Prodhimi me ultratinguj i beta-glukaneve të skizofilanit me pastërti të lartë

Skizofilani është një β-glukan kërpudhor me veti imunomoduluese. Për efekte mjekësore shumë aktive, skizofilani duhet të ketë peshë molekulare të ulët, që të shfaqë biodisponueshmëri të përmirësuar. Është vërtetuar se trajtimi me ultratinguj e ul peshën molekulare të skizofilanit. Si metodë e besueshme dhe efikase, sonikimi mund të zbatohet lehtësisht për prodhimin e skizofilanit me peshë molekulare të ulët.

Kërpudhat Schizophyllum dhe ekstraktimi i beta-glukanit me ultratinguj

Llojet e kërpudhës Schizophyllum rriten në natyrë mbi pemë në kalbëzim pas stinëve me shira. Trupat frutorë mblidhen gjatë stinës së thatë që pason. Llojet e Schizophyllum janë të pasura me përbërje biokimike si glukanet dhe prandaj konsumohen veçanërisht në vendet tropikale si ushqim dhe ilaç. Për shkak të vetive të saj imunomoduluese, antifungale, antineoplastike dhe antivirale, Schizophyllum commune, e njohur edhe si kërpudha me lamela të çara, ka tërhequr interesin e kompanive bioteknologjike dhe farmaceutike.
Polisakaridi skizofilan, i njohur edhe si sizofiran, sonifilan ose sizofilan, është β-glukani kryesor që gjendet te kërpudhat Schizophyllum, të cilat ofrojnë β-glukanin bioaktiv shumë efikas skizofilan.
Kërpudhat Schizophyllum commune rriten në natyrë mbi pemë; miceli mund të kultivohet gjithashtu në lëng fermentimi. Për përdorime farmaceutike dhe kozmetike, skizofilani me peshë molekulare të ulët është shumë më efikas sesa skizofilani me peshë molekulare të lartë. Kjo vjen nga fakti se skizofilani me peshë molekulare të ulët shfaq biodisponueshmëri dhe shkallë përthithjeje dukshëm më të mira. Për më tepër, skizofilani me peshë molekulare të lartë është shpesh problematik në përdorim, pasi shkakton viskozitet të lartë të tretësirave të tij ujore.
Zvogëlimi i përmasave me ultratinguj është një teknikë shumë efikase dhe e besueshme për uljen e peshës molekulare të skizofilanit, duke rritur kështu cilësinë e molekulës së β-glukanit.

Protokolli për prodhimin e skizofilanit me peshë molekulare të ulët

Meqë skizofilani me peshë molekulare të ulët shfaq biodisponueshmëri dhe veti përdorimi jashtëzakonisht më të mira, ekipi kërkimor i Smirnou hetoi trajtimin me ultratinguj për çarjen dhe zvogëlimin e përmasave të molekulës së β-glukanit skizofilan.

Trajtimi i skizofilanit me ultratinguj

β-1.3(1.6)-glukani skizofilan (SPG) u prodhua nëpërmjet kultivimit të zhytur të kërpudhës S. commune në bioreaktor, duke përdorur saharozën si substrat.
Pas përfundimit të kultivimit, lëngu i kulturës u hollua me ujë të demineralizuar deri në një përqendrim skizofilani prej 2 g/L dhe u trajtua me ultratinguj duke përdorur procesorin me ultratinguj UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Gjermani) në regjim riqarkullimi, me parametrat dhe kushtet e mëposhtme: prurja e mjedisit 50 mL/s, frekuenca 20 kHz, fuqia në dalje 2000 W, sonotroda e tipit BS2d22, përforcuesi i amplitudës i tipit B2-1.4 dhe amplituda 100%. Temperatura e lëngut të kulturës në fillim të sonikimit ishte 25°C. Lëngu i kulturës i trajtuar me ultratinguj (energjia specifike e dhënë 100 Ws/mL) u filtrua përmes një filtri të thellësisë Seitz HS800 nën presion 1,5 bar në 40°C. Skizofilani i trajtuar me ultratinguj (uSPG), për karakterizim kimik, u precipitua nga filtrati me një sasi trefish të alkoolit izopropilik në temperaturën e laboratorit dhe u tha në 60°C për 12h. Tretësirat e uSPG-së për studime imunologjike u përgatitën si më poshtë: (1) filtrati i lëngut të kulturës të trajtuar me ultratinguj iu nënshtrua diafiltrimit përmes një kasete PES Pall Centramate të serisë T prej 0,1m2 (prag ndarjeje 100 kDa) në 0,8 bar dhe diafiltrimi vazhdoi derisa përçueshmëria e retentatit arriti 20 μS/cm; (2) tretësira u përqendrua me diafiltrim deri në një përqendrim uSPG-je prej 1 g/L dhe u sterilizua në autoklavë në 120°C/20 min. uSPG-ja e denatyruar u përgatit në mënyrë të ngjashme, me ndryshimin se filtratit të lëngut të kulturës iu shtua NaOH në përqendrim 0,2 M dhe tretësira e alkalizuar u inkubua për 30 min në temperaturën e laboratorit përpara diafiltrimit.

