Përgatitja e plazmidit duke përdorur ultratinguj

Ultratingulli është një teknikë e besueshme për të fragmentuar ADN-në plazmide. Amplituda saktësisht e kontrollueshme, mënyra e pulsimit dhe kontrolli i temperaturës janë tiparet më të rëndësishme të një aparati ultrasonik për fragmentimin e plazmidit jo të dëmshëm. Për më tepër, përdorimi i agjentëve të caktuar ndihmon në mbrojtjen kundër degradimit të plazmidit. Hielscher Ultrasonics ofron zgjidhje të ndryshme për fragmentimin e kontrolluar të plazmidit nga flakonet e vetme, njëkohësisht sonikimin e mostrave të shumta si dhe pllakat me shumë pus. Mësoni më shumë rreth fragmentimit të suksesshëm të plazmidit tejzanor!

Prerje plazmide duke përdorur ultratinguj

Kur mostrat e ADN-së i nënshtrohen valëve tejzanor, dridhjet e gjeneruara në mënyrë ultrasonike krijojnë kavitacion akustik në lëngun që qeth ose thyen molekulat e ADN-së me peshë të lartë molekulare nëpërmjet forcave mekanike. Sonicizimi është metoda më e përdorur për eksperimentet e prerjes së ADN-së në masë, duke përfshirë aplikime, të tilla si Imunoprecipitimi i kromatinës (ChIP), për të cilin madhësitë e vogla të fragmenteve janë absolutisht thelbësore për të marrë rezolucion të lartë. (krh. Tseng et al., 2012)
ADN-ja plazmide (pDNA) është formë specifike e ADN-së, e karakterizuar nga forma e saj unazore dhe gjendet në baktere dhe disa eukariote.
PADNA e mbimbështjellur është forma e dëshiruar e ADN-së plazmide pasi tregon rezultatet më të mira në proceset e rrjedhës së poshtme, si sekuenca dhe transfektimi i automatizuar. Ultratingulli është i përshtatshëm për të fragmentuar pADN-në, duke përfshirë pADN-në e supermbështjellur, me sukses.
Thompson etj. (2008) demonstroi se sonikimi plazmid, i cili dihet se fragmenton ADN-në e mbimbështjellur, është një mënyrë efektive për të përmirësuar gjatësinë e leximit të sekuencës phred20 deri në atë pikë sa ato nuk janë dukshëm të ndryshme nga shablloni i kontrollit të Beckman Coulter ose nga plazmidet e linearizuara enzimatikisht.

Përdorimi i vektorëve plazmidë

Plazmidet shpesh përdoren si mjete për të klonuar, transferuar dhe manipuluar gjenet. Kur plazmidet përdoren në mënyrë eksperimentale për këto qëllime, ato quhen vektorë. Fragmentet ose gjenet e ADN-së mund të futen në një vektor plazmid, duke krijuar një të ashtuquajtur plazmid rekombinant. Vektorët plazmidë përdoren si mjete për të drejtuar ADN-në rekombinante në një qelizë pritëse dhe janë një komponent kyç i klonimit molekular.
“Vektorët joviralë janë duke u studiuar gjerësisht për përdorimin e tyre të mundshëm në terapinë gjenetike për trajtimin e sëmundjeve të ndryshme të komplikuara. Vektorët jo-viralë mbrojnë ADN-në plazmide kundër degradimit fizik, kimik dhe enzimatik dhe dërgojnë molekulën e ADN-së në vendin e synuar. Për shembull, liposomet kationike, kitozani dhe nanogrimca të tjera të ngarkuara pozitivisht formojnë komplekse me ADN-në plazmide përmes ndërveprimeve elektrostatike. Megjithatë, komplekset e liposomeve kationike/plazmidike të ADN-së të formuara lehtësisht janë relativisht të mëdha (dmth. 300-400 nm) dhe heterogjene në natyrë duke i bërë ato të vështira për t'u përdorur në aplikimet farmaceutike. Komplekset e mëdha dhe heterogjene të ADN-së/liposomeve plazmide, ADN-së plazmidike/aerosoleve dhe ADN-së plazmidike/peptideve mund të reduktohen në grimca më të vogla dhe homogjene duke përdorur ultratinguj.” (Sarker et al., 2019)
Një shembull i spikatur për përdorimin e vektorëve plazmidë është CRISPR-Cas9. Sistemi CRISPR-Cas9 zakonisht shpërndahet në qeliza si një plazmid i vetëm i madh ose plazmide të shumta më të vogla që kodojnë një sekuencë të synuar, një udhëzues CRISPR dhe Cas9.

Përgatitja tejzanor e Nanogrimcave PLGA të ngarkuara me ADN me nanoprecipitim

Jo et al. (2020) përdori poli(acid laktik-ko-glikolik) (PLGA) për të formuar një bartës nanogrimcash për shpërndarjen e një plazmidi model CRISPR-Cas9 në makrofagët primar që rrjedhin nga palca e eshtrave. Për nanoprecipitimin e nanogrimcave PLGA, PLGA me dy grupe fundore të ndryshme (grupet esterike dhe amine) u përdorën me objektivin që kapakët fundorë amine të ngarkuar pozitivisht të rrisin efikasitetin dhe ngarkesën e kapsulimit për shkak të ndërveprimeve të ngarkesës midis tij dhe shtyllës kurrizore të ngarkuar negativisht. ADN-në. Në një tub centrifuge konike polipropileni 50 ml, 100 mg Pluronic F127 u shpërnda në 20 ml ujë DI të autoklavuar me përzierje vorbull, e ndjekur nga 30 min sonikacion të butë duke përdorur një banjë tejzanor (shih CupHorn). U shtua një shirit trazues magnetik i autoklavuar dhe tretësira u përzie në 600 RPM për 30 minuta ndërsa tretësirat e tjera u bënë. Laboratori plastik u përdor në vend të enëve të qelqit për të minimizuar adsorbimin jospecifik të ADN-së. Tretësirat e PLGA të tretur në DMF (44.48 mg/ml) dhe TIPS pentacene të tretur në THF (0.667 mg/ml) u bënë veçmas. PLGA u la në qetësi për t'u lagur në DMF për 30 minuta përpara se të sonikohej për 30 minuta. (për protokollin e plotë shih Jo et al., 2020)

Mbrojtja e ADN-së plazmide gjatë sonikimit

ADN-ja duke përfshirë plazmidet dhe plazmidet e mbimbështjella janë degradim shumë të ndjeshëm. Të gjitha metodat e disponueshme të fragmentimit njihen për disavantazhe të caktuara. Fragmentimi tejzanor i ADN-së është një nga metodat e preferuara pasi sonikimi i kontrolluar në kombinim me masat mbrojtëse lejon të reduktojë dëmtimin e vargjeve të ADN-së nga qethja dhe nxehtësia.
Përveç cilësimeve të amplitudës së ulët, mënyrës së pulsimit dhe kontrollit të temperaturës gjatë prerjes tejzanor të ADN-së, përdorimi i agjentëve të caktuar tregoi një efekt të rëndësishëm mbrojtës kundër degradimit të ADN-së. Për shembull, polimere, peptide dhe lipide të ndryshme mbrojnë ADN-në plazmide gjatë ultrazërit.

Stabiliteti i ADN-së plazmidike dhe nanokomplekseve plazmidike ADN/IL ndaj stresit të prerjes tejzanor u hetua duke përdorur analizën e elektroforezës së xhelit të agarozës. Të dy ADN-ja plazmidike dhe nanokomplekset plazmidike ADN/IL iu nënshtruan stresit të prerjes tejzanor për momente të ndryshme kohore. ADN-ja plazmidike u ekspozua ndaj stresit të prerjes tejzanor për 0, 10, 20, 30 dhe 40 minuta. Sidoqoftë, nanokomplekset plazmidike të ADN/IL u ekspozuan ndaj stresit të prerjes tejzanor për 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 dhe 120 minuta.
(studim dhe foto: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) tregoi se kur nanostrukturat plazmidike të ADN-së / lëngut jonik (pDNA/IL) iu nënshtruan stresit prerës tejzanor për 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 dhe 120 minuta dhe u kompleksuan me gjenin kationik të disponueshëm në treg. agjenti i shpërndarjes lipofectamine, përqindja e qelizave pozitive fluoreshente ishte përkatësisht 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% dhe 50% (shih grafikun më poshtë). Përqindja e qelizave fluoreshente pozitive u rrit kur nanostrukturat iu nënshtruan stresit prerës tejzanor për 10 dhe 20 minuta, dhe më pas u ul ngadalë.

Ndikimi i lëngut jonik [Bmim][PF6] në shpërndarjen e ADN-së plazmide në qelizat COS7. Nanokomplekset plazmidike të ADN/IL (lëng jonik) iu nënshtruan stresit të prerjes tejzanor për deri në 120 minuta dhe u kompleksuan me LA përpara se të shpërndaheshin në qelizat COS7. Të dhënat tregojnë numrin mesatar (%) të qelizave HeLa pozitive GFP të numëruara në 10 fusha të ndryshme mikroskopike dhe eksperimenti u krye shumë herë në tre ditë të ndryshme. (Studimi dhe grafiku: ©Sarker et al., 2019)

Përgatitja e lizatit me ultratinguj

Protokolli i lizës së qelizave tejzanor
Filloni me një mostër të pasuruar qelizash që është përgatitur nëpërmjet një metode të ndarjes së qelizave (p.sh., ndarja imunomagnetike e qelizave, klasifikimi i qelizave të aktivizuara me fluoreshencë (FACS), centrifugimi i gradientit të densitetit, izolimi i qelizave me imunodensitet).
Mostrat e qelizave duhet të tregojnë një vëllim të një tamponi lize që është i përshtatshëm për qëllimin eksperimental dhe ultrasonikatorin e tipit sondë.
Preferohen tamponët hipotonikë pasi përmirësojnë lizën e qelizave tejzanor. Është e rëndësishme që aditivët dhe përqendrimi i kripës të përdoren në mënyrën e duhur.
Zgjidhni pajisjen tuaj të lizës me ultratinguj: Për sonifikimin indirekt të shisheve, rekomandohet VialTweeter ose CupHorn. Për pllakat me shumë pusi, UIP400MTP është ultrasonikatori ideal. Dhe sonikacioni klasik i tipit sonda, një homogjenizues tejzanor si UP100H ose UP200Ht me një mikro-majë janë më të përshtatshmet.
Protokolli për sonikimin e llojit të sondës: Vendoseni sondën e ultrazërit në vëllimin e kampionit në një tub mikrocentrifuge dhe sonikoni për rreth. 10 sekonda. Në varësi të mostrës së ADN-së, sonikimi mund të përsëritet një ose dy herë të tjera. Futja e kërkuar e energjisë tejzanor (Ws/mL) varet nga viskoziteti i mostrës dhe lloji i ADN-së. Ftohja nëpërmjet banjës së akullit dhe modaliteti i pulsimit të ultrazërit ndihmon në parandalimin e degradimit termik të mostrës.
Pas lizës tejzanor, kampioni centrifugohet për të ndarë mbeturinat e peletit (që përmbajnë qeliza, bërthama dhe organele të palizuara)
Nëse mostra nuk përpunohet menjëherë më tej, ajo mund të ruhet në një temperaturë të përshtatshme për të ruajtur qëndrueshmërinë e saj.

Ultrasonikë për copëzimin e ADN-së

Hielscher Ultrasonics ofron platforma të ndryshme të bazuara në ultratinguj për fragmentimin e ADN-së, ARN-së dhe kromatinës. Këto platforma të ndryshme përfshijnë sonda tejzanor (sonotrodes), zgjidhje indirekte të sonikacionit për përgatitjen e njëkohshme të mostrës së tubave të shumtë ose pllakave me shumë pus (p.sh. pllaka 96-pusesh, pllaka mikrotitri), sonoreaktorë dhe kupa tejzanor. Të gjitha platformat për prerjen e ADN-së mundësohen nga procesorë ultrasonikë me performancë të lartë të akorduar në frekuencë, të cilët janë saktësisht të kontrollueshëm dhe japin rezultate të riprodhueshme.

Procesorë tejzanor për çdo numër dhe madhësi kampioni

Me ultrasonikët me shumë mostra të Hielscher VialTweeter (për deri në 10 epruveta) dhe UIP400MTP (për mikropllakat/pllakat me shumë pusi) bëhet lehtësisht e mundur të zvogëlohet koha e përpunimit të mostrës për shkak të ultrazërit intensiv dhe saktësisht të kontrollueshëm duke marrë shpërndarjen dhe rendimentin e dëshiruar të madhësisë së fragmentit të ADN-së. . Fragmentimi tejzanor i ADN-së i bën hapat e përgatitjes së plazmidës efikase, të besueshme dhe të shkallëzueshme. Protokollet mund të shkallëzohen në mënyrë lineare nga një në mostra të shumta duke aplikuar parametra konstante të ultrazërit.
Ultrasonikët e sondave me një deri në pesë gishta janë idealë për përgatitjen e numrave më të vegjël të mostrave. Ultrasonikët laboratorikë të Hielscher janë të disponueshëm me nivele të ndryshme fuqie, në mënyrë që të mund të zgjidhni ndërprerësin ideal ultrasonik për aplikacionin tuaj të lidhur me ADN-në.