Përgatitja e plazmidit duke përdorur ultratinguj

Ultratingulli është një teknikë e besueshme për të fragmentuar ADN-në plazmide. Amplituda saktësisht e kontrollueshme, mënyra e pulsimit dhe kontrolli i temperaturës janë tiparet më të rëndësishme të një aparati ultrasonik për fragmentimin e plazmidit jo të dëmshëm. Për më tepër, përdorimi i agjentëve të caktuar ndihmon në mbrojtjen kundër degradimit të plazmidit. Hielscher Ultrasonics ofron zgjidhje të ndryshme për fragmentimin e kontrolluar të plazmidit nga flakonet e vetme, njëkohësisht sonikimin e mostrave të shumta si dhe pllakat me shumë pus. Mësoni më shumë rreth fragmentimit të suksesshëm të plazmidit tejzanor!

Kërkesë informacioni





Fragmentimi tejzanor i ADN-së është një teknikë e besueshme dhe efikase që përdoret zakonisht në Sekuencën e Gjeneratës së ardhshme (NGS)

UIP400MTP lejon ultratinguj të kontrolluar saktësisht të pllakave me shumë pus. Një nga aplikimet e UIP400MTP është fragmentimi i ADN-së plazmidike në mënyrë që të përftohen fragmente me një gjatësi specifike të synuar.

Prerje plazmide duke përdorur ultratinguj

Kur mostrat e ADN-së i nënshtrohen valëve tejzanor, dridhjet e gjeneruara në mënyrë ultrasonike krijojnë kavitacion akustik në lëngun që qeth ose thyen molekulat e ADN-së me peshë të lartë molekulare nëpërmjet forcave mekanike. Sonication është metoda më e përdorur gjerësisht për eksperimentet e prerjes së ADN-së në masë, duke përfshirë aplikime, të tilla si Immunoprecipitation me Chromatin (ChIP), për të cilat madhësitë e vogla të fragmenteve janë absolutisht thelbësore për të marrë rezolucion të lartë. (krh. Tseng et al., 2012)
ADN-ja plazmide (pDNA) është formë specifike e ADN-së, e karakterizuar nga forma e saj unazore dhe gjendet në baktere dhe disa eukariote.
PADNA e mbimbështjellur është forma e dëshiruar e ADN-së plazmide pasi tregon rezultatet më të mira në proceset e rrjedhës së poshtme, si sekuenca dhe transfektimi i automatizuar. Ultratingulli është i përshtatshëm për të fragmentuar pADN-në, duke përfshirë pADN-në e supermbështjellur, me sukses.
Thompson etj. (2008) demonstroi se sonikimi plazmid, i cili njihet se fragmenton ADN-në e mbimbështjellur, është një mënyrë efektive për të përmirësuar gjatësitë e leximit të sekuencës phred20 deri në atë pikë sa ato nuk janë dukshëm të ndryshme nga shablloni i kontrollit të Beckman Coulter ose nga plazmidet e linearizuara enzimatikisht.

Avantazhet e Fragmentimit tejzanor të ADN -së

  • Pikërisht kontrollohet
  • Rezultate të riprodhueshme
  • E rregullueshme për të synuar gjatësinë e fragmenteve të ADN-së
  • kontrollin e temperaturës
  • I shkallëzuar në çdo madhësi të mostrës
Videoja tregon sistemin e përgatitjes së mostrës me ultratinguj UIP400MTP, i cili lejon përgatitjen e besueshme të mostrës së çdo pllake standarde me shumë pusi duke përdorur ultratinguj me intensitet të lartë. Aplikimet tipike të UIP400MTP përfshijnë lizën e qelizave, ADN-në, ARN-në dhe prerjen e kromatinës, si dhe nxjerrjen e proteinave.