Metodat analitike

Rendimenti i micelit u vlerësua me metodë gravimetrike: lëngu i kulturës u hollua me ujë në raportin 1:4, u centrifugua në 10 000 × g në 25°C për 20 min, precipitati u la me një sasi trefishe uji, u tha në 60°C dhe u peshua. Skizofilani u precipitua nga supernatanti me një sasi trefishe alkooli izopropilik, u tha në 60°C për 24h dhe rendimenti i tij u përcaktua me metodë gravimetrike. pO2 në lëngun e kulturës u mat me sondën optike Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Zvicër).
Viskoziteti dinamik i lëngut të kulturës u mat me HAAKE Visco Tester 6L me boshte 1L dhe 2L në 4°C dhe me shpejtësi rrotullimi prej 30 rpm. Shpejtësia e filtrimit u llogarit nga koha e filtrimit të 500 mL lëngu të kulturës përmes një filtri në thellësi Seitz HS800 (Pall, SHBA) me përmasa 200 × 200 mm, në presion 1,5 bar dhe në 40°C.
Pesha molekulare e uSPG u mat me SEC-MALLS në sistemin HPLC Alliance (Waters) me kolona PL aquagel OH60 dhe PL aquagel OH40 të lidhura në seri, dhe detektori miniDAWN TREOS (Wyatt) u përqendrua me diafiltrim deri në përqendrimin e uSPG prej 1 g/L dhe u sterilizua në autoklavë në 120°C/20 min. uSPG i denatyruar u përgatit në mënyrë të ngjashme, me përjashtimin që në filtratin e lëngut të kulturës u shtua NaOH në përqendrim 0,2 M dhe tretësira e alkalizuar u inkubua për 30 min në temperaturën e laboratorit përpara diafiltrimit.

Rezultatet:
Trajtimi me ultratinguj u zbatua drejtpërdrejt në lëngun e kulturës 144-h të S. commune me micel, për të lehtësuar përpunimin pasues të SPG.
 
Karakteristikat e skizofilanit të trajtuar me ultratinguj: Skizofilani i trajtuar me ultratinguj (uSPG) u precipitua nga filtrati i lëngut të kulturës me alkool dhe u karakterizua. SEC-MALLS e vlerësoi Mw të uSPG në rreth 1 MDa. Pesha molekulare mesatare e skizofilanit nga fermentimi në mjedis të lëngshëm është afërsisht 5 MDa, ndërsa gjatë kultivimit në gjendje të ngurtë mund të arrijë deri në 10 MDa. Duke krahasuar peshën molekulare të skizofilanit të trajtuar me ultratinguj me peshat molekulare të skizofilanit natyror të patrajtuar, mund të vërehet një peshë molekulare 5 deri në 10 herë më e ulët si pasojë e trajtimit me ultratinguj.
Polisakaridi uSPG i trajtuar me ultratinguj përmbante 0,7%w/w proteina dhe 1,0%w/w mbetje pas djegies. Hidrolizati i uSPG përbëhej nga më shumë se 99% glukozë. Rezultatet analitike tregojnë se trajtimi me ultratinguj e këput zinxhirin kryesor të β-glukanit në mënyrë të rastësishme, ndërsa degëzimet anësore mbeten të paprekura, duke zvogëluar kështu madhësinë dhe peshën molekulare të skizofilanit. Studimet imunologjike mbi uSPG praktikisht pa proteina dhe endotoksina treguan se skizofilani me Mw të ulët, i trajtuar me ultratinguj, ka aktivitet të theksuar imunomodulues.

 
Viskozitet i zvogëluar: Trajtimi me ultratinguj solli një ulje të konsiderueshme të viskozitetit të lëngut të kulturës. Gjatë trajtimit me ultratinguj, viskoziteti i lëngut të kulturës ndryshoi në mënyrë jolineare: ulja e viskozitetit ishte e shpejtë në fillim të trajtimit me ultratinguj, por më vonë u ngadalësua. Energjia specifike e dhënë prej 100 Ws/mL ishte e mjaftueshme për ta ulur viskozitetin e lëngut të kulturës pothuajse 7 herë.

