Protokolli që përdor Sonikatorët Hielscher me Shumë-Sampje në Analizën e Biofilmave dhe Proteomikës

Përdorimi i sonikatorëve me shumë-sampje, si Sonikatorin me Shumë-Tuba VialTweeter dhe Sonikatorin me Mikroplate UIP400MTP, racionalizon proceset e laboratorit për aplikacione me kapacitet të lartë. Të dyja pajisjet lejojnë përpunim ultrasonik të saktë dhe uniform nëpër shumë sampje, duke minimizuar variabilitetin dhe duke përmirësuar riprodusueshmërinë. Kjo është veçanërisht e dobishme në eksperimente që kërkojnë lizë të qëndrueshme të sampjes, shkëputje biofilmash, ekstraktim proteinash ose tretje proteolitike, ku metodat manuale ose me një sampje janë më pak efikase dhe të prirura ndaj mospërputhjeve.

Racionalizimi i Proceseve me Sonikatorë me Shumë-Sampje

UIP400MTP, për shembull, lejon trajtimin ultrasonik simultan të pushtave të mikroplateve, duke siguruar shkëputje uniforme të biofilmave ose materialit qelizor. Ndërkohë, VialTweeter ofron lizë dhe homogjenizim të saktë të shumë sampjeve në tuba pa kontaminim të kryqëzuar. Këta sonikatorë zvogëlojnë ndjeshëm kohët e përpunimit, përmirësojnë riprodusueshmërinë eksperimentale dhe ruajnë integritetin e lartë të sampjes, duke i bërë ata mjete të domosdoshme në kërkimet e mikrobiologjisë, proteomikës dhe biologjisë molekulare.
Më poshtë është një protokolli i detajuar që ilustron përdorimin e modeleve të sonikatorëve Hielscher me shumë-sampje, Sonikatorit me Shumë-Tuba VialTweeter dhe Sonikatorit me Mikroplate UIP400MTP, në një studim që përfshin formimin e biofilmave E. coli dhe analizën proteomike pasuese.

Protokolli: Formimi i Biofilmave, Shkëputja dhe Analiza Proteomike duke përdorur Sonikatorët Hielscher me Shumë-Sampje

1. Përgatitja e Kulturës Bakteriale

• Kultivoji bakteret E. coli (stami W3110) në 30°C, një temperaturë e favorshme për formimin e biofilmave E. coli, në medium me lëng triptoni (TB) që përmban:
  – 10 g/L tripton
  – 5 g/L NaCl
• Shto antibiotikë siç nevojitet për të siguruar ruajtjen e plazmidit.
• Për studimet e mikroskopisë dhe aktivitetit të promotorëve, përdor stamin W3110 E. coli me një reporter GFP të përforcuar gjenomik (eGFP) nën kontrollin e promotorit rplL.
• Përdor plazmide reporter GFP për promotorë të ndryshëm (p.sh., csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) për të matur aktivitetet e promotorëve.

2. Kultivimi dhe Shkëputja e Biofilmave

• Hidh 1,5 mL kulturë bakteriale të holluar për pusht në një plate me 12 pushte (Plate me 12 pushte CellStar, Greiner Bio-One).
• Inkubo për të lejuar formimin e biofilmave.
• Hiq me kujdes kulturën planktonike (jo-adherente).

– Laji çdo pusht me 500 µL PBS.
– Shkëput qelizat e lidhura duke sonikuar plate me 12 pushte në sonikatorin me mikroplate UIP400MTP. UIP400MTP siguron shkëputje uniforme duke dhënë energji ultrasonike konsistente në të gjitha pushtat.
– Parametrat e sonikimit: 60% amplitudë, mode cikli: 60 sek ON / 30 sek OFF.

3. Korrja e Qelizave dhe Lizimi

• Centrifugo qelizat e biofilmave të shkëputura në 4 500 g për 5 minuta.
• Laji qelizat e sedimentuara me PBS.
• Riresuspendo qelizat në 100 µL natrium lauroil sarkozinat 2% (SLS) dhe inkubo në 95°C për 15 minuta.
• Soniko duke përdorur Sonikatorin me Shumë-Tuba VialTweeter për të siguruar lizë të plotë qelizore.
  – Parametrat e sonikimit: 100% amplitudë, 50 s ON / 10 s OFF për 10 min kohë totale veprimi; mbaj sampjet në akull.