Ultrasonicator UIP400MTP për sonifikimin e pllakave me shumë puse

Përdorimi i vektorëve plazmidë

Plazmidet shpesh përdoren si mjete për të klonuar, transferuar dhe manipuluar gjenet. Kur plazmidet përdoren në mënyrë eksperimentale për këto qëllime, ato quhen vektorë. Fragmentet ose gjenet e ADN-së mund të futen në një vektor plazmid, duke krijuar një të ashtuquajtur plazmid rekombinant. Vektorët plazmidë përdoren si mjete për të drejtuar ADN-në rekombinante në një qelizë pritëse dhe janë një komponent kyç i klonimit molekular.
“Vektorët joviralë janë duke u studiuar gjerësisht për përdorimin e tyre të mundshëm në terapinë gjenetike për trajtimin e sëmundjeve të ndryshme të komplikuara. Vektorët jo-viralë mbrojnë ADN-në plazmide kundër degradimit fizik, kimik dhe enzimatik dhe dërgojnë molekulën e ADN-së në vendin e synuar. Për shembull, liposomet kationike, kitozani dhe nanogrimca të tjera të ngarkuara pozitivisht formojnë komplekse me ADN-në plazmide përmes ndërveprimeve elektrostatike. Megjithatë, komplekset e liposomeve kationike/plazmidike të ADN-së të formuara lehtësisht janë relativisht të mëdha (dmth. 300-400 nm) dhe heterogjene në natyrë duke i bërë ato të vështira për t'u përdorur në aplikimet farmaceutike. Komplekset e mëdha dhe heterogjene të ADN-së/liposomeve plazmide, ADN-së plazmidike/aerosoleve dhe ADN-së plazmidike/peptideve mund të reduktohen në grimca më të vogla dhe homogjene duke përdorur ultratinguj.” (Sarker et al., 2019)
Një shembull i spikatur për përdorimin e vektorëve plazmidë është CRISPR-Cas9. Sistemi CRISPR-Cas9 zakonisht shpërndahet në qeliza si një plazmid i vetëm i madh ose plazmide të shumta më të vogla që kodojnë një sekuencë të synuar, një udhëzues CRISPR dhe Cas9.

Përgatitja tejzanor e Nanogrimcave PLGA të ngarkuara me ADN me nanoprecipitim

Jo et al. (2020) përdori poli(acid laktik-ko-glikolik) (PLGA) për të formuar një bartës nanogrimcash për shpërndarjen e një plazmidi model CRISPR-Cas9 në makrofagët primar që rrjedhin nga palca e eshtrave. Për nanoprecipitimin e nanogrimcave PLGA, PLGA me dy grupe fundore të ndryshme (grupet esterike dhe amine) u përdorën me objektivin që kapakët fundorë amine të ngarkuar pozitivisht të rrisin efikasitetin dhe ngarkesën e kapsulimit për shkak të ndërveprimeve të ngarkesës midis tij dhe shtyllës kurrizore të ngarkuar negativisht. ADN-në. Në një tub centrifuge konike polipropileni 50 ml, 100 mg Pluronic F127 u shpërnda në 20 ml ujë DI të autoklavuar me përzierje vorbull, e ndjekur nga 30 min sonikacion të butë duke përdorur një banjë tejzanor (shih CupHorn). U shtua një shirit trazues magnetik i autoklavuar dhe tretësira u përzie në 600 RPM për 30 minuta ndërsa tretësirat e tjera u bënë. Laboratori plastik u përdor në vend të enëve të qelqit për të minimizuar adsorbimin jospecifik të ADN-së. Tretësirat e PLGA të tretur në DMF (44.48 mg/ml) dhe TIPS pentacene të tretur në THF (0.667 mg/ml) u bënë veçmas. PLGA u la në qetësi për t'u lagur në DMF për 30 minuta përpara se të sonikohej për 30 minuta. (për protokollin e plotë shih Jo et al., 2020)

Aplikacione të ngjashme:

  • Nxjerrja e ADN-së
  • Kapsulimi i ADN-së
  • Dispersioni i ADN-së së veshur me nanogrimca
  • Dorëzimi i ADN-së plazmidike në qeliza
UP200St TD_CupHorn për sonifikimin indirekt të mostrave

UP200St CupHorn për sonikimin indirekt të mostrave, p.sh. për nxjerrjen dhe fragmentimin e ADN-së.

Kërkesë informacioni





Mbrojtja e ADN-së plazmide gjatë sonikimit

ADN-ja duke përfshirë plazmidet dhe plazmidet e mbimbështjella janë degradim shumë të ndjeshëm. Të gjitha metodat e disponueshme të fragmentimit njihen për disavantazhe të caktuara. Fragmentimi tejzanor i ADN-së është një nga metodat e preferuara pasi sonikimi i kontrolluar në kombinim me masat mbrojtëse lejon të reduktojë dëmtimin e vargjeve të ADN-së nga qethja dhe nxehtësia.
Përveç cilësimeve të amplitudës së ulët, mënyrës së pulsimit dhe kontrollit të temperaturës gjatë prerjes tejzanor të ADN-së, përdorimi i agjentëve të caktuar tregoi një efekt të rëndësishëm mbrojtës kundër degradimit të ADN-së. Për shembull, polimere, peptide dhe lipide të ndryshme mbrojnë ADN-në plazmide gjatë ultrazërit.

