Protokolli duke përdorur Hielscher Sonicators Multi-Sample në Biofilm dhe Analizë Proteomike

Përdorimi i sonikatorëve me shumë mostra, të tilla si VialTweeter Multi-Tube Sonicator dhe UIP400MTP Microplate Sonicator, thjeshton flukset e punës laboratorike për aplikacionet me performancë të lartë. Të dyja pajisjet lejojnë përpunim të saktë dhe uniform tejzanor nëpër mostra të shumta, duke minimizuar ndryshueshmërinë dhe duke rritur riprodhueshmërinë. Kjo është veçanërisht e dobishme në eksperimentet që kërkojnë lizën e qëndrueshme të mostrës, shkëputjen e biofilmit, nxjerrjen e proteinave ose tretjen proteolitike, ku metodat manuale ose me një mostër janë më pak efikase dhe të prirura për mospërputhje.

Drejtoni rrjedhat e punës me Sonicators me shumë mostra

UIP400MTP, për shembull, mundëson trajtimin e njëkohshëm me ultratinguj të puseve të mikropllakës, duke siguruar shkëputje uniforme të biofilmave ose materialit qelizor. Ndërkohë, VialTweeter ofron lizë dhe homogjenizim të saktë të mostrave të shumta të tubave pa ndotje të kryqëzuar. Këta sonikatorë reduktojnë ndjeshëm kohën e përpunimit, përmirësojnë riprodhueshmërinë eksperimentale dhe mbajnë integritet të lartë të mostrës, duke i bërë ato mjete të domosdoshme në mikrobiologjinë, proteomikën dhe kërkimin e biologjisë molekulare.
Më poshtë është një protokoll i detajuar që ilustron përdorimin e modeleve të sonikatorëve me shumë mostra Hielscher, VialTweeter Multi-Tube Sonicator dhe Microplate Sonicator UIP400MTP, në një studim që përfshin formimin e biofilmit E. coli dhe analizën e mëvonshme proteomike.

Protokolli: Formimi, shkëputja dhe analiza proteomike e biofilmit duke përdorur sonikë me shumë mostra Hielscher

1. Përgatitja e kulturës bakteriale

• Kultivimi i baktereve E. coli (shtjellimi W3110) në 30°C, një temperaturë e favorshme për formimin e biofilmit të E. coli, në mjedisin e lëngut tripton (TB) që përmban:
  – 10 g/L tripton
  – 5 g/L NaCl
• Plotësoni me antibiotikë sipas nevojës për të siguruar mbajtjen e plazmidit.
• Për studimet e mikroskopisë dhe aktivitetit të promovuesit, përdorni shtamin W3110 E. coli me një raportues të zgjeruar gjenomik GFP (eGFP) nën kontrollin e promotorit rplL.
• Përdorni plazmidet raportuese GFP për promovues të ndryshëm (p.sh. csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) për të matur aktivitetet e promotorëve.

2. Kultivimi dhe shkëputja e biofilmit

• Mbushni 1,5 mL kulturë bakteriale të holluar për pus në një pjatë me 12 pusi (Pllaka CellStar 12 pusesh, Greiner Bio-One).
• Inkuboni për të lejuar formimin e biofilmit.
• Hiqni me kujdes kulturën planktonike (jo ngjitëse).

– Lani çdo pus me 500 µL PBS.
– Shkëputni qelizat e bashkangjitura duke sonikuar pllakën me 12 pllakë në sonikatorin e mikropllakës UIP400MTP. UIP400MTP siguron një shkëputje uniforme duke dhënë energji të qëndrueshme tejzanor në të gjitha puset.
– Cilësimet e tingullit: 60% amplitudë, modaliteti i ciklit: 60 sek ON? 30 sek FAKT.

3. Vjelja e qelizave dhe liza

• Centrifugoni qelizat e shkëputura të biofilmit në 4500 g për 5 minuta.
• Lani qelizat e peletuara me PBS.
• Risuspendoni qelizat në 100 µL lauroil sarkosinate natriumi 2% (SLS) dhe inkuboni në 95°C për 15 minuta.
• Sonicate duke përdorur VialTweeter Multi-Tube Sonicator për të siguruar lizën e plotë të qelizave.
  – Cilësimet e tingullit: 100% amplitudë, 50 s ON? 10 s OFF për 10 minuta kohë totale të funksionimit; mbajini mostrat në akull.

