Sonikimi i mikropllakës në proteomikën Shotgun – Shënim aplikimi

Proteomika e pushkës varet nga përgatitja efikase dhe e riprodhueshme e mostrës për të kthyer materialin biologjik kompleks në peptide të gatshme LC-MS/MS. Sonicator UIP400MTP mikropllaka mbështet këtë proces duke mundësuar tingëllimin e standardizuar, paralel të mostrave me vëllim të vogël, duke ndihmuar laboratorët të përmirësojnë ndërprerjen, nxjerrjen dhe risolubilizimin në rrjedhat e punës të bazuara në mikropllaka. Ky shënim aplikimi përshkruan se si UIP400MTP mund të integrohet në përgatitjen e mostrës proteomike, duke përdorur një rrjedhë pune të publikuar ekstraqelizore nga studimet PLA2G12A/Th17 si një shembull i testuar në laborator.

Microplate Sonication for More Reproducible Shotgun Proteomics

Për studiuesit e proteomikës, përgatitja e mostrave e riprodhueshme është kritike për të dhëna të cilësisë së lartë LC-MS/MS. Sonikatori UIP400MTP për mikroplakë mbështet sonikimin e standardizuar dhe paralel në rrjedhat e punës bazuar në plakat dhe me vëllim të vogël/rritje të lartë.

Është veçanërisht i dobishëm për laboratorët që punojnë me:

• Grumbuj të mëdhenj mostrash që kërkojnë përpunim të qëndrueshëm në shumë vrima
• Materiale me input të kufizuar, ku humbja dhe variabiliteti i mostrës duhet të minimizohet
• Mostra të pasura me lipide, të tilla si vesikulat ekstracelulare
• Përgatitje komplekse biologjike që kërkojnë shpërbërje, nxjerrje ose riresolubilizim efikas
• Proteomikë krahasuese shotgun, ku riprodhueshmëria ndërmjet kushteve dhe kopjeve është e domosdoshme

Duke integruar sonikimin e mikroplakës para tretjes, studiuesit mund të përmirësojnë gatishmërinë e mostrës për:

• Nxjerrjen dhe riresolubilizimin e proteinave
• Përthyerja me Trypsin/Lys-C
• Aqizimi Nano-LC/MS/MS
• Analiza kvantitative downstream e proteomikës

 

Zgjeroni përgatitjen e mostrave të proteomikës me besim!
Mësoni se si sonikimi në mikrotabelë ndihmon të zvogëlohet variacioni manual, të përmirësohet çrregullimi i mostrës dhe të përgatiten mostra komplekse biologjike për analizë të besueshme LC-MS/MS.

Kërkesë informacioni


Adresa e emailit (kërkohet)


Produkti ose zona e interesit



Jam dakord me Politikën e Privatësisë









Kërkoni informacion

Sonikimi në mikrotabelë mund të përfitojë:

• Pajisjet qendrore të proteomikës
• Laboratorët e kërkimit EV
• Laboratorët e imunologjisë dhe biologjisë së qelizave
• Grupet e kërkimit translacional
• Ekipet e shkencave të jetës që kalojnë nga përgatitja e një mostre deri te rrjedhat e punës me kapacitet të lartë

Përgatitja e mostrës me performancë të lartë për analizën e proteomës së fshikëzave jashtëqelizore

Çfarë është proteomika e pushkës?

Shotgun proteomics has become a central analytical strategy for characterizing complex biological samples, from whole-cell lysates and tissue extracts to purified organelles, extracellular vesicles, and low-input clinical specimens. Its core strength lies in the coupling of protein digestion, high-resolution liquid chromatography-tandem mass spectrometry, and computational peptide-to-protein inference. However, the quality of the final proteome dataset is determined long before the sample reaches the mass spectrometer. Efficient sample disruption, protein solubilization, removal of interfering substances, reproducible enzymatic digestion, and robust peptide recovery are all decisive for depth of coverage and quantitative reliability.
Për studiuesit e proteomikës dhe laboratorët e shkencave të jetës që punojnë me mostra të kufizuara ose të çmuara, përgatitja e mostrës është shpesh pengesa.

Sfida e fshikëzave jashtëqelizore në proteomikë

Fshikëzat jashtëqelizore (EV), për shembull, përfaqësojnë një klasë mostre veçanërisht kërkuese. Ato janë grimca të lidhura me membranë, të pasura me lipide, në shkallë nano me rendiment relativisht të ulët proteinash dhe një potencial të lartë për bartjen e lipideve, kripërave, detergjentëve, proteinave të serumit dhe përbërësve të tjerë të matricës. Këto veçori mund të ndërhyjnë në efikasitetin e tretjes, performancën kromatografike, stabilitetin e elektrospërkatjes dhe identifikimin e peptideve. Prandaj, një rrjedhë pune përgatitore për proteomikën EV duhet të jetë mjaft e fortë për të prishur strukturat e fshikëzave dhe për të zgjidhur ngarkesën e proteinave, duke mbetur e pajtueshme me tretjen enzimatike në rrjedhën e poshtme dhe analizën LC-MS/MS.
Në këtë kontekst, ultrasonikimi i përshtatshëm për mikroplaka ofron një qasje praktike për përpunimin e mostrave në mënyrë të riprodhueshme dhe të paralelizuar. Modelet e sonikatorëve për mikroplaka të Hielscher UIP400MTP (400 W) dhe UIP550MTP (550 W) janë dizajnuar për sonikimin e mostrave në pjatat me shumë vrima dhe enët me volum të vogël, duke mbështetur procese pune me kapacitet më të lartë sesa sonikatorët konvencionalë me sondë të vetme. Për laboratorët e proteomikës, ky format është tërheqës sepse mund të reduktojë variabilitetin gjatë punës manuale, të përmirësojë trajtimin paralel të mostrave të shumta dhe të integrohet më natyrshëm në linjat e përgatitjes së mostrave të bazuara në pjatë.

Rrjedha Shembullore e Punës

Një rrjedhë pune e fundit e proteomikës së fshikëzave jashtëqelizore në biologjinë e qelizave Th17 të drejtuara nga PLA2G12A ofron një shembull të dobishëm, të testuar në laborator se si UIP400MTP i sonikatorit të mikropllakave mund të përfshihet në përgatitjen e mostrës së proteomikës së pushkës. Në atë seri studimi, mostrat EV u përpunuan për analizën e proteomës duke përdorur trajtimin e metanolit, UIP400MTP tingullinjtë, centrifugimin, tharjen, tretjen e tripsinës / Lys-C dhe MS tandem me rezolucion të lartë LC me nano-rrjedhë. E njëjta punë biologjike u raportua për herë të parë si një paraprintim bioRxiv dhe më pas u botua në Cell Reports, ku analiza proteomike ndihmoi në karakterizimin se si PLA2G12A ndryshon proteinat e ngarkesës EV në kontekstin e përgjigjeve patogjene të qelizave T.

Sonicator me shumë pllakë UIP400MTP

Pse tingëllimi i mikropllakave?
UIP400MTP lejon sonikimin e standardizuar dhe paralel të mostrave të vëllimit të vogël. Kjo është e dobishme kur riprodhueshmëria, inputi i ulët i mostrës dhe kapaciteti multi-mosht janë të rëndësishme.

Lista e Kontrollit të Cilësisë

• Konfirmoni inputin e proteinave ekuivalente të EV-së të barabartë në të gjitha mostrat.
• Përdorni renditje mostrash të rastësishme ose të balancuara gjatë përpunimit.
• Mbani të njëjtën sasi metanoli, kohë sonikimi, kohë tharjeje dhe vëllim tretjeje.
• Monitoroni prodhimin e peptideve dhe identifikimet totale të proteinave.
• Kontrolloni normën e prerjeve të humbura dhe shpërndarjen e gjatësisë së peptideve.
• Inspektoni formën e majës kromatografike dhe ripërsëritshmërinë e kohës së ruajtjes.
• Përfshini mostra të zbrazëta për të monitoruar kalimin e mbetjeve.
• Përdorni mostra të QC të përbashkët për studime më të mëdha.
• Vlerësoni koeficientin e variacionit të ngjashmërisë.
• Përdorni PCA ose metoda të ngjashme për të identifikuar efektet e grupimit ose mostrat e jashtme.

Rekomandimet për protokollimin

Kur publikoni ose dokumentoni këtë rrjedhë pune, raportoni sasinë e inputit EV, formatin e pllakës, vëllimin e metanolës, amplitudën dhe kohën e sonikimit të UIP400MTP, kushtet e centrifugimit, metodën e tharjes, tamponin e tretjes, përqendrimin e enzimës, kohën e tretjes, kushtet e acidifikimit, platformën LC-MS/MS, modalitetin e akvizicionit, versionin e softuerit, bazën e të dhënave, pragun FDR, metodën e normalizimit dhe rrjedhën statistikore.
Të gjithë sonikatorët e mikropllakave Hielscher regjistrojnë automatikisht parametrat e rëndësishëm të procesit si amplituda, koha e sonikimit dhe temperatura me datë dhe kohë si një skedar CSV në kartën SD të integruar. Protokollimi i të dhënave për riprodhueshmëri dhe kontrollin e cilësisë nuk ka qenë kurrë më i lehtë!

Studimi në detaje: EV Shotgun Proteomics në PLA2G12A studim

The PLA2G12A study provides a concrete example of UIP400MTP use in a shotgun proteomics workflow. The biological question was how the secreted phospholipase PLA2G12A modifies Th17-cell-derived extracellular vesicles and thereby influences pathogenic T-cell differentiation. The authors showed that PLA2G12A acts on EV membranes to produce lysophospholipids, including 1-oleoyl-lysophosphatidylethanolamine, and that downstream lysophosphatidic acid signaling via LPA2 contributes to Th17 differentiation. Beyond lipid signaling, the studies also examined EV cargo, including RNA and protein content, making shotgun proteomics an important component of the characterization strategy.
In the EV preparation workflow, Th17 cells were cultured in medium containing exosome-depleted fetal bovine serum. Culture supernatants were first centrifuged to remove cells, filtered through a 0.22 µm filter, concentrated by ultrafiltration/ultracentrifugation, washed, resuspended in PBS, and quantified by BCA protein assay. This upstream EV preparation ensured that a defined protein-equivalent amount of EV material could be carried into the proteomics workflow.
Për analizën proteomike të pushkës, autorët përdorën mostra EV që korrespondojnë me ekuivalentët e proteinave 5 μg. Këto mostra u thanë në tuba PCR dhe u shtua 25 μL metanol. Mostrat më pas u tingëlluan për 3 minuta duke përdorur sonikatorin UIP400MTP mikropllakave. Pas sonikimit, mostrat u centrifuguan në 4°C për 20 minuta në 19,000 × g. Pas heqjes së supernatantit 20 μL, mostrat u centrifuguan në thatësi. Proteinat më pas u tretën me sonikacion në tretësirë 4 μL tripsin/Lys-C në 100 ng/μL në 50 mM bikarbonat amoniumi. Tretja u krye për 2 orë në 37°C me dridhje në 300 rpm. Tretja u acidifikua me 1 μL acid trifluoroacetik 1.25% dhe iu nënshtrua spektrometrisë së masës tandem me rezolucion të lartë LC me rrjedhë nano-rrjedhëse.
This workflow highlights several useful principles for low-input EV proteomics. First, the input was normalized by protein equivalent, which is important when comparing EVs from different genotypes or treatments. Second, methanol was used before sonication, supporting disruption and extraction while avoiding detergent systems that may complicate LC-MS/MS. Third, the sonication step was short and standardized, which is compatible with parallel sample processing. Fourth, trypsin/Lys-C digestion was performed in a very small volume, reducing dilution and supporting low-input peptide recovery. Finally, direct transition from digestion to acidification and LC-MS/MS minimized unnecessary handling steps.
The downstream LC-MS/MS method used nano-flow reversed-phase separation coupled to a Q-Exactive HF Orbitrap mass spectrometer. Samples were trapped on a C18 pre-column, then separated on a 50 µm inner-diameter analytical column at 200 nL/min and 40°C. The gradient ran from low organic solvent to 35% solvent B over 60 minutes, followed by high-organic washing and re-equilibration. MS acquisition was performed in positive-ion mode using data-independent acquisition with higher-energy collisional dissociation. DIA raw files were analyzed using DIA-NN 1.8 with an in silico predicted spectral library.