Rrjedhat e punës proteomike me tretje të proteinave me performancë të lartë

Proteomika është një fushë thelbësore për të kuptuar proceset dhe sistemet biologjike, me tretjen e proteinave që përbën një hap kritik në rrjedhën e saj të punës. Tradicionalisht, tretja e proteinave kryhet në tretësirë duke përdorur enzima proteolitike si tripsina, e cila hidrolizon në mënyrë specifike lidhjet peptide në mbetjet e lizinës dhe argininës. Ky proces gjeneron peptide të përshtatshme për jonizimin dhe fragmentimin në aplikimet e spektrometrisë së masës (MS). Megjithatë, metodat konvencionale të tretjes kërkojnë 12-24 orë për të arritur përfundimin, duke krijuar pengesa të konsiderueshme në rrjedhat e punës proteomike.
Ultratingulli ofron një alternativë të fuqishme, duke shkurtuar në mënyrë dramatike kohën e tretjes nga orë në vetëm disa minuta. Kur kombinohet me sonikatorë të avancuar me shumë mostra si Hielscher CupHorn, VialTweeter dhe sonikatorin me pllaka 96 pusesh UIP400MTP, ultratingulli mundëson proteomikë të përshpejtuar dhe të lartë. Këto teknologji thjeshtojnë rrjedhat e punës, duke reduktuar kohën e përgatitjes së mostrës dhe duke rritur efikasitetin pa kompromentuar riprodhueshmërinë ose cilësinë e të dhënave.

Roli i energjisë tejzanor në tretjen e proteinave

Ultratingulli përdor valë të fokusuara ultratinguj për të krijuar kavitacion - mikroflluska të lokalizuara që shemben për të gjeneruar forca të forta prerëse. Ky fenomen rrit transferimin e masës, nxit përzierjen e enzimave me substrate dhe shpalos strukturat e proteinave, duke i ekspozuar vendet e ndarjes ndaj enzimave proteolitike si tripsina.
Rezultati? Një reduktim i ndjeshëm në kohën e tretjes pa kompromentuar efikasitetin ose riprodhueshmërinë.

Tretja proteolitike e përmirësuar me ultratinguj: Metodologjia dhe rezultatet

Protokolli i tretjes së përshpejtuar

Tretja e asistuar me ultratinguj kombinon enzimat proteolitike dhe energjinë tejzanor për të përshpejtuar rrjedhën e punës. Për shembull, duke përdorur Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz), rrjedha e punës e tretjes vazhdon si më poshtë:

1. Reduktimi: Mostrat e proteinave (0,5 mg/mL, 20 µL) trajtohen me DTT (2 µL, 110 mM) në tampon bikarbonat amoniumi (12,5 mM). Sonication aplikohet në amplitudë 50% për 5 minuta.
2. Alkilimi: Pas shtimit të IAA (2 µL, 400 mM), sonikimi përsëritet në të njëjtat kushte.
3. Tretja: Mostrat hollohen dhe inkubohen me nanogrimca të imobilizuara të tripsinës. Një raund i fundit i sonikacionit (5 minuta) përfundon tretjen. Peptidet ndahen, thahen dhe ruhen për analizë MS.

Kjo metodë tejzanor redukton kohën totale të përgatitjes nga 12 orë në nën 30 minuta. Pavarësisht nga procesi i përshpejtuar, rendimenti dhe cilësia e peptideve mbeten në përputhje me metodat tradicionale brenda natës.

Efikasiteti i tretjes së proteinave me ultratinguj

Në studimet krahasuese duke përdorur proteomet E. coli:

• Identifikimi i proteinave: Mostrat e tretura me ultratinguj identifikuan 777 proteina në 5 minuta, krahasuar me 817 në 12 orë. Identifikimi i përbashkët i proteinave tejkaloi 70%.
• Riprodhueshmëria: Analizat e përsëritura treguan vlera korrelacioni mbi 98% brenda secilës metodë, duke demonstruar besueshmëri.
• Selektiviteti: Disa proteina treten në mënyrë preferenciale me secilën metodë, me tretje tejzanor që favorizonte 65 proteina dhe tretje gjatë natës 54 proteina. Dallime të tilla të nuancuara nënvizojnë potencialin unik të ultrazërit për aplikime specifike.

Rezultatet sasiore të proteinave pa etiketa të shtatë proteinave të ngjitura në një E. colimostër. Proteinat e mëposhtme u shtuan në dy nivele të ndryshme siç u përmend në kolonënamed as “Theo Ratio”. Theo Ratio is the theoretical ratio between the two levels used in thiseksperiment. Albumina e serumit të gjedhit (ALBU), β-laktoglobulina (LACB), α-S1 kazeina (CASA1),α-S2 kazeinë (CASA2), citokrom c (CYC), ovalbumin (OVAL) dhe anhidrazë karbonik 2(CAH2). Raportet u llogaritën duke përdorur intensitetet e proteinës LFQ të marra nga MaxQuantanalysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).Studimi dhe grafika: © Martins et al., 2019)

Tripsina e imobilizuar me nanogrimca

Integrimi i nanogrimcave të imobilizuara të tripsinës (p.sh., T-FMNP) me ultratinguj rrit më tej rrjedhat e punës së proteomikës. Këto nanogrimca ofrojnë një sipërfaqe të lartë për ndërveprimet enzimë-substrat, duke rritur efikasitetin. Kur aplikohet në proteome komplekse, si E. coli, metoda e kombinuar arrin:

• Shpejtësia: Përfundoni tretjen brenda 5 minutave.
• Saktësia: Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
• Shkallëzueshmëria: Përshtatja me platformat me shumë puse si UIP400MTP mundëson përpunim me shpejtësi të lartë.

