Protokoll i proteomikës: Sonikimi pa kontakt përmirëson përgatitjen e mostrave peptidike për MS
Proteomika nga poshtë lart është bërë një gur themeli i zbulimit modern të biomarkerëve, biologjisë strukturore dhe diagnostikës klinike. Duke i tretur proteinat në peptide përpara analizës me spektrometri të masës (MS), studiuesit mund të arrijnë mbulim më të gjerë të sekuencës dhe kuantifikim më të besueshëm. Megjithatë, përgatitja e mostrave biologjike me kompleksitet të lartë për MS mbetet teknikisht kërkuese. Përparimet e fundit metodologjike nxjerrin në pah se si përpunimi i kontrolluar me ultratinguj – konkretisht me sonikatorin pa kontakt për shumë tuba VialTweeter dhe sonikatorin për mikropllaka UIP400MTP – mund ta thjeshtojë ndjeshëm këtë rrjedhë pune, të përmirësojë riprodhueshmërinë dhe të parandalojë pengesat e zakonshme në funksionimin e instrumenteve.
Gjeni një protokoll të hollësishëm për përgatitjen e mostrave për të përftuar peptide me madhësi të përshtatshme për analizë me MS.
Kush duhet të përdorë sonikimin pa kontakt për përgatitjen e mostrave peptidike?
- Laboratorët e proteomikës nga poshtë lart dhe të zbulimit: Studiuesit që përgatisin mostra me kompleksitet të lartë për rrjedha pune LC-MS ose MALDI dhe që kërkojnë rikuperim të qëndrueshëm të peptideve me rendiment të lartë nga matrica të ndryshme biologjike.
- Përdoruesit e S-Trap™ dhe të kapjes në suspension: Ekipet që mbështeten te pastrimi me mikrokolona dhe që kanë nevojë për fragmentim mekanik të kontrolluar të ADN-së për të parandaluar bllokimin e kolonave dhe për të siguruar ngarkim dhe tretje pa pengesa të mostrave.
- Grupet e kërkimit klinik dhe translacional: Laboratorët që përpunojnë inde, qeliza, plazmë, serum ose lëng cerebrospinal, ku riprodhueshmëria nga një seri në tjetrën dhe integriteti i mostrave janë vendimtarë.
- Ekipet e MS-së sasiore dhe të synuar: Laboratorët që kryejnë studime krahasuese rigoroze, ku sonikatorët me sondë sjellin rreziqe kontaminimi të kryqëzuar që mund të cenojnë kuantifikimin e peptideve me bollëk të ulët.
- Qendrat e shërbimeve të përbashkëta dhe veprimtaritë me kapacitet të lartë përpunimi të mostrave: Grupet që përpunojnë njëkohësisht shumë përsëritje biologjike dhe që përfitojnë nga sonikimi në bllok i shumë tubave të mbyllur me VialTweeter, i cili eliminon pastrimin e sondës, zvogëlon kohën e punës manuale dhe ruan kushte aseptike.
- Studiuesit e PTM-ve dhe të strukturës së proteinave: Studiuesit që kërkojnë përpunim të butë, me temperaturë të kontrolluar, për të ruajtur modifikimet labile dhe për të maksimizuar mbulimin e sekuencës gjatë lizës dhe homogjenizimit të qelizave.
Sonikatori për shumë mostra “VialTweeter” për përgatitjen pa kontakt të mostrave në shumë flakonë të mbyllur për proteomikë
Përmbledhje e protokollit: Nga indet dhe qelizat te peptidet e gatshme për MS
Rrjedha e punës së proteomikës nga poshtë lart, e përdorur gjerësisht dhe e përshkruar nga Wojtkiewicz et al., ofron një metodë të qëndrueshme, me shkallë të zgjerueshme përpunimi, për përgatitjen e mostrave peptidike nga matrica të ndryshme biologjike. Duke nisur me 50–100 mg ind të ngrirë në mënyrë të menjëhershme ose 1–20 milionë qeliza, protokolli integron teknologjinë e kapjes në suspension (S-Trap™) për të larguar me efikasitet detergjentët, kripërat dhe ndotësit përpara tretjes enzimatike.
Pas lizës, kuantifikimit të proteinave, reduktimit dhe alkilimit, mostra acidifikohet dhe ngarkohet në një kolonë centrifugimi S-Trap™, ku kryhet tretja me tripsinë/lysC. Peptidet e përftuara eluohen, thahen dhe i nënshtrohen analizës LC-MS. Kur zbatohet për 50 mg ind të zemrës së njeriut, kjo rrjedhë pune jep në mënyrë të qëndrueshme peptide të mjaftueshme për 30–40 injektime, duke identifikuar mbi 4 000 proteina unike në çdo analizë. Ndërsa proceset kimike dhe pastrimi me kolona janë të përcaktuara mirë, suksesi i procesit varet shumë nga hapat fillestarë të shpërbërjes fizike dhe të menaxhimit të ADN-së.