4. Reduktimi dhe Alkilimi

• Shto 5 mM Tris(2-karboksietil)fosfinë (TCEP) për të reduktuar lidhjet disulfide dhe inkubo në 95°C për 15 minuta.
• Alkilo proteinat me 10 mM jodoacetamid për 30 minuta në 25°C.

5. Kuantifikimi dhe Tretja e Proteinave

• Centrifugo lizatet për të hequr rrënojat.
• Kuantifiko përmbajtjen totale të proteinave duke përdorur Kitin e Testit të Proteinës Pierce BCA.
• Tret 50 µg proteinë totale me 1 µg tripsinë në një tretësirë që përmban 2% SLS dhe 100 mM bikarbonat amoni.
• Inkubo reaksionin e tretjes gjatë natës në 30°C.

6. Pastrimi i Peptideve

• Precipito SLS duke shtuar acid trifluoroacetik 1,5% (TFA), pastaj centrifugo.
• Pastro peptidet duke përdorur kolona mikro-spin C18.
• Thaj peptidet e pastra dhe riresuspendo në TFA 0,1%.

7. Kromatografi e Lëngët-Spektrometri e Masës (LC-MS/MS)

• Analizo peptidet në një spektrometër mase Q-Exactive Plus të lidhur me një sistem nano Ultimate 3000 RSLC.
• Ndaj peptidet duke përdorur një kolonë HPLC me fazë të kundërt (75 µm × 42 cm) të mbushur me rrëshirë C18 (2,4 µm).
• Apliko një gradient nga 2% në 35% tretës B (acetonitril me acid formik 0,15%) gjatë 140 minutave.
• Merr të dhëna duke përdorur skanime MS me rezolucion të lartë të ndjekura nga skanime tandem MS/MS të 10 joneve më intensive.

8. Analiza e Të Dhënave

• Përpuno të dhënat e pastra LC-MS duke përdorur softuerin Progenesis.
• Eksporto skedarët .mgf dhe analizo ato me MASCOT.
• Kryej kuantifikimin e peptideve duke përdorur SafeQuant për kontrollin e cilësisë dhe rregullimin e zbulimit të rremë.
• Kryej të gjitha eksperimentet në dyfishime ose trefishime për të siguruar riprodusueshmëri.

Sonikatorë me Shumë-Sampje për Përgatitjen e Sampjeve me Kapacitet të Lartë

Modelet e sonikatorëve me shumë-sampje VialTweeter dhe UIP400MTP përmirësojnë ndjeshëm saktësinë dhe efikasitetin e proceseve eksperimentale, veçanërisht në kërkimet e biofilmave dhe proteomikën. Aftësia e tyre për të përpunuar shumë sampje në mënyrë uniforme siguron kapacitet me kapacitet të lartë pa komprometuar cilësinë e të dhënave. Këto përfitime, të kombinuara me proceset e racionalizuara të përshkruara më lart, i bëjnë sonikatorët Hielscher me shumë-sampje mjete thelbësore për kërkimet biologjike moderne.

Dizajn, Prodhim dhe Konsulencë – Cilësi e Bërë në Gjermani

Ultrasonikatorët Hielscher janë të njohur për standardet e tyre më të larta të cilësisë dhe dizajnit. Qëndrueshmëria dhe operimi i lehtë lejojnë integrimin e qetë të ultrasonikatorëve tanë në impiante industriale. Kushtet e vështira dhe ambientet kërkesëuese trajtohen lehtësisht nga ultrasonikatorët Hielscher.

Hielscher Ultrasonics është një kompani e certifikuar ISO dhe i jep rëndësi të veçantë ultrasonikatorëve me performancë të lartë që karakterizohen nga teknologji e avancuar dhe lehtësi përdorimi. Natyrisht, ultrasonikatorët Hielscher janë në përputhje me CE dhe plotësojnë kërkesat e UL, CSA dhe RoHs.