Sonikimi i mikropllakave në proteomikën shotgun – Shënim aplikimi

Proteomika shotgun varet nga përgatitja efikase dhe e riprodhueshme e mostrave për të konvertuar materialin biologjik kompleks në peptide të gatshme për LC-MS/MS. Sonikatorja e mikropllakave UIP400MTP e mbështet këtë proces duke lejuar sonikim të standardizuar dhe paralel të mostrave me vëllim të vogël, duke i ndihmuar laboratorët të përmirësojnë shpërbërjen, ekstraktimin dhe rizgjidhjen në proceset e bazuara në mikroplaka. Ky shënim aplikimi përshkruan se si UIP400MTP mund të integrohet në përgatitjen e mostrave proteomike, duke përdorur si shembull të testuar në laborator një proces të publikuar të vezikulave jashtëqelizore nga studimet PLA2G12A/Th17.

Sonikimi i mikropllakave për proteomikë shotgun më të riprodhueshme

Për studiuesit e proteomikës, përgatitja e riprodhueshme e mostrave është kritike për të dhëna cilësore LC-MS/MS. Sonikatorja e mikropllakave UIP400MTP mbështet sonikimin e standardizuar dhe paralel në proceset e bazuara në plaka dhe ato me vëllim të vogël/rrjedhje të lartë.

Ajo është veçanërisht e dobishme për laboratorët që punojnë me:

• Grupe të mëdha mostrash që kërkojnë përpunim të qëndrueshëm nëpër shumë pushe
• Material me input të kufizuar, ku humbja dhe variabiliteti i mostrave duhet minimizuar
• Mostra të pasura me lipide, si vezikulat jashtëqelizore
• Përgatitje biologjike komplekse që kërkojnë shpërbërje, ekstraktim ose rizgjidhje efikase
• Proteomikë shotgun komparative, ku riprodhueshmëria midis kushteve dhe replikave është thelbësore

Duke integruar sonikimin e mikropllakave para tretjes, studiuesit mund të përmirësojnë gatishmërinë e mostrave për:

• Ekstraktimin e proteinave dhe rizgjidhjen
• Tretjen me Tripsinë/Lys-C
• Marrjen e të dhënave Nano-LC/MS/MS
• Analizën sasiore downstream të proteomikës

Sonikimi i mikropllakave mund të përfitojë:

• Facilitetet qendrore të proteomikës
• Laboratorët e kërkimit të EV-ve
• Laboratorët e imunologjisë dhe biologjisë qelizore
• Grupet e kërkimit translacional
• Ekipet e shkencave të jetës që shkallëzojnë nga përgatitja e një mostre të vetme në procese me rrjedhje më të lartë

Përgatitja e mostrave me rrjedhje të lartë për analizën e proteomit të vezikulave jashtëqelizore

Çfarë është proteomika shotgun?

Proteomika shotgun është bërë një strategji analitike qendrore për karakterizimin e mostrave biologjike komplekse, nga lizatet e qelizave të plota dhe ekstraktet e indeve te organele të pastra, vezikula jashtëqelizore dhe specimene klinike me input të ulët. Forca e saj kryesore qëndron në lidhjen e tretjes së proteinave, kromatografisë me lëngje me rezolucion të lartë dhe spektrometrisë së masës në tandem, si dhe inferencës kompjuterike nga peptidet te proteinat. Megjithatë, cilësia e të dhënave përfundimtare të proteomit përcaktohet shumë kohë para se mostra të arrijë në spektrometrin e masës. Shpërbërja efikase e mostrës, zgjidhja e proteinave, heqja e substancave ndërhyrëse, tretja enzimatike e riprodhueshme dhe rikuperimi i fortë i peptideve janë të gjitha vendimtare për thellësinë e mbulimit dhe besueshmërinë sasiore.
Për studiuesit e proteomikës dhe laboratorët e shkencave të jetës që punojnë me mostra të kufizuara ose të çmuara, përgatitja e mostrave shpesh është pengesa.