Protokolli rekomandon përdorimin e sonikatorit për shumë tuba VialTweeter për lizën e qelizave me sonikim dhe fragmentimin mekanik të ADN-së – të dy hapat janë vendimtarë për analizën e peptideve.
VialTweeter sonikon tuba të mbyllur Eppendorf prej 1,0, 1,5 dhe 2,0mL, si edhe flakonë të ndryshëm NUNC
Liza e qelizave dhe indeve me ultratinguj për ekstraktimin e proteinave
Në rrjedhën e punës së proteomikës nga poshtë lart, sonikimi është një hap kyç në lizën e mostrave qelizore për nxjerrjen e proteinave për analizën e mëvonshme me spektrometri të masës. Pas shtimit të solucionit tampon me SDS për lizën qelizore në sedimentin qelizor, mostrat i nënshtrohen përpunimit me ultratinguj duke përdorur sonikatorin për shumë tuba VialTweeter. Protokolli përdor tuba mikrocentrifugimi 1,5 mL dhe përcakton funksionimin e sonikatorit me fuqi 30%, me 10 sekonda në punë dhe 10 sekonda pushim, të përsëritura në 3 cikle. Pas pritjes prej 1 minute, cikli përsëritet edhe dy herë. Mostrat ftohen vazhdimisht me akull.
Ky proces jo vetëm ndihmon në shpërbërjen e qelizave, por është posaçërisht i nevojshëm për fragmentimin me forca prerëse të ADN-së gjenomike të çliruar gjatë lizës. Fragmentimi efektiv i ADN-së me forca prerëse është thelbësor për të ulur viskozitetin e mostrës dhe për të parandaluar bllokimin e kolonave S-Trap™, duke siguruar kështu rikuperim optimal të proteinave dhe tretje të besueshme të peptideve në fazat pasuese.
Roli vendimtar i fragmentimit të ADN-së me forca prerëse nga ultratingujt
Një nga problemet më të shpeshta në rrjedhat e punës të bazuara në S-Trap™ është bllokimi i kolonës, i cili shkaktohet pothuajse ekskluzivisht nga ADN-ja gjenomike me peshë të lartë molekulare, e çliruar gjatë homogjenizimit të qelizave ose indeve. ADN-ja e paprekur rrit në mënyrë drastike viskozitetin e mostrës, bllokon peptidet dhe pengon kalimin nëpër shtratin mikroporoz të sorbentit S-Trap™.
Përpunimi me ultratinguj e zgjidh këtë problem duke e fragmentuar mekanikisht ADN-në në fragmente të vogla e të tretshme. Duke aplikuar energji akustike të kontrolluar, VialTweeter i fragmenton me efikasitet acidet nukleike me forca prerëse, pa gjeneruar nxehtësi të tepërt ose pa futur ndotës të huaj. Kjo ulje e viskozitetit siguron ngarkim pa pengesa të mostrës, shpejtësi të qëndrueshme të rrjedhjes nëpër kolonë dhe kinetikë të pandërprerë të tretjes.
Parametrat e optimizuar të sonikimit me VialTweeter
Protokolli përcakton një regjim sonikimi me riprodhueshmëri të lartë, të optimizuar për integritetin e mostrave biologjike dhe përputhshmërinë me analizën e mëvonshme me MS. Për mostrat në tuba mikrocentrifugimi 1,5mL, duke përdorur sonikatorin me bllok pa kontakt Hielscher VialTweeter, parametrat e mëposhtëm sigurojnë lizë dhe fragmentim optimal të ADN-së me forca prerëse, duke ruajtur strukturën e proteinave:
- Amplituda: fuqi 30%
- Modeli i ciklit: 10 sekonda NË PUNË / 10 sekonda PUSHIM
- Kohëzgjatja: 3 cikle (10sec NË PUNË/10sec PUSHIM) → pushim 1 minutë mbi akull → përsëriteni edhe 2 herë
- Menaxhimi i temperaturës: Mostrat vendosen mbi akull gjatë përpunimit për të parandaluar denatyrimin termik dhe aktivitetin e parakohshëm enzimatik
Kjo qasje e sonikimit me impulse parandalon mbinxehjen e lokalizuar, minimizon oksidimin e peptideve dhe siguron ekspozim akustik të njëtrajtshëm në të gjitha flakonet. Konfigurimi me tuba të mbyllur eliminon gjithashtu nevojën për pastrimin e sondës ndërmjet mostrave, duke ulur në mënyrë drastike kohën e punës së drejtpërdrejtë të operatorit dhe ndryshueshmërinë ndërmjet operatorëve.