Lëngjet jonike mund të mbrojnë ADN-në plazmide nga dëmtimet gjatë sonikimit.

Stabiliteti i ADN-së plazmidike dhe nanokomplekseve plazmidike ADN/IL ndaj stresit të prerjes tejzanor u hetua duke përdorur analizën e elektroforezës së xhelit të agarozës. Të dy ADN-ja plazmidike dhe nanokomplekset plazmidike ADN/IL iu nënshtruan stresit të prerjes tejzanor për momente të ndryshme kohore. ADN-ja plazmidike u ekspozua ndaj stresit të prerjes tejzanor për 0, 10, 20, 30 dhe 40 minuta. Sidoqoftë, nanokomplekset plazmidike të ADN/IL u ekspozuan ndaj stresit të prerjes tejzanor për 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 dhe 120 minuta.
(studim dhe foto: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) tregoi se kur nanostrukturat plazmidike të ADN-së / lëngut jonik (pDNA/IL) iu nënshtruan stresit të prerjes tejzanor për 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 dhe 120 min dhe u kompleksuan me gjenin kationik të disponueshëm në treg. agjenti i shpërndarjes lipofectamine, përqindja e qelizave pozitive fluoreshente ishte përkatësisht 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% dhe 50% (shih grafikun më poshtë). Përqindja e qelizave fluoreshente pozitive u rrit kur nanostrukturat iu nënshtruan stresit prerës tejzanor për 10 dhe 20 minuta, dhe më pas u ul ngadalë.

Fragmentimi tejzanor i ADN-së plazmidike

Ndikimi i lëngut jonik [Bmim][PF6] në shpërndarjen e ADN-së plazmide në qelizat COS7. Nanokomplekset plazmidike të ADN/IL (lëng jonik) iu nënshtruan stresit të prerjes tejzanor për deri në 120 minuta dhe u kompleksuan me LA përpara se të shpërndaheshin në qelizat COS7. Të dhënat tregojnë numrin mesatar (%) të qelizave HeLa pozitive GFP të numëruara në 10 fusha të ndryshme mikroskopike dhe eksperimenti u krye shumë herë në tre ditë të ndryshme. (Studimi dhe grafiku: ©Sarker et al., 2019)

ADN-ja plazmide mund të mbrohet duke shtuar një agjent përpara fragmentimit tejzanor.

ADN-ja plazmidike mund të mbrohet duke shtuar një agjent përpara fragmentimit tejzanor: Degradimi i shkaktuar nga sonikimi i pADN-së së zhveshur (A) dhe i pADN-së i formuluar me 1,5 mM CaCl2 dhe 20 % (v/v) t-butanol (B)
Mostrat u sonikuan me një sondë 20 W për deri në 120 sekonda, siç tregohet në krye të çdo korsie. Korsia H korrespondon me shënuesin Hyperladder I ™️. Tregohen brezat plazmidike OC dhe SC.
(studim dhe foto: ©Wu et al., 2009)

Përgatitja e lizatit me ultratinguj

Protokolli i lizës së qelizave tejzanor
Ultrasonikator UP200Ht me mikromajë S26d2 për lizën tejzanor të mostrave biologjikeFilloni me një mostër të pasuruar qelizash që është përgatitur nëpërmjet një metode të ndarjes së qelizave (p.sh., ndarja e qelizave imunomagnetike, klasifikimi i qelizave të aktivizuara me fluoreshencë (FACS), centrifugimi i gradientit të densitetit, izolimi i qelizave me imunodensitet).
Mostrat e qelizave duhet të tregojnë një vëllim të një tamponi lize që është i përshtatshëm për qëllimin eksperimental dhe ultrasonikatorin e tipit sondë.
Preferohen tamponët hipotonikë pasi përmirësojnë lizën e qelizave tejzanor. Është e rëndësishme që aditivët dhe përqendrimi i kripës të përdoren në mënyrën e duhur.
Zgjidhni pajisjen tuaj të lizës me ultratinguj: Për sonifikimin indirekt të shisheve, rekomandohet VialTweeter ose CupHorn. Për pllakat me shumë pusi, UIP400MTP është ultrasonikatori ideal. Dhe sonikacioni klasik i tipit sonda, një homogjenizues tejzanor si UP100H ose UP200Ht me një mikro-majë janë më të përshtatshmet.
Protokolli për sonikimin e llojit të sondës: Vendoseni sondën e ultrazërit në vëllimin e kampionit në një tub mikrocentrifuge dhe sonikoni për rreth. 10 sekonda. Në varësi të mostrës së ADN-së, sonikimi mund të përsëritet një ose dy herë të tjera. Futja e kërkuar e energjisë tejzanor (Ws/mL) varet nga viskoziteti i mostrës dhe lloji i ADN-së. Ftohja nëpërmjet banjës së akullit dhe modaliteti i pulsimit të ultrazërit ndihmon në parandalimin e degradimit termik të mostrës.
Pas lizës tejzanor, kampioni centrifugohet për të ndarë mbeturinat e peletit (që përmbajnë qeliza, bërthama dhe organele të palizuara)
Nëse mostra nuk përpunohet menjëherë më tej, ajo mund të ruhet në një temperaturë të përshtatshme për të ruajtur qëndrueshmërinë e saj.

Ultrasonikë për copëzimin e ADN-së

Hielscher Ultrasonics ofron platforma të ndryshme të bazuara në ultratinguj për ADN, ARN dhe fragmentimin e kromatinës. Këto platforma të ndryshme përfshijnë sonda tejzanor (sonotrode), zgjidhje indirekte të zërit për përgatitjen e mostrës së njëkohshme të tubave të shumtë ose pllakave me shumë puse (p.sh., pllaka me 96 puse, pllaka mikrotiter), sonoreaktorë dhe kufikë tejzanor. Të gjitha platformat për prerjen e ADN-së mundësohen nga procesorë tejzanor të rregulluar me frekuencë, me performancë të lartë, të cilët janë saktësisht të kontrollueshëm dhe japin rezultate të riprodhueshme.

Përpunuesit tejzanor për çdo numër dhe madhësi mostre

Me ultrasonikët me shumë mostra të Hielscher VialTweeter (për deri në 10 epruveta) dhe UIP400MTP (për mikropllakat/pllakat me shumë pusi) bëhet lehtësisht e mundur të reduktohet koha e përpunimit të mostrës për shkak të ultrazërit intensiv dhe saktësisht të kontrollueshëm, ndërkohë që merret shpërndarjen dhe rendimentin e dëshiruar të madhësisë së fragmentit të ADN-së. . Fragmentimi tejzanor i ADN-së i bën hapat e përgatitjes së plazmidës efikase, të besueshme dhe të shkallëzueshme. Protokollet mund të shkallëzohen në mënyrë lineare nga një në mostra të shumta duke aplikuar parametra konstante të ultrazërit.
Ultrasonikët e sondave me një deri në pesë gishta janë idealë për përgatitjen e numrave më të vegjël të mostrave. Ultrasonikët laboratorikë të Hielscher janë të disponueshëm me nivele të ndryshme fuqie, në mënyrë që të mund të zgjidhni ndërprerësin ideal ultrasonik për aplikacionin tuaj të lidhur me ADN-në.

VialTweeter është një Ultrasonikator MultiSample që lejon përgatitjen e besueshme të mostrës në kushte të temperaturës të kontrolluara saktësisht.

Njësia e përgatitjes me shumë mostra tejzanor VialTweeter lejon sonifikimin e njëkohshëm deri në 10 shishka. Me pajisjen e fiksimit VialPress, deri në 4 tuba shtesë mund të shtypen në pjesën e përparme për sonifikim intensiv.

kontrolli i saktë i procesit

Ultrasonikët Hielscher mund të kontrollohen nga distanca nëpërmjet kontrollit të shfletuesit. Parametrat e tingullit mund të monitorohen dhe përshtaten saktësisht sipas kërkesave të procesit.Cilësimet saktësisht të kontrollueshme të zërit janë vendimtare pasi sonifikimi shterues mund të shkatërrojë ADN -në, ARN -në dhe kromatinën, por qethja e papërshtatshme tejzanor rezulton në ADN shumë të gjatë dhe fragmente të kromatinës. Ultratinguj dixhitalë të Hielscher mund të vendosen lehtësisht në parametrin e saktë të zërit. Cilësimet specifike të zërit mund të ruhen gjithashtu si cilësime të programuara për përsëritje të shpejtë të së njëjtës procedurë.
Të gjitha zërit protokollohen automatikisht dhe ruhen si skedar CSV në një kartë SD të integruar. Kjo lejon dokumentimin e saktë të provave të kryera dhe bën të mundur rishikimin e funksionimit të zërit lehtësisht.
Përmes telekomandës së shfletuesit, të gjithë ultrasonatorët dixhital mund të operohen dhe monitorohen përmes çdo shfletuesi standard. Instalimi i softuerit shtesë nuk kërkohet, pasi lidhja LAN është një konfigurim shumë i thjeshtë plug-n-play.

Mirëdashësi më e lartë ndaj përdoruesit gjatë përgatitjes së ADN-së me ultratinguj

Të gjithë tejzanorët Hielscher janë krijuar për të dhënë ultratinguj me performancë të lartë, ndërsa në të njëjtën kohë gjithmonë janë shumë miqësorë për përdoruesit dhe të lehtë për t’u përdorur. Të gjitha cilësimet janë të strukturuara mirë në një meny të qartë, e cila mund të arrihet lehtësisht përmes ekranit me prekje me ngjyra ose telekomandës së shfletuesit. Softueri i zgjuar me cilësime të programueshme dhe regjistrim automatik të të dhënave siguron cilësime optimale të zërit për rezultate të besueshme dhe të riprodhueshme. Ndërfaqja e menusë e pastër dhe e lehtë për t’u përdorur i kthen Hielscher tejzanorët në pajisje miqësore dhe efikase.
Tabela e mëposhtme ju jep një tregues të kapacitetit të përafërt përpunues të ultrasonikëve tanë laboratorikë për lizën e qelizave dhe fragmentimin e ADN-së:

Vëllimi i Serisë Shkalla e rrjedhjes Devices rekomanduara
pllaka me shumë pus n/a UIP400MTP
shishe, gotë e vogël n/a Kornizë tejzanor
deri në 10 shishe n/a VialTweeter
1 deri 500mL 10 deri 200mL / min UP100H
10 deri në 2000 ml 20 deri 400mL / min UP200Ht, UP400St

Na kontaktoni! / Pyet Na!

Pyesni për më shumë informacion

Ju lutemi përdorni formularin e mëposhtëm për të kërkuar informacion shtesë rreth homogjenizuesve tejzanor për nxjerrjen dhe fragmentimin e ADN-së, protokollet e aplikimit dhe çmimet. Ne do të jemi të lumtur të diskutojmë procesin tuaj me ju dhe t'ju ofrojmë një sistem tejzanor që përmbush kërkesat tuaja!









Ju lutem vini re tonë Politika e privatësisë.




Literatura / Referencat

Fakte të vlefshme

Çfarë janë plazmidet?
Një plazmid është një molekulë e vogël rrethore e ADN-së që është fizikisht e ndarë nga ADN-ja kromozomale dhe replikohet në mënyrë të pavarur. Plazmidet shpesh shoqërohen me gjene që kontribuojnë në mbijetesën e një organizmi dhe japin avantazhe specifike, p.sh. rezistencë ndaj antibiotikëve. Plazmidet më së shpeshti gjenden si molekula të vogla rrethore, me dy fije ADN-je në baktere; megjithatë, plazmidet ndonjëherë janë të pranishme në arkeat dhe organizmat eukariote. Plazmidet janë mjete të rëndësishme në biologjinë molekulare, gjenetikë, biokimi dhe shkencën e jetës. Të njohur si vektorë në inxhinierinë gjenetike, plazmidet përdoren për të replikuar ose shprehur disa gjene. Ndryshimi i synuar i një vektori quhet dizajn vektorial.

Analiza GFP në kërkimin e qelizave
Proteina fluoreshente e gjelbër (GFP) është një shënues biologjik i gjithanshëm për monitorimin e proceseve fiziologjike, vizualizimin e lokalizimit të proteinave dhe zbulimin e shprehjes transgjenike in vivo. GFP mund të ngacmohet nga linja lazer 488 nm dhe zbulohet në mënyrë optimale në 510 nm.


Ultrasonikë me performancë të lartë! Gama e produkteve të Hielscher mbulon spektrin e plotë nga ultrasonikatori kompakt laboratorik mbi njësitë e sipërme të stolit deri te sistemet tejzanor të plotë industrial.

Hielscher Ultrasonics prodhon homogjenizues tejzanor me performancë të lartë nga laboratormadhësia industriale.