Rrjedhat e punës në proteomikë me tretje të proteinave me kapacitet të lartë përpunimi

Proteomika është një fushë thelbësore për të kuptuar proceset dhe sistemet biologjike, ku tretja e proteinave përbën një hap kyç në rrjedhat e saj të punës. Tradicionalisht, tretja e proteinave kryhet në tretësirë duke përdorur enzima proteolitike si tripsina, e cila hidrolizon në mënyrë specifike lidhjet peptidike në mbetjet e lizinës dhe argininës. Ky proces gjeneron peptide mjaft të përshtatshme për jonizim dhe fragmentim në aplikimet e spektrometrisë së masës (MS). Megjithatë, metodat konvencionale të tretjes kërkojnë 12–24 orë për të përfunduar, duke krijuar pengesa të konsiderueshme në rrjedhat e punës në proteomikë.
Trajtimi me ultratinguj ofron një alternativë të fuqishme, duke shkurtuar ndjeshëm kohën e tretjes nga disa orë në vetëm pak minuta. Kur kombinohet me sonikatorë të avancuar për shumë mostra, si Hielscher CupHorn, VialTweeter dhe sonikatori për pllaka me 96 puse UIP400MTP, trajtimi me ultratinguj mundëson proteomikë të përshpejtuar me kapacitet të lartë përpunimi. Këto teknologji përmirësojnë rrjedhat e punës, duke zvogëluar kohën e përgatitjes së mostrave dhe duke rritur efikasitetin pa cenuar riprodhueshmërinë ose cilësinë e të dhënave.

Roli i energjisë ultrasonike në tretjen e proteinave

Trajtimi me ultratinguj përdor valë ultrasonike të fokusuara për të krijuar kavitacion – mikroflluska të lokalizuara që kolapsojnë duke gjeneruar forca të forta prerëse. Ky fenomen rrit transferimin e masës, nxit përzierjen e enzimave me substratet dhe shpalos strukturat e proteinave, duke ekspozuar vendet e prerjes ndaj enzimave proteolitike si tripsina.
Rezultati? Një zvogëlim i konsiderueshëm i kohës së tretjes pa cenuar efikasitetin ose riprodhueshmërinë.

Tretja proteolitike e përmirësuar me ultratinguj: metodologjia dhe rezultatet

Protokolli i tretjes së përshpejtuar

Tretja e asistuar nga ultratingujt kombinon enzimat proteolitike dhe energjinë ultrasonike për të përshpejtuar rrjedhat e punës. Për shembull, duke përdorur Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz), rrjedha e punës së tretjes vijon si më poshtë:

1. Reduktimi: Mostrat e proteinave (0,5 mg/mL, 20 µL) trajtohen me DTT (2 µL, 110 mM) në tampon bikarbonati amoni (12,5 mM). Trajtimi me ultratinguj zbatohet me amplitudë 50% për 5 minuta.
2. Alkilimi: Pas shtimit të IAA (2 µL, 400 mM), trajtimi me ultratinguj përsëritet në të njëjtat kushte.
3. Tretja: Mostrat hollohen dhe inkubohen me nanogrimca me tripsinë të imobilizuar. Një cikël përfundimtar trajtimi me ultratinguj (5 minuta) përfundon tretjen. Peptidet ndahen, thahen dhe ruhen për analizë me MS.

Kjo metodë ultrasonike zvogëlon kohën totale të përgatitjes nga 12 orë në më pak se 30 minuta. Pavarësisht procesit të përshpejtuar, rendimenti dhe cilësia e peptideve mbeten në përputhje me ato të metodave tradicionale që zgjasin gjatë gjithë natës.

Efikasiteti i tretjes së proteinave me ultratinguj

Në studimet krahasuese duke përdorur proteoma të E. coli:

• Identifikimi i proteinave: Në mostrat e tretura me ultratinguj u identifikuan 777 proteina në 5 minuta, krahasuar me 817 në 12 orë. Identifikimet e proteinave të përbashkëta tejkaluan 70%.
• Riprodhueshmëria: Analizat e përsëritura treguan vlera korrelacioni mbi 98% brenda secilës metodë, duke dëshmuar besueshmëri.
• Selektiviteti: Secila metodë treti në mënyrë preferenciale proteina të caktuara, ku tretja me ultratinguj favorizoi 65 proteina dhe tretja gjatë gjithë natës 54 proteina. Dallime të tilla të imta nxjerrin në pah potencialin unik të trajtimit me ultratinguj për aplikime specifike.