Përparësitë kryesore për rrjedhat moderne të punës në proteomikë
Integrimi i VialTweeter në procesin tuaj të proteomikës nga poshtë lart ofron disa përfitime operative dhe shkencore:
- Fragmentim i qëndrueshëm i ADN-së: Transmetimi i njëtrajtshëm i energjisë akustike në të gjitha flakonet siguron ulje të riprodhueshme të viskozitetit dhe parandalon ndryshueshmërinë nga një seri në tjetrën gjatë ngarkimit në S-Trap™.
- Ruajtja e modifikimeve labile: Përpunimi në temperaturë të ulët në një banjë me akull mbron modifikimet paspërkthimore (PTM) dhe parandalon agregimin e proteinave të shkaktuar nga nxehtësia gjatë lizës qelizore.
- Përpunim i thjeshtuar në fazat pasuese: Lizatet e përpunuara me VialTweeter mund të kthjellohen drejtpërdrejt me centrifugim dhe t’u nënshtrohen matjeve sasiore pa hapa shtesë pastrimi, duke përshpejtuar kalimin drejt tretjes me S-Trap™.
- Mundësi zgjerimi dhe fleksibilitet: Të njëjtat cilësime sonikimi zbatohen si për mostrat e indeve me kompleksitet të lartë, ashtu edhe për suspensionet qelizore, duke mbështetur rrjedhat e punës për proteomikën e zbulimit, përcaktimin sasior të synuar dhe glikoproteomikën. Sonikatorët Hielscher për mikropllaka mundësojnë zgjerim të lehtë të përpunimit në një numër të madh mostrash në pllaka me shumë puse.
Sonikatori pa kontakt për shumë tuba VialTweeter mund të përdoret në kabinete frigoriferike
Sonikatorë për përgatitjen e mostrave për proteomikë
Përgatitja e mostrave peptidike me cilësi të lartë për spektrometrinë e masës kërkon më shumë sesa lizë efikase – ajo kërkon kontroll të saktë të fragmentimit mekanik të ADN-së, temperaturës dhe parandalimit të kontaminimit. Duke përfshirë Hielscher VialTweeter në rrjedhën tuaj të punës të proteomikës nga poshtë lart, mund të eliminoni bllokimin e S-Trap™, të siguroni rikuperim të riprodhueshëm të proteinave dhe të ruani pastërtinë e nevojshme për analiza të ndjeshme MS. Pavarësisht nëse përpunoni inde njerëzore, qeliza të kultivuara apo lizate komplekse, përpunimi me bllok ultrasonik ofron besueshmërinë, mundësinë e rritjes së shkallës dhe kontrollin e procesit që kërkojnë laboratorët modernë të proteomikës.
Për të rritur numrin e mostrave të përpunuara, përfitoni nga modelet e sonikatorëve të fokusuar pa kontakt për mikropllaka të Hielscher, UIP400MTP dhe UIP550MTP! Përpunoni çdo pllakë standarde me shumë puse për proteomikë me kapacitet të lartë përpunimi!
Përpunimi në tuba të mbyllur kundrejt sonikatorëve tradicionalë me sondë
Historikisht, studiuesit janë mbështetur te sonikatorët me sondë me kontakt të drejtpërdrejtë për fragmentimin mekanik të ADN-së. Megjithëse janë efektive, sistemet me sondë sjellin disa kufizime kritike në rrjedhat e punës të proteomikës:
- Rreziku i kontaminimit të kryqëzuar: Ripërdorimi i një sonde në disa mostra shkakton bartje të materialit përmes aerosoleve dhe fut ndotës nga mostra të tjera, të cilët shtrembërojnë rezultatet sasiore të MS-së.
- Humbja e mostrës: Futja e drejtpërdrejtë mund të shkaktojë spërkatje, avullim dhe ngjitje të peptideve të çmuara në sipërfaqen e sondës.
- Pastrimi: Dekontaminimi i plotë i sondës ndërmjet përpunimeve kërkon kohë dhe shpesh është i paplotë, duke cenuar studimet e proteinave me bollëk të ulët.
Sonikatori me bllok VialTweeter i përpunon mostrat tërësisht brenda tubave të mbyllur të mikrocentrifugimit. Ky projektim me sistem të mbyllur eliminon kontaktin ndërmjet sondës dhe mostrës, parandalon formimin e aerosoleve dhe ruan kushte rreptësisht aseptike gjatë gjithë homogjenizimit dhe lizës. Për laboratorët që përpunojnë lizate indore me kompleksitet të lartë ose linja të shumta qelizore, kjo sjell të dhëna MS më të pastra, rikuperim më të lartë të peptideve dhe replikate biologjike më të besueshme.
Rritja e shkallës për përgatitjen e mostrave me kapacitet të lartë përpunimi në pllaka me shumë puse
Me modelet e sonikatorëve për mikropllaka UIP400MTP dhe UIP550MTP, përpunimi në tuba mund të zgjerohet lehtësisht në përpunim mostrash me kapacitet të lartë në çdo pllakë standarde me shumë puse.
Sonikatori për pllaka me shumë puse UIP400MTP për ekstraktimin e proteinave nga mostrat me kapacitet të lartë përpunimi
Pyetje të shpeshta rreth sonikimit për përgatitjen e mostrave peptidike
Pse nevojitet sonikimi përpara përpunimit të peptideve me S-Trap™?
Sonikimi është i nevojshëm për të fragmentuar mekanikisht ADN-në gjenomike me masë molekulare të lartë, e cila çlirohet gjatë lizës së qelizave ose indeve. ADN-ja e paprekur e rrit në mënyrë drastike viskozitetin e mostrës, gjë që mund të bllokojë mikrokolonën S-Trap™ dhe të mbajë të bllokuara peptidet, duke ulur ndjeshëm rikuperimin dhe përputhshmërinë me MS-në.
Si e përmirëson sonikatori me bllok VialTweeter përgatitjen e mostrave krahasuar me sonikatorët tradicionalë me sondë?
Ndryshe nga sonikatorët me sondë me kontakt të drejtpërdrejtë, të cilët kërkojnë pastrim të kujdesshëm ndërmjet përpunimeve dhe paraqesin rrezik të bartjes së materialit përmes aerosoleve, VialTweeter i përpunon mostrat tërësisht brenda flakonëve dhe tubave të mikrocentrifugimit të mbyllur. Ky projektim me tuba të mbyllur eliminon kontaminimin e kryqëzuar, parandalon humbjen e mostrës dhe ruan kushte rreptësisht aseptike gjatë gjithë homogjenizimit dhe lizës qelizore.
Cilët janë parametrat optimalë të sonikimit për përgatitjen e mostrave për proteomikë?
Për mostrat biologjike si qelizat dhe indet, protokolli i rekomanduar përdor një sonikator VialTweeter me fuqi 30%, me një cikël prej 10 sekondash aktiv / 10 sekondash joaktiv, të përsëritur 3 herë. Mostrat duhet të mbahen në akull gjatë përpunimit dhe cikli të përsëritet edhe dy herë nëse përpunohen ≥5 milionë qeliza. (shih Wojtkiewicz et al., 2021)
Çfarë duhet të bëj nëse kolona ime S-Trap™ bllokohet gjatë ngarkimit të mostrës?
Bllokimi i kolonës zakonisht shkaktohet nga viskoziteti i lartë i ADN-së ose nga kthjellimi i pamjaftueshëm. Për ta zgjidhur këtë, centrifugojeni plotësisht lizatin përpara pipetimit dhe sigurohuni që ADN-ja të jetë fragmentuar mekanikisht në mënyrë të mjaftueshme përmes sonikimit.
Si i ndihmon sonikimi pa kontakt rrjedhat e punës të proteomikës sasiore?
Në studimet sasiore, edhe gjurmët e kontaminimit të kryqëzuar ndërmjet mostrave mund të shtrembërojnë matjet e peptideve me bollëk të ulët. Përpunimi i shumë flakonëve në tuba të mbyllur me VialTweeter eliminon futjen e një sonde, siguron riprodhueshmëri nga një seri në tjetrën dhe ruan integritetin e mostrave për analiza krahasuese të sakta.
Çfarë rendimenti proteinik dhe thellësie të analizës MS mund të pres nga ky protokoll?
Duke filluar me 50 mg ind të zemrës së njeriut ose 5 milionë qeliza, rrjedha e punës S-Trap™ zakonisht jep peptide të mjaftueshme për 30–50 injektime LC-MS, duke identifikuar në mënyrë të qëndrueshme mbi 4 000 proteina unike për çdo analizë. (krh. Wojtkiewicz et al., 2021)
Literatura / Referencat
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
- Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
- Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.
Hielscher Ultrasonics ofron sonikatorë të fuqishëm pa kontakt për përgatitjen e mostrave dhe analizat klinike. Sonikatori për pllaka me shumë puse UIP400MTP, VialTweeter, CupHorn dhe sonikatori me rrjedhje GDmini2 i përpunojnë mostrat pa i prekur ato.