Klikoni këtu për protokollin e detajuar me udhëzime hap pas hapi!
(krh. Martins et al., 2019)

Tretje proteolitike me shpejtësi të lartë dhe performancë të lartë me sonikatorë Hielscher

Modelet më të mira të Sonicator për Proteomics

Hielscher Ultrasonics ofron modele të ndryshme sonikatorësh për përgatitjen e njëkohshme me shumë mostra duke lehtësuar rrjedhat e punës me performancë të lartë. Pavarësisht nëse punoni me shishe, epruveta, pllaka me shumë pus (p.sh. pjata 6, 24, 96 pusi) ose enë Petri – ne ju ofrojmë sonikatorët idealë për eksperimentet tuaja.

UIP400MTP sonikues me pllaka me shumë pusi

Për performancën përfundimtare, UIP400MTP ofron aftësinë për të përpunuar pllaka 96 pusesh në mënyrë ultrasonike. E përputhshme me çdo mikropllakë standarde, UIP400MTP nuk kërkon pajisje të shtrenjta të disponueshme të disponueshme dhe ju jep lirinë për të zgjedhur pjatën më të mirë me shumë pllakë për kërkimin tuaj. Duke dhënë energji uniforme nëpër pjatë, mundëson reduktim të shpejtë, alkilim dhe tretje të deri në 200 proteome komplekse në vetëm 1 orë. Ky nivel automatizimi dhe efikasiteti është thelbësor për proteomikë dhe aplikime klinike me performancë të lartë. Mësoni më shumë rreth sonikatorit me pllaka me shumë pusi!

VialTweeter

VialTweeter është përshtatur për laboratorët që kërkojnë sonikimin e njëkohshëm të deri në 10 flakoneve ose epruvetave. Qasja e tij jo-invazive eliminon rreziqet e ndërthurjes së kontaminimit duke siguruar tretje të riprodhueshme të proteinave. Kjo pajisje është ideale për studiuesit që punojnë me vëllime të kufizuara mostrash ose lloje të ndryshme të mostrave.
Mësoni më shumë rreth sonikatorit me shumë tuba VialTweeter!

Hielscher UP200St-CupHorn

Sonicatori CupHorn është një pajisje e fuqishme e krijuar për përpunimin e njëkohshëm të mostrave të shumta në kontejnerë të mbyllur. Siguron shpërndarje uniforme të energjisë tejzanor dhe kontroll të saktë të temperaturës. Aftësia për të përpunuar deri në pesë mostra njëkohësisht, së bashku me përputhshmërinë e saj me flukset e punës të reduktuara, të alkiluara dhe të tretura, e bën CupHorn një mjet të besueshëm për proteomikën e bazuar në MS.
Mësoni më shumë rreth CupHorn SonoReactor!

Protokolli hap pas hapi për tretjen proteolitike të asistuar me ultratinguj duke përdorur tripsinë të imobilizuar me nano grimca

Ky protokoll nga Martins et al. (2019) është optimizuar për tretje të shpejtë të proteinave duke përdorur energji tejzanor dhe tripsinë të imobilizuar nga nanogrimca (T-FMNPs). Hapat e përshkruar sigurojnë reduktim efikas, alkilim dhe proteolizë të përshtatshme për aplikime të spektrometrisë së masës (MS).
Hapat e protokollit

1. Reduktimi i lidhjeve disulfide
   • Shtoni 2 µL tretësirë DTT (110 mM) në kampionin e proteinës 20 µL (0,5 mg/mL) në tampon AmBic.
   • Vendoseni tubin e mostrës në soreaktorin UP200St-CupHorn.
   • Sonikojeni kampionin për 2,5 minuta në amplitudë 50% (200 W, 26 kHz).
   • Pushoni për një interval të shkurtër për të lejuar ftohjen, më pas sonikoni për 2,5 minuta të tjera në të njëjtat kushte.
2. Alkilimi i mbetjeve të reduktuara të cisteinës
   • Shtoni 2 µL tretësirë IAA (400 mM) në kampionin e proteinës së reduktuar.
   • Soniconi për 2.5 minuta në amplitudë 50% për të lehtësuar alkilimin.
   • Pushoni për ftohje, më pas sonikoni për 2,5 minuta të tjera.

   Shënim: Minimizoni ekspozimin e kampionit të alkiluar ndaj dritës për të parandaluar degradimin e IAA.

3. Hollimi i mostrës
   • Holloni kampionin e proteinës së alkiluar në një vëllim përfundimtar prej 100 µL duke përdorur ambalazh 25 mM AmBic që përmban 4% acetonitril (v/v).
   • Përziejini tërësisht me pipetimin e butë.
4. Tretje Proteolitike me Tripsinë të Imobilizuar nga Nanogrimca
   • Shtoni 20 µL tretësirë T-FMNP (3 mg/mL) në kampionin e proteinës së holluar.
   • Përzierja sonike në soreaktor për 2.5 minuta në amplitudë 50%.
   • Pushoni për ftohje, më pas sonikoni për 2,5 minuta të tjera në të njëjtat kushte.
5. Ndarja e Nanogrimcave të Tripsinës
   • Përdorni një magnet për të ndarë T-FMNP-të nga supernatanti që përmban peptide të tretura.
   • Transferoni supernatantin në një tub të ri mikrocentrifuge.
6. Përgatitja Peptide për Analizën e MS
   • Thajeni supernatantin që përmban peptide në një centrifugë vakum.
   • Ruani peptidet e thara në -20°C deri në analizë të mëtejshme me spektrometrinë e masës.