Sfida e vezikulave jashtëqelizore në proteomikë

Vezikulat ekstraselulare (EV), për shembull, përfaqësojnë një klasë veçanërisht këruese të mostrave. Ato janë grimca nanoskalore të lidhura me membranën, të pasura me lipide, me rendiment relativisht të ulët proteinash dhe me një potencial të lartë për bartjen e lipideve, kripërave, detergjentëve, proteinave të serumit dhe komponentëve të tjerë të matriksit. Këto karakteristika mund të ndërhyjnë në efikasitetin e tretjes, performancën kromatografike, stabilitetin e elektrospray-it dhe identifikimin e peptideve. Prandaj, një rrjedhë pune përgatitore për proteomikën e EV-ve duhet të jetë mjaftueshëm e fortë për të shkatërruar strukturat e vezikulave dhe për të tretur ngarkesën e proteinave, ndërsa mbetet e pajtueshme me tretjen enzimatike dhe analizën LC-MS/MS në fazat e mëvonshme.
Në këtë kontekst, ultrasonikimi i pajtueshëm me mikroplatat ofron një qasje praktike për përpunimin e mostrave të riprodhueshme dhe të paralelizuar. Modelet e sonikatorëve të mikroplatave Hielscher UIP400MTP (400 W) dhe UIP550MTP (550 W) janë projektuar për sonikimin e mostrave në plaka me shumë pus dhe enë me vëllim të vogël, duke mbështetur rrjedha pune me throughput më të lartë se sonikatorët konvencionalë me një probe të vetme. Për laboratorët e proteomikës, ky format është i tërheqshëm sepse mund të reduktojë variabilitetin e punës manuale, të përmirësojë trajtimin paralel të mostrave të shumta dhe të integrohet më natyrshëm në linjat e përgatitjes së mostrave të bazuara në plaka.

Rrjedhë pune shembullore

Një rrjedhë e fundit e punës së proteomikës së vezikulave ekstraselulare në biologjinë e qelizave Th17 të drejtuara nga PLA2G12A ofron një shembull të dobishëm, të testuar në laborator, të mënyrës se si sonikatori i mikroplatave UIP400MTP mund të integrohet në përgatitjen e mostrave të proteomikës shotgun. Në atë seri studimesh, mostrat EV u përpunuan për analizën e proteomës duke përdorur trajtimin me metanol, sonikimin me UIP400MTP, centrifugimin, tharjen, tretjen me trypsin/Lys-C dhe nano-flow LC-MS/MS me rezolucion të lartë. Puna biologjike u raportua në vitin 2026 nga Mochizuki-Ono dhe kolegët, ku analiza e proteomikës ndihmoi në karakterizimin e mënyrës se si PLA2G12A ndryshon proteinat e ngarkesës së EV-ve në kontekstin e përgjigjeve patogjene të qelizave T.

Sonifikator i pllakave me shumë mirë UIP400MTP

Pse sonifikimi i mikroplatës?
UIP400MTP lejon sonifikim të standardizuar dhe paralel të mostrave me vëllim të vogël. Kjo është e dobishme kur riprodusueshmëria, sasia e vogël e mostrës dhe kapaciteti i shumë mostrave janë të rëndësishme.


Kontrolli i Cilësisë

• Konfirmoni hyrjen e barasvlershme me proteinën EV të njëjtë për të gjitha mostrat.
• Përdorni vendosje të rastësishme ose të balancuara të përpunimit të mostrave.
• Mbani të njëjtë vëllimin e metanolit, kohën e sonifikimit, kohën e tharjes dhe vëllimin e tretjes.
• Monitoroni rendimentin e peptidit dhe numrin total të identifikimeve të proteinave.
• Kontrolloni normën e prerjeve të humbura dhe shpërndarjen e gjatësisë së peptidit.
• Inspektoni formën e pikut kromatografik dhe riprodusueshmërinë e kohës së qëndrimit.
• Përfshini boshllëqet për të monitoruar mbartjen.
• Përdorni mostra të bashkuara QC për studime më të mëdha.
• Vlerësoni koeficientin e variacionit të replikave.
• Përdorni PCA ose metoda të ngjashme për të identifikuar efektet e grupit ose mostrat e jashtëzakonshme.

Rekomandime për Protokollet

Kur publikoni ose dokumentoni këtë punë, raportoni sasinë e hyrjes EV, formatin e pllakës, vëllimin e metanolit, amplitudën dhe kohën e sonifikimit të UIP400MTP, kushtet e centrifugimit, metodën e tharjes, tretësirën e tretjes, përqendrimin e enzimës, kohën e tretjes, kushtet e acidifikimit, platformën LC-MS/MS, modalitetin e marrjes, versionin e softuerit, bazën e të dhënave, pragun FDR, metodën e normalizimit dhe punën statistikore.
Të gjithë sonikatorët e mikropllakave Hielscher regjistrojnë automatikisht parametrat e rëndësishëm të procesit si amplituda, kohëzgjatja e sonikimit dhe temperatura me vulën e datës dhe orës si një skedar CVS në kartën SD të integruar. Protokolli i të dhënave për riprodusueshmëri dhe kontroll të cilësisë nuk ka qenë kurrë më i lehtë!

Studimi në Detaje: Proteomika Shotgun EV në Studimin PLA2G12A

Studimi PLA2G12A ofron një shembull konkret të përdorimit të UIP400MTP në një rrjedhë pune të proteomikës shotgun. Pyetja biologjike ishte se si fosfolipaza e sekretuar PLA2G12A modifikon vezikulat ekstraselulare të derivuara nga qelizat Th17 dhe në këtë mënyrë ndikon në diferencimin patogjen të qelizave T. Autorët treguan se PLA2G12A vepron mbi membranat e EV për të prodhuar lizofosfolipide, duke përfshirë 1-oleoil-lizofosfatidiletanolaminën, dhe se sinjalizimi i poshtëm i acidit lizofosfatidik nëpërmjet LPA2 kontribuon në diferencimin Th17. Përveç sinjalizimit lipidik, studimet gjithashtu ekzaminuan ngarkesën e EV, duke përfshirë përmbajtjen e ARN-së dhe proteinave, duke e bërë proteomikën shotgun një komponent të rëndësishëm të strategjisë së karakterizimit.
Në rrjedhën e punës së përgatitjes së EV, qelizat Th17 u kultivuan në medium që përmbante serum fetal bovine të varfëruar me ekzosome. Supernatantet e kulturës u centrifuguan së pari për të hequr qelizat, u filtruan nëpër një filtër 0,22 µm, u përqendruan me ultrafiltrim/ultracentrifugim, u larë, u riresuspenduan në PBS dhe u kuantifikuan me analizën e proteinave BCA. Kjo përgatitje e EV në fazën e parë siguroi që një sasi e përcaktuar e materialit EV, e barabartë me proteinën, të mund të dërgohej në rrjedhën e punës së proteomikës.
Për analizën proteomike shotgun, autorët përdorën mostra EV që korrespondonin me 5 µg ekuivalentë proteinikë. Këto mostra u thanë në tuba PCR dhe u shtuan 25 µL metanol. Mostra u sonifikuan më pas për 3 minuta duke përdorur sonifikatorin e mikropllakës UIP400MTP. Pas sonifikimit, mostrat u centrifuguan në 4°C për 20 minuta në 19 000 × g. Pas heqjes së 20 µL supernatant, mostrat u centrifuguan deri në tharje. Proteinat u tretën më pas me sonifikim në 4 µL tretësirë tripsinë/Lys-C në 100 ng/µL në 50 mM bikarbonat amoniaku. Digjestia u krye për 2 orë në 37°C me tundje në 300 rpm. Digjesta u acidifikua me 1 µL acid trifluoroacetik 1,25% dhe u dërgua për spektrometri tandem me rezolucion të lartë LC-nano-flow.
Kjo rrjedhë pune thekson disa parime të dobishme për proteomikën EV me input të ulët. Së pari, inputi u normalizua nga ekuivalenti proteinik, gjë që është e rëndësishme kur krahasohen EV nga gjenotipe ose trajtime të ndryshme. Së dyti, metanoli u përdor para sonifikimit, duke mbështetur shpërbërjen dhe ekstraktimin ndërsa shmang sistemet detergjente që mund të komplikojnë LC-MS/MS. Së treti, hapi i sonifikimit ishte i shkurtër dhe i standardizuar, gjë që është e pajtueshme me përpunimin paralel të mostrave. Së katërti, digjestia me tripsinë/Lys-C u krye në një vëllim shumë të vogël, duke reduktuar hollimin dhe duke mbështetur rikuperimin e peptideve me input të ulët. Së fundi, tranzicioni i drejtpërdrejtë nga digjestia në acidifikim dhe LC-MS/MS minimizoi hapat e panevojshëm të manipulimit.
Metoda LC-MS/MS në fazën e pasme përdori ndarjen nano-flow me fazë të kundërt të lidhur me një spektrometër mase Orbitrap Q-Exactive HF. Mostrat u kapën në një prekolumnë C18, më pas u ndanë në një kolonë analitike me diametër të brendshëm 50 µm në 200 nL/min dhe 40°C. Gradienti u zhvillua nga tretësi organik i ulët në 35% tretës B gjatë 60 minutave, i ndjekur nga larja me organik të lartë dhe riekuilibrimi. Marrja e të dhënave MS u krye në modalitetin e jonit pozitiv duke përdorur marrjen e pavarur nga të dhënat me disociim me përplasje me energji më të lartë. Skedarët e papërpunuar DIA u analizuan duke përdorur DIA-NN 1.8 me një bibliotekë spektrale të parashikuar in silico.