Rezultatet e kuantifikimit të proteinave pa etiketim për shtatë proteina të shtuara në një mostër të E. coli.
Proteinat e mëposhtme u shtuan në dy nivele të ndryshme, siç shënohet në kolonën
e emërtuar “Theo Ratio”. Theo Ratio është raporti teorik midis dy niveleve të përdorura në këtë
eksperiment. Albumina e serumit të gjedhit (ALBU), β-laktoglobulina (LACB), kazeina α-S1 (CASA1),
kazeina α-S2 (CASA2), citokromi c (CYC), ovalbumina (OVAL) dhe anhidraza karbonike 2
(CAH2). Raportet u llogaritën duke përdorur intensitetet LFQ të proteinave të marra nga analiza me MaxQuant.
Testi t i Studentit u zbatua për të krahasuar vlerat e marra me secilën metodë (p>0,01, n=3, t-theoretical=4,6).
Studimi dhe grafiku: © Martins et al., 2019)

Tripsina e imobilizuar në nanogrimca

Integrimi i nanogrimcave me tripsinë të imobilizuar (p.sh., T-FMNPs) me trajtimin me ultratinguj përmirëson më tej rrjedhat e punës në proteomikë. Këto nanogrimca sigurojnë një sipërfaqe të madhe për ndërveprimet enzimë–substrat, duke rritur efikasitetin. Kur zbatohet te proteomat komplekse, si ajo e E. coli, metoda e kombinuar arrin:

• Shpejtësia: Tretje e plotë brenda 5 minutave.
• Saktësia: Kuantifikim i proteinave i krahasueshëm me atë të metodave tradicionale (p > 0,01, n=3).
• Shkallëzueshmëria: Përshtatja me platforma me shumë puse, si UIP400MTP, mundëson përpunim me kapacitet të lartë.

Klikoni këtu për protokollin e hollësishëm me udhëzime hap pas hapi!
(shih Martins et al., 2019)

Tretje proteolitike me shpejtësi dhe kapacitet të lartë përpunimi me sonikatorët Hielscher

Modelet më të mira të sonikatorëve për proteomikë

Hielscher Ultrasonics ofron modele të ndryshme sonikatorësh për përgatitjen e njëkohshme të shumë mostrave, duke lehtësuar rrjedhat e punës me kapacitet të lartë përpunimi. Pavarësisht nëse punoni me flakonë, epruveta, pllaka me shumë puse (p.sh. pllaka me 6, 24 ose 96 puse) apo pjata Petri – ne ju ofrojmë sonikatorët idealë për eksperimentet tuaja.

Sonikatori UIP400MTP për pllaka me shumë puse

Për kapacitet maksimal përpunimi, UIP400MTP ofron mundësinë e përpunimit me ultratinguj të pllakave me 96 puse. I pajtueshëm me çdo mikropllakë standarde, UIP400MTP nuk kërkon materiale harxhuese të kushtueshme dhe ekskluzive të prodhuesit dhe ju jep lirinë të zgjidhni pllakën më të mirë me shumë puse për kërkimin tuaj. Duke shpërndarë energji në mënyrë të njëtrajtshme në të gjithë pllakën, ai mundëson reduktimin, alkilimin dhe tretjen e shpejtë të deri në 200 proteomave komplekse në vetëm 1 orë. Ky nivel automatizimi dhe efikasiteti është thelbësor për proteomikën me kapacitet të lartë përpunimi dhe për aplikimet klinike. Mësoni më shumë rreth sonikatorit për pllaka me shumë puse!

VialTweeter

VialTweeter është përshtatur për laboratorët që kërkojnë trajtimin e njëkohshëm me ultratinguj të deri në 10 flakonëve ose epruvetave. Qasja e tij joinvazive eliminon rreziqet e kontaminimit të kryqëzuar, duke siguruar njëkohësisht tretje të riprodhueshme të proteinave. Kjo pajisje është ideale për studiuesit që punojnë me vëllime të kufizuara mostrash ose me lloje të ndryshme mostrash.
Mësoni më shumë rreth sonikatorit VialTweeter për shumë epruveta!

Hielscher UP200St-CupHorn

Sonikatori CupHorn është një pajisje e fuqishme e projektuar për përpunimin e njëkohshëm të shumë mostrave në enë të mbyllura hermetikisht. Ai siguron shpërndarje të njëtrajtshme të energjisë së ultratingujve dhe kontroll të saktë të temperaturës. Aftësia për të përpunuar deri në pesë mostra njëkohësisht, së bashku me pajtueshmërinë e tij me rrjedhat e punës që përfshijnë reduktim, alkilim dhe tretje, e bën CupHorn një mjet të besueshëm për proteomikën e bazuar në MS.
Mësoni më shumë rreth CupHorn SonoReactor!

Protokoll hap pas hapi për tretjen proteolitike të asistuar me ultratinguj duke përdorur tripsinë të imobilizuar në nanogrimca

Ky protokoll nga Martins et al. (2019) është optimizuar për tretjen e shpejtë të proteinave duke përdorur energjinë e ultratingujve dhe tripsinë të imobilizuar në nanogrimca (T-FMNPs). Hapat e përshkruar sigurojnë reduktim, alkilim dhe proteolizë efikase, të përshtatshme për aplikime të spektrometrisë së masës (MS).
Hapat e protokollit

1. Reduktimi i lidhjeve disulfide
   • Shtoni 2 µL tretësirë DTT (110 mM) në mostrën proteinike prej 20 µL (0,5 mg/mL) në tampon AmBic.
   • Vendoseni epruvetën e mostrës në sonoreaktorin UP200St-CupHorn.
   • Trajtojeni mostrën me ultratinguj për 2,5 minuta me amplitudë 50% (200 W, 26 kHz).
   • Bëni një pauzë të shkurtër për të lejuar ftohjen, pastaj trajtojeni me ultratinguj edhe për 2,5 minuta në të njëjtat kushte.
2. Alkilimi i mbetjeve të reduktuara të cisteinës
   • Shtoni 2 µL tretësirë IAA (400 mM) në mostrën proteinike të reduktuar.
   • Trajtojeni me ultratinguj për 2,5 minuta me amplitudë 50% për të lehtësuar alkilimin.
   • Bëni një pauzë për ftohje, pastaj trajtojeni me ultratinguj edhe për 2,5 minuta.

   Shënim: Minimizoni ekspozimin e mostrës së alkiluar ndaj dritës për të parandaluar degradimin e IAA.

3. Hollimi i mostrës
   • Hollojeni mostrën proteinike të alkiluar deri në një vëllim përfundimtar prej 100 µL duke përdorur tampon AmBic 25 mM që përmban 4% acetonitril (v/v).
   • Përziejeni plotësisht duke pipetuar butësisht.
4. Tretja proteolitike me tripsinë të imobilizuar në nanogrimca
   • Shtoni 20 µL tretësirë T-FMNP (3 mg/mL) në mostrën proteinike të holluar.
   • Sonikoni përzierjen në sonoreaktor për 2,5 minuta me amplitudë 50%.
   • Bëni një pauzë për ftohje, pastaj sonikoni edhe për 2,5 minuta në të njëjtat kushte.
5. Ndarja e nanogrimcave të tripsinës
   • Përdorni një magnet për të ndarë T-FMNPs nga supernatanti që përmban peptidet e përftuara nga tretja.
   • Transferojeni supernatantin në një tub të ri mikrocentrifugimi.
6. Përgatitja e peptideve për analizën MS
   • Thajeni supernatantin që përmban peptide në një centrifugë me vakum.
   • Ruajini peptidet e thara në -20°C deri në analizën e mëtejshme me spektrometri të masës.