Filtrim i përmirësuar: Lëngu i kulturës i trajtuar me ultratinguj kaloi përmes filtrit më shpejt sesa lëngu i kulturës i patrajtuar (energji specifike e dhënë 0 Ws/mL) me SPG me peshë të lartë molekulare. Përveç kësaj, trajtimi me ultratinguj uli ndjeshëm humbjen e produktit gjatë filtrimit. Filtrati i lëngut të kulturës të patrajtuar me SPG me peshë të lartë molekulare (energji specifike e dhënë 0 Ws/mL) përmbante 0,3 ± 0,07 g/L SPG, ndërsa përqendrimi i SPG para filtrimit në thellësi ishte 2 g/L. Në të kundërt, filtrati i lëngut të kulturës të trajtuar me ultratinguj me 100 Ws/mL përmbante SPG në përqendrim 2,2 ± 0,2 g/L, çka përkon me një humbje pothuajse zero të produktit.

Përfundim: Në përfundimin e tij, ekipi kërkimor përmbledh se përpunimi me ultratinguj është një teknologji efikase për prodhimin e skizofilanit me peshë të ulët molekulare, i cili më pas mund të përdoret në kozmetikë dhe mjekësi. Trajtimi me ultratinguj, kur zbatohet në të gjithë lëngun e kulturës që përmban micel, sjell disa përparësi në prodhimin e skizofilanit. Ai zvogëlon humbjet e produktit gjatë përpunimit pasues dhe mundëson prodhimin e polisakaridit me shkallë të lartë pastërtie falë përdorimit efikas të ultrafiltrimit.
Gjithashtu, studiuesit zbuluan se përpunimi i skizofilanit me ultratinguj mund të zmadhohet lehtësisht në shkallë. Një njësi e dezintegruesit me ultratinguj UIP2000hdT të impiantit pilot përpunoi 1 litër lëng kulture në 110 s në modalitet rrjedhjeje. Produktiviteti i sistemit mund të rritet lehtësisht duke lidhur në seri njësi shtesë me ultratinguj.

 
Lexoni më shumë rreth zmadhimit të thjeshtë të shkallës së ekstraktimit të kërpudhave!
 

Pajisje me ultratinguj me performancë të lartë për përpunimin e glukaneve të kërpudhave

Fragmentimi i polisakarideve si glukanet, si dhe i përbërjeve të tjera bioaktive si kitina dhe kitozani, mund të kryhet me besueshmëri me pajisjet me ultratinguj me performancë të lartë të Hielscher. Pajisjet tona me ultratinguj mund të japin amplituda të larta, ofrojnë kontroll të saktë mbi parametrat e procesit dhe mund të punojnë 24/7 nën ngarkesë të rëndë dhe në mjedise kërkuese. Gama e pajisjeve të Hielscher Ultrasonics i përmbush këto kërkesa me besueshmëri. Përveç performancës së jashtëzakonshme të ultratingujve, pajisjet me ultratinguj të Hielscher kanë efikasitet të lartë energjetik, çka përbën një përparësi të konsiderueshme ekonomike – veçanërisht kur përdoren në prodhim tregtar në shkallë të gjerë.
Pajisjet me ultratinguj të Hielscher janë sisteme me performancë të lartë që mund të pajisen me aksesorë si sonotroda, përforcues, reaktorë ose qeliza rrjedhjeje, për t’iu përshtatur në mënyrë optimale nevojave të procesit tuaj.
Ekrani dixhital me ngjyra, mundësia për të paracaktuar ciklet e trajtimit me ultratinguj, regjistrimi automatik i të dhënave në një kartë SD të integruar, kontrolli në distancë përmes shfletuesit dhe shumë funksione të tjera sigurojnë nivelin më të lartë të kontrollit të procesit dhe të lehtësisë së përdorimit. Të ndërthurura me qëndrueshmërinë dhe kapacitetin për të përballuar ngarkesa të rënda, këto veçori i bëjnë sistemet me ultratinguj të Hielscher një mjet pune të besueshëm në prodhimin tuaj.
Ulja e peshës molekulare të β-glukaneve si skizofilani kërkon ultratinguj të fuqishëm për të arritur zbërthimin e synuar dhe një produkt përfundimtar skizofilani me cilësi të lartë, i cili mund të përdoret për zbatime farmaceutike.
 
Gjeni këtu më shumë informacion rreth ekstraktimit me ultratinguj të beta-glukaneve nga kërpudhat, përfshirë udhëzime hap pas hapi!
 
Tabela më poshtë jep një ide për kapacitetin e përafërt të përpunimit të pajisjeve tona me ultratinguj: