes inxhinierisë metabolike shpesh është dukshëm më efikas për sa u përket rendimenteve të përftuara. Për shembull, prodhimi i acidit artemizinik, resveratrolit dhe likopenit është rritur nga dhjetëfish deri në disa qindrafish dhe tashmë është vendosur në shkallë industriale ose është në zhvillim drejt prodhimit në shkallë industriale. (shih Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
Për shembull, biomolekulat me bazë proteinike dhe përmasa nanometrike, me veti vetëorganizimi, si ferritina dhe grimcat e ngjashme me viruset, janë veçanërisht interesante për zhvillimin e vaksinave, pasi imitojnë si madhësinë, ashtu edhe strukturën e patogjenëve dhe lejojnë konjugimin e antigjeneve në sipërfaqe për të nxitur ndërveprimin me qelizat imunitare. Molekula të tilla shprehen në të ashtuquajturat fabrika qelizore (p.sh., shtame të modifikuara të E. coli), të cilat prodhojnë një molekulë të caktuar të synuar.

Protokoll për lizën me ultratinguj të E. coli BL21 për çlirimin e ferritinës

Ferritina është një proteinë, funksioni kryesor i së cilës është ruajtja e hekurit. Ferritina shfaq aftësi premtuese si nanogrimca vetëorganizuese në vaksina, ku përdoret si mjet për shpërndarjen e vaksinës (p.sh. proteinat gjembore të SARS-Cov-2). Kërkimi shkencor i Sun et al. (2016) tregon se ferritina rekombinante mund të çlirohet në formë të tretshme nga Escherichia coli në përqendrime të ulëta të NaCl (≤50 mmol/L). Për të shprehur ferritinën në E. coli BL21 dhe për ta çliruar atë, u zbatua me sukses protokolli i mëposhtëm. Plazmidi rekombinant pET-28a/ferritin u fut me transformim në shtamin E coli BL21 (DE3). Qelizat E coli BL21 (DE3) që shprehin ferritinën u kultivuan në mjedise rritjeje LB me 0,5% kanamicinë në 37°C dhe u induktuan në një OD600 prej 0,6 me 0,4% izopropil-β-D-tiogalaktopiranozid për 3 orë në 37°C. Kultura përfundimtare më pas u mblodh me centrifugim në 8000g për 10 minuta në 4°C dhe u mblodh sedimenti. Më pas, sedimenti u risuspendua në mjedis LB (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% ekstrakt majaje)/tampon lize (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) dhe në tretësira NaCl me përqendrime të ndryshme (0, 50, 100, 170 dhe 300 mmol/L), përkatësisht. Për lizën e qelizave bakteriale, trajtimi me ultratinguj u krye në regjim pulsues: p.sh., duke përdorur ultrasonikatorin UP400St në amplitudë 100% me një cikël pune prej 5 sekondash AKTIV, 10 sekondash JOAKTIV, për 40 cikle) dhe më pas u centrifugua në 10 000g për 15 minuta në 4°C. Supernatanti dhe precipitati u analizuan me elektroforezë në xhel poliakrilamidi me dodecil sulfat natriumi (SDS-PAGE). Të gjitha xhelet e ngjyrosura me dodecil sulfat natriumi u skanuan me një skaner me rezolucion të lartë. Imazhet e xheleve u analizuan duke përdorur softuerin Magic Chemi 1D. Për qartësi optimale, brezat e proteinave u identifikuan duke rregulluar parametrat. Të dhënat për brezat u përftuan nga tri përsëritje teknike. (shih Sun et al., 2016)

Pajisje për shpërbërjen e qelizave me ultratinguj për lizën industriale të fabrikave qelizore

Liza dhe ekstraktimi me ultratinguj janë një metodë e besueshme dhe e lehtë për t’u përdorur për çlirimin e metabolitëve nga fabrikat qelizore, duke ndihmuar kështu në prodhimin efikas të molekulave të synuara. Pajisjet për shpërbërjen e qelizave me ultratinguj janë të disponueshme në përmasa laboratorike deri në industriale dhe proceset mund të shkallëzohen në mënyrë plotësisht lineare.
Hielscher Ultrasonics është partneri juaj kompetent për pajisje shpërbërjeje me ultratinguj me performancë të lartë dhe ka përvojë shumëvjeçare në instalimin e sistemeve me ultratinguj në konfigurime mbi tavolinë pune dhe në mjedise industriale.
Kur bëhet fjalë për pajisje dhe softuer të sofistikuar, sistemet e Hielscher Ultrasonics për shpërbërjen e qelizave përmbushin të gjitha kërkesat për kontroll optimal të procesit, përdorim të lehtë dhe lehtësi për përdoruesin. Klientët dhe përdoruesit e pajisjeve me ultratinguj Hielscher vlerësojnë përparësinë që pajisjet Hielscher për shpërbërjen e qelizave dhe ekstraktim me ultratinguj mundësojnë monitorimin dhe kontrollin e saktë të procesit – përmes ekranit dixhital me prekje dhe kontrollit në distancë nëpërmjet shfletuesit. Të gjitha të dhënat e rëndësishme të sonikimit (p.sh. energjia neto, energjia totale, amplituda, kohëzgjatja, temperatura, presioni) ruhen automatikisht si skedar CSV në një kartë SD të integruar. Kjo ndihmon në përftimin e rezultateve të riprodhueshme dhe të përsëritshme dhe lehtëson standardizimin e procesit, si dhe përmbushjen e Praktikave të Mira të Prodhimit (cGMP).
Sigurisht, procesorët me ultratinguj Hielscher janë ndërtuar për funksionim 24/7 nën ngarkesë të plotë dhe, për rrjedhojë, mund të përdoren me besueshmëri në mjedise prodhimi industrial. Falë qëndrueshmërisë së lartë dhe nevojës së ulët për mirëmbajtje, koha jashtë funksionimit e pajisjeve me ultratinguj është vërtet e shkurtër. Funksionet CIP (pastrim në vend) dhe SIP (sterilizim në vend) minimizojnë pastrimin e mundimshëm, veçanërisht pasi të gjitha pjesët në kontakt me lëngun kanë sipërfaqe metalike të lëmuara (pa vrima ose grykëza të fshehura).

Tabela më poshtë ju jep një ide për kapacitetin e përafërt të përpunimit të pajisjeve tona me ultratinguj: