Përgatitja e plazmideve duke përdorur ultratinguj

Trajtimi me ultratinguj është një teknikë e besueshme për fragmentimin e ADN-së plazmidike. Amplituda që mund të kontrollohet me saktësi, mënyra e funksionimit me impulse dhe kontrolli i temperaturës janë veçoritë më të rëndësishme të një aparati me ultratinguj për fragmentimin e plazmideve pa i dëmtuar ato. Për më tepër, përdorimi i agjentëve të caktuar ndihmon në mbrojtjen nga degradimi i plazmideve. Hielscher Ultrasonics ofron zgjidhje të ndryshme për fragmentimin e kontrolluar të plazmideve në flakonë të veçantë, trajtimin e njëkohshëm me ultratinguj të shumë mostrave, si dhe të pllakave me shumë puse. Mësoni më shumë rreth fragmentimit të suksesshëm të plazmideve me ultratinguj!

Fragmentimi i plazmideve me forca prerëse duke përdorur ultratinguj

Kur mostrat e ADN-së u nënshtrohen valëve ultrasonike, dridhjet e gjeneruara nga ultratingujt krijojnë kavitacion akustik në lëng, i cili pret ose thyen molekulat e ADN-së me masë të lartë molekulare përmes forcave mekanike. Trajtimi me ultratinguj është metoda më e përdorur për eksperimentet e fragmentimit të ADN-së në masë me forca prerëse, duke përfshirë zbatime si imunoprecipitimi i kromatinës (ChIP), për të cilat përmasat e vogla të fragmenteve janë absolutisht thelbësore për të arritur rezolucion të lartë. (krh. Tseng et al., 2012)
ADN-ja plazmidike (pDNA) është një formë specifike e ADN-së, e karakterizuar nga forma e saj unazore, dhe gjendet te bakteret dhe disa eukariotë.
pDNA-ja e supermbështjellë është forma e dëshiruar e ADN-së plazmidike, pasi jep rezultatet më të mira në proceset pasuese, si sekuencimi i automatizuar dhe transfektimi. Trajtimi me ultratinguj është i përshtatshëm për fragmentimin e suksesshëm të pDNA-së, përfshirë pDNA-në e supermbështjellë.
Thompson et al. (2008) demonstruan se trajtimi i plazmideve me ultratinguj, i cili dihet se fragmenton ADN-në e supermbështjellë, është një mënyrë efektive për të përmirësuar gjatësitë e leximeve të sekuencës phred20 deri në atë pikë sa ato të mos ndryshojnë në mënyrë domethënëse nga shablloni i kontrollit i Beckman Coulter ose plazmidet e linearizuara në mënyrë enzimatike.

Përdorimi i vektorëve plazmidikë

Plazmidet përdoren shpesh si mjete për klonimin, transferimin dhe manipulimin e gjeneve. Kur plazmidet përdoren në eksperimente për këto qëllime, ato quhen vektorë. Fragmente të ADN-së ose gjene mund të futen në një vektor plazmidik, duke krijuar një të ashtuquajtur plazmid rekombinant. Vektorët plazmidikë përdoren si mjete transportuese për të futur ADN-në rekombinante në një qelizë pritëse dhe janë një përbërës kyç i klonimit molekular.
“Vektorët joviralë po studiohen gjerësisht për përdorimin e tyre të mundshëm në terapinë gjenike për trajtimin e sëmundjeve të ndryshme të ndërlikuara. Vektorët joviralë e mbrojnë ADN-në plazmidike nga degradimi fizik, kimik dhe enzimatik dhe e dërgojnë molekulën e ADN-së në vendin e synuar. Për shembull, liposomet kationike, kitozani dhe nanogrimca të tjera me ngarkesë pozitive formojnë komplekse me ADN-në plazmidike përmes ndërveprimeve elektrostatike. Megjithatë, komplekset liposome kationike/ADN plazmidike që formohen lehtësisht janë relativisht të mëdha (d.m.th., 300–400 nm) dhe heterogjene nga natyra, gjë që e vështirëson përdorimin e tyre në zbatime farmaceutike. Komplekset e mëdha dhe heterogjene ADN plazmidike/liposome, ADN plazmidike/aerosole dhe ADN plazmidike/peptide mund të zvogëlohen në grimca më të vogla dhe homogjene duke përdorur ultratinguj.” (Sarker et al., 2019)
Një shembull i spikatur i përdorimit të vektorëve plazmidikë është CRISPR–Cas9. Sistemi CRISPR–Cas9 zakonisht futet në qeliza si një plazmid i vetëm i madh ose si disa plazmide më të vogla që kodojnë një sekuencë të synuar, një udhëzues CRISPR dhe Cas9.

Përgatitja me ultratinguj e nanogrimcave PLGA të ngarkuara me ADN përmes nanoprecipitimit

Jo et al. (2020) përdorën poli(acid laktik-ko-glikolik) (PLGA) për të formuar një bartës nanogrimcash për dërgimin e një plazmidi model CRISPR–Cas9 në makrofagë primarë të prejardhur nga palca e kockave. Për nanoprecipitimin e nanogrimcave PLGA, u përdor PLGA me dy grupe fundore të ndryshme (grupe esteri dhe amine), me synimin që grupet fundore aminike të ngarkuara pozitivisht të rrisnin efikasitetin e kapsulimit dhe ngarkimin falë ndërveprimeve ndërmjet ngarkesave të tyre dhe skeletit të ADN-së të ngarkuar negativisht. Në një tub konik centrifugimi prej polipropileni me vëllim 50 mL, 100 mg Pluronic F127 u tretën në 20 mL ujë të dejonizuar (DI) të autoklavuar, duke i përzier me vorbullim, pasuar nga 30 min sonikim i butë në një banjë ultrasonike (shih CupHorn). U shtua një shufër përzierëse magnetike e autoklavuar dhe tretësira u përzie në 600 RPM për 30 min, ndërsa përgatiteshin tretësirat e tjera. Gjatë gjithë procesit u përdorën enë laboratorike plastike në vend të atyre prej qelqi për të minimizuar adsorbimin jospecifik të ADN-së. Tretësirat e PLGA-së së tretur në DMF (44,48 mg/ ml) dhe të pentacenit TIPS të tretur në THF (0,667 mg/ml) u përgatitën veçmas. PLGA-ja u la në qetësi që të lagej në DMF për 30 min, përpara se t’i nënshtrohej sonikimit për 30 min. (për protokollin e plotë shih Jo et al., 2020)

Mbrojtja e ADN-së plazmidike gjatë sonikimit

ADN-ja, përfshirë plazmidet dhe plazmidet e supermbështjella, është shumë e ndjeshme ndaj degradimit. Të gjitha metodat e disponueshme të fragmentimit njihen për disavantazhe të caktuara. Fragmentimi ultrasonik i ADN-së është një nga metodat e parapëlqyera, pasi sonikimi i kontrolluar, në kombinim me masa mbrojtëse, mundëson zvogëlimin e dëmtimit të vargjeve të ADN-së të shkaktuar nga prerja mekanike dhe nxehtësia.
Përveç parametrave të amplitudës së ulët, mënyrës së pulsimit dhe kontrollit të temperaturës gjatë prerjes ultrasonike të ADN-së, përdorimi i disa agjentëve tregoi një efekt të rëndësishëm mbrojtës kundër degradimit të ADN-së. Për shembull, polimere, peptide dhe lipide të ndryshme mbrojnë ADN-në plazmidike gjatë trajtimit me ultratinguj.

Qëndrueshmëria e ADN-së plazmidike dhe e nanokomplekseve ADN plazmidike/IL ndaj sforcimit prerës ultrasonik u hetua me anë të analizës me elektroforezë në xhel agaroze. Si ADN-ja plazmidike, ashtu edhe nanokomplekset ADN plazmidike/IL iu nënshtruan sforcimit prerës ultrasonik për kohëzgjatje të ndryshme. ADN-ja plazmidike u ekspozua ndaj sforcimit prerës ultrasonik për 0, 10, 20, 30 dhe 40 minuta. Ndërsa nanokomplekset ADN plazmidike/IL u ekspozuan ndaj sforcimit prerës ultrasonik për 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 dhe 120 minuta.
(studimi dhe figura: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) treguan se, kur nanostrukturat e ADN-së plazmidike / lëngut jonik (pDNA/IL) iu nënshtruan sforcimit prerës ultrasonik për 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 dhe 120 min dhe u kompleksuan me lipofektaminën, një agjent kationik për dërgimin e gjeneve i disponueshëm në treg, përqindjet e qelizave pozitive për fluoreshencë ishin përkatësisht 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% dhe 50% (shih grafikun më poshtë). Përqindja e qelizave pozitive për fluoreshencë u rrit kur nanostrukturat iu nënshtruan sforcimit prerës ultrasonik për 10 dhe 20 min, dhe më pas u ul ngadalë.

Ndikimi i lëngut jonik [Bmim][PF6] në dërgimin e ADN-së plazmidike në qelizat COS7. Nanokomplekset ADN plazmidike/IL (lëng jonik) iu nënshtruan sforcimit prerës ultrasonik për deri në 120 minuta dhe u kompleksuan me LA përpara se të dërgoheshin në qelizat COS7. Të dhënat tregojnë numrin mesatar (%) të qelizave HeLa pozitive për GFP, të numëruara në 10 fusha të ndryshme mikroskopike, dhe eksperimenti u krye disa herë në tri ditë të ndryshme. (Studimi dhe grafiku: ©Sarker et al., 2019)

Përgatitja e lizatit me ultratinguj

Protokolli i lizës qelizore me ultratinguj
Filloni me një mostër të pasuruar me qeliza, të përgatitur me një metodë të ndarjes së qelizave (p.sh., ndarja imunomagnetike e qelizave, klasifikimi i qelizave i aktivizuar nga fluoreshenca (FACS), centrifugimi në gradient dendësie, izolimi i qelizave sipas dendësisë me metoda imunologjike).
Mostrat qelizore duhet të përmbajnë një vëllim tretësire tampon për lizë që është i përshtatshëm për qëllimin eksperimental dhe aparatin me ultratinguj të tipit sondë.
Preferohen tretësirat tampon hipotonike, pasi ato përmirësojnë lizën qelizore me ultratinguj. Është e rëndësishme që aditivët dhe përqendrimi i kripës të përdoren në mënyrën e duhur.
Zgjidhni pajisjen tuaj për lizë me ultratinguj: Për trajtimin e tërthortë të flakonëve me ultratinguj, rekomandohen VialTweeter ose CupHorn. Për pllakat me shumë puse, UIP400MTP është aparati ideal me ultratinguj. Ndërsa për trajtimin klasik me ultratinguj me sondë, më të përshtatshëm janë homogjenizuesit me ultratinguj si UP100H ose UP200Ht me një majë mikro.
Protokolli për trajtimin me ultratinguj me sondë: Vendoseni sondën e aparatit me ultratinguj brenda vëllimit të mostrës në një tub mikrocentrifugimi dhe trajtojeni me ultratinguj për afërsisht 10 sekonda. Në varësi të mostrës së ADN-së, trajtimi me ultratinguj mund të përsëritet edhe një ose dy herë. Sasia e nevojshme e energjisë ultrasonike të dhënë (Ws/mL) varet nga viskoziteti i mostrës dhe lloji i ADN-së. Ftohja në banjë akulli dhe mënyra e funksionimit me pulsime e aparatit me ultratinguj ndihmojnë në parandalimin e degradimit termik të mostrës.
Pas lizës me ultratinguj, mostra centrifugohet për të ndarë mbetjet në sediment (që përmbajnë qeliza të palizuara, bërthama dhe organele të palizuara)
Nëse mostra nuk përpunohet më tej menjëherë, ajo mund të ruhet në një temperaturë të përshtatshme për të ruajtur viabilitetin e saj.

Aparate me ultratinguj për fragmentimin e ADN-së

Hielscher Ultrasonics ofron platforma të ndryshme të bazuara në ultratinguj për fragmentimin e ADN-së, ARN-së dhe kromatinës. Këto platforma të ndryshme përfshijnë sonda ultrasonike (sonotroda), zgjidhje për trajtim të tërthortë me ultratinguj për përgatitjen e njëkohshme të mostrave në disa tuba ose pllaka me shumë puse (p.sh., pllaka me 96 puse, pllaka mikrotitri), sonoreaktorë dhe pajisje ultrasonike të tipit cuphorn. Të gjitha platformat për prerjen e ADN-së me forca prerëse vihen në punë nga procesorë ultrasonikë me performancë të lartë, të akorduar sipas frekuencës, të cilët mund të kontrollohen me saktësi dhe japin rezultate të riprodhueshme.

Procesorë ultrasonikë për çdo numër dhe madhësi mostrash

Me aparatet me ultratinguj për shumë mostra VialTweeter (për deri në 10 epruveta) dhe UIP400MTP (për mikropllaka/ pllaka me shumë puse) të Hielscher, bëhet lehtësisht i mundur shkurtimi i kohës së përpunimit të mostrave falë trajtimit intensiv me ultratinguj që mund të kontrollohet me saktësi, duke arritur njëkohësisht shpërndarjen e dëshiruar të madhësive të fragmenteve të ADN-së dhe rendimentin e dëshiruar. Fragmentimi i ADN-së me ultratinguj i bën hapat e përgatitjes së plazmideve efikasë, të besueshëm dhe të shkallëzueshëm. Protokollet mund të shkallëzohen në mënyrë lineare nga një mostër në shumë mostra duke zbatuar parametra konstantë të ultratingujve.
Aparatet me ultratinguj me sondë me një deri në pesë gishta janë ideale për përgatitjen e një numri më të vogël mostrash. Aparatet laboratorike me ultratinguj të Hielscher janë të disponueshme me nivele të ndryshme fuqie, në mënyrë që të mund të zgjidhni pajisjen ideale të shpërbërjes me ultratinguj për aplikimin tuaj që lidhet me ADN-në.