Nxjerrja e matricës jashtëqelizore me Sonicator 96-Well UIP400MTP

Metodat tradicionale të nxjerrjes së Matricës Jashtëqelizore (EM) shpesh përfshijnë hapa të shumtë për të prishur matricën e biofilmit. Megjithatë, këto teknika mund të kërkojnë kohë dhe jokonsistente, duke çuar në ndryshueshmëri në rezultate. Me sonikatorin me pllaka 96 pusesh UIP400MTP, procesi i nxjerrjes së EM lehtësohet ndjeshëm, duke siguruar ndërprerje shumë efikase, precize dhe uniforme të biofilmit në formate me fuqi të lartë. UIP400MTP përdor ultratinguj të fokusuar për të gjeneruar kavitacion të kontrolluar, duke zbërthyer në mënyrë efektive matricën e biofilmit duke ruajtur qëndrueshmërinë dhe integritetin e qelizave të ngulitura në biofilm. Përdorimi i UIP400MTP rrit riprodhueshmërinë dhe saktësinë e analizave të rrjedhës së poshtme, të tilla si analizat metabolike dhe proteomike, testet e qëndrueshmërisë dhe studimet e ndjeshmërisë antimikrobike. Duke thjeshtuar nxjerrjen EM, UIP400MTP u mundëson studiuesve të arrijnë rezultate të qëndrueshme dhe me cilësi të lartë, duke ofruar njohuri më të thella mbi dinamikën e biofilmit dhe ndërveprimet me agjentët e jashtëm.

ekstraktimi i matricës jashtëqelizore

Matrica jashtëqelizore (EM) është një komponent kritik i biofilmave të formuar nga mikroorganizma të tillë si Candida albicans. I përbërë nga polisaharide, proteina, lipide dhe ADN jashtëqelizore, EM siguron integritet strukturor, ndërmjetëson ngjitjen në sipërfaqe dhe kontribuon ndjeshëm në rezistencën antimikrobike. Nxjerrja dhe analizimi i EM është thelbësor për të kuptuar biologjinë e biofilmit, sqarimin e mekanizmave të rezistencës ndaj ilaçeve dhe identifikimin e objektivave të reja terapeutike.

Protokolli për nxjerrjen e matricës jashtëqelizore (EM) nga biofilmat Candida albicans duke përdorur UIP400MTP

Ky protokoll fokusohet në nxjerrjen e matricës jashtëqelizore (EM) të biofilmave statike Candida albicans. Integrimi i sonikatorit UIP400MTP për të zëvendësuar gërvishtjet tradicionale ose hapat e bazuar në enzimë për efikasitet dhe riprodhueshmëri të përmirësuar.

Materialet e nevojshme

Udhëzime hap pas hapi për nxjerrjen EM

1. Formimi i biofilmit statik
   Për biofilmat statike, inokuloni C. albicans në puset e një pllake 96 pusesh duke përdorur mjedisin RPMI-1640. Çdo pus duhet të përmbajë një vëllim të qëndrueshëm inokulimi (p.sh., 200 µL për pus).
   Inkuboni pllakën në 37°C në kushte statike për 24 orë për të lejuar formimin e biofilmit në sipërfaqet e pusit.
2. Përgatitja e Biofilmit për Ekstraktim
   Pas inkubimit, aspirojeni butësisht dhe hidheni mediumin e harxhuar nga çdo pus pa e shqetësuar biofilmin.
   Shpëlajeni secilën mirë me kujdes me PBS steril (p.sh. 200 µL) për të hequr qelizat e lidhura lirshëm dhe mbeturinat planktonike. Përsëriteni këtë hap dy herë.
   Shtoni PBS të freskët ose tampon ekstraktues (p.sh., 200 µL) në çdo pus për t'u përgatitur për sonikimin.
3. Sonication me UIP400MTP
   Vendoseni pllakën me 96 pusi që përmban PBS ose tampon ekstraktues në tabakanë e sonikatorit UIP400MTP. Për të vendosur saktë pllakën me shumë pusi, ndiqni udhëzimet e manualit.
   Soniconi për 5-6 minuta në një mjedis të butë (60% amplitudë, modaliteti i pulsit), duke siguruar prishje uniforme të strukturës së biofilmit dhe lirimin e përbërësve EM.
   Përdorni kontrollin e temperaturës së sonikatorit UIP400MTP (sensori i temperaturës dhe cilësimet) për të shmangur ngrohjen e tepërt ose dëmtimin e mostrës.
4. Trajtimi me rrëshirë të shkëmbimit të kationeve (CER).
   Transferoni lëngun e sonikuar nga çdo pus në një pllakë të re 96 pusesh.
   Shtoni një vëllim të dyfishtë të suspensionit CER (të përgatitur në PBS ose bufer) në çdo pus (p.sh., 400 µL vëllim total për pus).
   Mbyllni pllakën dhe inkuboni atë në një tundës pjate ose rrotullues me 400 rpm për 3 orë për të lejuar lidhjen dhe izolimin e komponentëve EM.
5. Ndarja dhe filtrimi
   Centrifugoni pllakën në 2000 × g për 10 minuta për të ndarë rrëshirën dhe qelizat nga supernatanti.
   Transferoni me kujdes supernatantin që përmban EM nga çdo pus në një pllakë të re 96 pusesh.
   Filtroni supernatantin përmes një filtri 0,22 µm duke përdorur një sistem manifold vakumi të bazuar në pllaka ose ekuivalent për të marrë një ekstrakt të pastër EM.
6. Analiza e EM
   Përdorni teknika të tilla si UPLC-Q-TOF-MS për profilizimin e metabolitëve të pacaktuar, ose përdorni analiza specifike (p.sh., BCA për proteinat, trigliceridet dhe kompletet e kuantifikimit të karbohidrateve) për të karakterizuar komponentët EM.

Nxjerrja e matricës jashtëqelizore me fuqi të lartë

Efikasiteti i lartë i nxjerrjes së matricës jashtëqelizore (EM) me sonikatorin UIP400MTP ka revolucionarizuar përgatitjen e mostrës për analizat që kërkojnë analizë të saktë të vetive të biofilmit. UIP400MTP përdor valët tejzanor për të prishur saktësisht dhe në mënyrë uniforme matricën e biofilmit, duke mundësuar lirimin efektiv të komponentëve EM duke ruajtur qëndrueshmërinë dhe integritetin e qelizave. Kjo qasje rrit ndjeshëm besueshmërinë e analizave të tilla si testet e qëndrueshmërisë së biofilmit, studimet proteomike dhe metabolike dhe vlerësimet e ndjeshmërisë antimikrobike.

Për analizat e rikuperimit të biofilmit, të tilla si numërimi i njësisë së formimit të kolonive (CFU), nxjerrja EM me UIP400MTP siguron akses të papenguar të reagentëve në qelizat e ngulitura në biofilm. Në mënyrë të ngjashme, analizat proteomike dhe metabolike, të tilla si UPLC-Q-TOF-MS, përfitojnë nga izolimi me rendiment të lartë të proteinave, lipideve dhe metabolitëve. UIP400MTP gjithashtu mbështet testimin e saktë të ndjeshmërisë antimikrobike, duke lejuar përcaktimin e saktë të vlerave MIC dhe MBEC të biofilmit. Për më tepër, nxjerrja efikase e lehtësuar nga UIP400MTP ndihmon në analizat e aktivitetit të enzimës, kuantifikimin e komponentëve dhe studimet strukturore, duke ofruar njohuri të vlefshme për rolin e matricave jashtëqelizore në arkitekturën e biofilmave, ngjitjen dhe mekanizmat e rezistencës.

Kjo metodë e ekstraktimit me performancë të lartë dhe të riprodhueshme optimizon përgatitjen e EM, duke siguruar rezultate superiore në një sërë analizash të lidhura me biofilmin.