4. Reduktimi dhe Alkilimi

• Shtoni 5 mM Tris(2-karboksietil)fosfinë (TCEP) për të reduktuar lidhjet disulfide dhe inkuboni në 95°C për 15 minuta.
• Proteinat alkilohen me 10 mM jodoacetamid për 30 minuta në 25°C.

5. Kuantifikimi dhe tretja e proteinave

• Centrifugoni lizat për të pastruar mbeturinat.
• Përcaktoni sasinë e përmbajtjes totale të proteinave duke përdorur Pierce BCA Protein Assay Kit.
• Tretni 50 µg proteina totale me 1 µg tripsinë në një tretësirë që përmban 2% SLS dhe 100 mM bikarbonat amoni.
• Inkuboni reaksionin e tretjes gjatë natës në 30°C.

6. Pastrimi i peptideve

• Precipitoni SLS duke shtuar 1,5% acid trifluoroacetik (TFA), më pas centrifugoni.
• Pastroni peptidet duke përdorur kolona mikrospin C18.
• Thajini peptidet e pastruara dhe risuspendoni në 0,1% TFA.

7. Kromatografia e lëngshme-spektrometria e masës (LC-MS/MS)

• Analizoni peptidet në një spektrometër masiv Q-Exactive Plus të shoqëruar me një sistem nano Ultimate 3000 RSLC.
• Ndani peptidet duke përdorur një kolonë HPLC me fazë të kundërt (75 µm × 42 cm) të mbushur me rrëshirë C18 (2,4 µm).
• Aplikoni një gradient nga 2% në 35% tretës B (acetonitril me 0,15% acid formik) për 140 minuta.
• Merrni të dhëna duke përdorur skanime MS me rezolucion të lartë të ndjekur nga skanime të njëpasnjëshme MS/MS të 10 joneve më intensive.

8. Analiza e të dhënave

• Përpunoni të dhënat e papërpunuara LC-MS duke përdorur programin Progenesis.
• Eksportoni skedarë .mgf dhe analizoni ato me MASCOT.
• Kryeni kuantifikimin e peptideve duke përdorur SafeQuant për kontrollin e cilësisë dhe rregullimin e zbulimit të rremë.
• Kryeni të gjitha eksperimentet në dublikatë ose trefisha për të siguruar riprodhueshmëri.

Sonicatorë me shumë mostra për përgatitjen e mostrës me performancë të lartë

Modelet e sonikatorëve me shumë mostra VialTweeter dhe UIP400MTP rrisin ndjeshëm saktësinë dhe efikasitetin e rrjedhave eksperimentale të punës, veçanërisht në kërkimin e biofilmit dhe proteomikën. Aftësia e tyre për të përpunuar mostra të shumta në mënyrë uniforme siguron kapacitet të lartë të përpunimit pa kompromentuar cilësinë e të dhënave. Këto përfitime, të kombinuara me rrjedhat e thjeshta të punës të përshkruara më sipër, i bëjnë sonikët me shumë mostra Hielscher mjete thelbësore për kërkimet moderne biologjike.

Dizajn, Prodhim dhe Konsulencë – Cilësi e prodhuar në Gjermani

Ultrasonikët Hielscher janë të njohur për cilësinë e tyre më të lartë dhe standardet e dizajnit. Qëndrueshmëria dhe funksionimi i lehtë lejojnë integrimin e qetë të ultrasonikëve tanë në objektet industriale. Kushtet e vështira dhe mjediset kërkuese trajtohen lehtësisht nga ultrasonikët Hielscher.

Hielscher Ultrasonics është një kompani e certifikuar ISO dhe i kushton theks të veçantë ultratingujve me performancë të lartë që paraqesin teknologjinë më të fundit dhe lehtësinë ndaj përdorimit. Sigurisht, ultrasonikët Hielscher janë në përputhje me CE dhe plotësojnë kërkesat e UL, CSA dhe RoHs.