Deparafinizimi dhe ekstraktimi i proteinave nga FFPE

Lehtësoni ekstraktimin e proteinave nga prerjet e indeve të fiksuara në formalinë dhe të përfshira në parafinë (FFPE) duke përdorur një kombinim të optimizuar të deparafinizimit, solubilizimit dhe sonikimit me një ultrasonikator VialTweeter për shumë tuba. Ky protokoll mbështet analizat e mëtejshme proteomike të bazuara në spektrometrinë e masës dhe është i pajtueshëm me rrjedhat e punës për pastrimin me SP3 dhe tretjen enzimatike.

Kjo procedurë standarde e punës (SOP) është menduar për personelin laboratorik të përfshirë në analizën proteomike të mostrave të indeve FFPE duke përdorur sonikim me performancë të lartë. Ajo është optimizuar për deri në dhjetë mostra FFPE të përpunuara paralelisht duke përdorur sonikatorin VialTweeter për shumë tuba.

VialTweeter te procesori ultrasonik UP200ST

Sonikatori VialTweeter për sonikimin e njëkohshëm të 10 mostrave, p.sh. për lizën dhe ekstraktimin e proteinave nga mostrat FFPE

Protokolli: Ekstraktimi i proteinave nga mostrat FFPE duke përdorur VialTweeter

Materialet dhe reagentët

Reagentët

Ksilen (i cilësisë për histologji)
Etanol (absolut 96%)
Tamponi i lizës:

6 M hidroklorur guanidine
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (Tris(2-karboksietil)fosfinë)
40 mM CAA (2-kloroacetamid)

Inhibitor i proteazave (opsional; p.sh., cOmplete™ mini pa EDTA)

Pajisjet

Ultrasonikatori VialTweeter për shumë tuba
Tuba mikrocentrifugimi 1,5 mL ose 2,0 mL me kapacitet të ulët lidhjeje
Bllok ngrohës ose inkubator (me cilësime 95°C dhe 80°C)
Mikrocentrifugë
Termopërzierës (opsional, por i rekomanduar)

Sasia hyrëse e mostrës

1–2 prerje indi FFPE me trashësi 10 µm për mostër (d.m.th., për flakon)

OSE

Gjithsej ~100 µg ind për mostër (d.m.th., për flakon)

Shënim: Përdorni tehe të reja për mikrotominë për të minimizuar ndotjen nga mbetjet e parafinës.

Procedura

Deparafinizimi
1. Transferojini prerjet FFPE në tuba mikrocentrifugimi me kapacitet të ulët lidhjeje.
2. Shtoni 1 mL ksilen dhe përziejini shkurtimisht me vorteks.
3. Inkubojini për 10 minuta në temperaturën e dhomës.
4. Centrifugojini në 14 000 × g për 2 minuta; hidhni supernatantin.
5. Përsëriteni larjen me ksilen edhe një herë (hapat 2–4).
6. Lajeni sedimentin me 1 mL etanol 96%, përziejeni me vorteks dhe më pas centrifugojeni në 14 000 × g për 2 minuta. Hidhni supernatantin.
7. Përsëriteni larjen me etanol edhe një herë (gjithsej 2 larje me etanol).
8. Thajeni sedimentin në ajër për 10 minuta në temperaturën e dhomës, me kapakët të hapur, për të avulluar etanolin e mbetur.
Ekstraktimi i proteinave dhe sonikimi
1. Shtoni 200 µL tampon lize në secilin sediment të thatë. 
  Shënim: Megjithëse sonikatori mund të akomodojë deri në 1 mL, 200 µL është vëllimi optimal për përpunimin e mëtejshëm.
2. Përziejini me vorteks ose me pipetim të butë.
Inkubimi i parë termik
1. Inkubojini tubat në 95 °C për 30 min, me përzierje në 400 rpm duke përdorur një termopërzierës ose bllok ngrohës.
2. Lërini mostrat të ftohen në temperaturën e dhomës për 5 min.
Sonikimi i parë me VialTweeter
1. Vendosini tubat në VialTweeter.
2. Vendosni në VialTweeter UP200St vlerat e mëposhtme dhe kryeni sonikimin.

Cilësimet e sonikatorit
• Vendosni amplitudën (A) në 100%
• Vendosni modalitetin e pulsimit (C) në 100%
• Kohëmatësi i periudhës: Aktiv
• Koha e aktivizimit: 60s
• Koha e çaktivizimit: 30s
• Vlera kufi: 15 min (korrespondon me 10 cikle)
(Shënim për llogaritjen: (60 s aktiv + 30 s joaktiv) × 10 cikle = 900 s = 15 min)

Inkubimi i dytë termik
Hiqini tubat dhe inkubojini përsëri në 95 °C për 15 min, në 400 rpm.
Sonikimi i dytë
Përsëriteni sonikimin në VialTweeter duke përdorur të njëjtat cilësime (si më sipër) për 10 cikle shtesë (15 min gjithsej).
Kthjellimi i lizatit
1. Centrifugojini mostrat në 13 000 × g për 10 min në 23°C (temperatura e dhomës).
2. Mblidheni me kujdes supernatantin në një tub të ri Eppendorf Safe-lock 2,0 mL. Shmangni trazimin e sedimentit.
Përpunimi i mëtejshëm
Lizati tani është gati për pastrimin me SP3 dhe tretjen enzimatike.

VialTweeter është një sistem unik ultrasonik për sonikimin e njëkohshëm të deri në 10 flakonëve në kushte plotësisht të njëjta, pa kontaminim të kryqëzuar.

VialTweeter me tuba Eppendorf 2,0mL për përgatitje të besueshme të mostrave në kushte sterile

Hielscher VialTweeter me 10 tuba Eppendorf

Shënime dhe praktika më të mira

Rreziku i mbinxehjes gjatë sonikimit zvogëlohet nga ciklet e programuara të aktivizimit/çaktivizimit.
Shmangni përzierjen me vorteks pas sonikimit për të parandaluar agregimin e proteinave.

Asgjësimi i mbetjeve dhe siguria

Ksileni dhe hidrokloruri i guanidinës janë kimikate të rrezikshme; punoni me to nën një aspirator kimik.

Asgjësoni të gjitha mbetjet e tretësve dhe mbetjet biologjike sipas protokolleve institucionale të biosigurisë dhe higjienës kimike.

Tabela më poshtë ju jep një ide për kapacitetin e përafërt të përpunimit të ultrasonikatorëve tanë laboratorikë:

Pajisjet e rekomanduara	Vëllimi i serisë	Prurja
Sonikatori UIP400MTP për pllaka me 96 puse	pllaka me shumë puse / mikrotitrimi	n.a.
CupHorn ultrasonik	CupHorn për flakonë ose gotë kimike	n.a.
GDmini2	mikroreaktor ultrasonik me rrjedhje	n.a.
VialTweeter	0,5 deri në 1,5mL	n.a.
UP100H	1 deri në 500mL	10 deri në 200mL/min
UP200Ht, UP200St	10 deri në 1000mL	20 deri në 200mL/min
UP400St	10 deri në 2000mL	20 deri në 400mL/min
Shkundës ultrasonik sitash	n.a.	n.a.

Homogjenizuesit ultrasonikë me forca të larta prerëse përdoren në përpunimin laboratorik, në tryezë pune, pilot dhe industrial.

Hielscher Ultrasonics prodhon homogjenizues ultrasonikë me performancë të lartë për aplikime përzierjeje, dispergimi, emulsifikimi dhe ekstraktimi në shkallë laboratorike, pilot dhe industriale.

Tema të lidhura

Literatura / Referencat

Georgios Mermelekas, Mahshid Zarrineh, Rudi Branca, Fabio Socciarelli (2025): FFPE sections SP3 digestion – rapizyme and ACN. Protocols.io 2025
Li, W., Chi, H., Salovska, B. et al. (2019): Assessing the Relationship Between Mass Window Width and Retention Time Scheduling on Protein Coverage for Data-Independent Acquisition. Journal of American Society for Mass Spectrometry. 30, 2019. 1396–1405.
Salovska B., Li W., Bernhardt O.M., Germain P.L., Gandhi T., Reiter L., Liu Y. (2024): A Comprehensive and Robust Multiplex-DIA Workflow Profiles Protein Turnover Regulations Associated with Cisplatin Resistance. bioRxiv [Preprint]. Oct 31, 2024.

Pyetje të shpeshta

Pse fiksohen mostrat e indeve si FFPE?

Ruajtja me fiksim në formalinë dhe përfshirje në parafinë (FFPE) stabilizon morfologjinë e indeve dhe strukturat e proteinave duke formuar lidhje të kryqëzuara kovalente nëpërmjet formaldehidit. Përfshirja në parafinë mundëson ruajtjen afatgjatë në temperaturën e dhomës, duke ruajtur integritetin histologjik dhe molekular për analiza retrospektive.

Si t’i deparafinizoj mostrat FFPE?

Deparafinizimi përfshin larje të njëpasnjëshme me tretës për të larguar parafinën: zakonisht dy inkubime me ksilen, të ndjekura nga dy larje me etanol (96%). Pas centrifugimit dhe tharjes, indi është gati për ekstraktimin e mëtejshëm. Ky proces e bën mostrën sërish të aksesueshme për lizën dhe tretjen enzimatike.

Cili është qëllimi i inkubimit termik?

Inkubimi termik i referohet ekspozimit të kontrolluar të një mostre ndaj një temperature të përcaktuar për një periudhë të caktuar kohore për të shkaktuar ndryshime biokimike ose fizike. Në proteomikë, ai përdoret zakonisht për të denatyruar proteinat, për të zhbërë lidhjet e kryqëzuara të formaldehidit në indet FFPE ose për të rritur efikasitetin e tamponit të lizës. Temperatura dhe kohëzgjatja janë parametra kritikë, të përshtatur sipas reaksionit të synuar ose llojit të mostrës.

Çfarë është tretja me SP3?

Përgatitja e mostrave në një enë të vetme, e përforcuar me fazë të ngurtë (SP3), është një rrjedhë pune proteomike e bazuar në rruaza. Ajo përdor rruaza paramagnetike për të lidhur proteinat, duke mundësuar pastrim, përqendrim dhe tretje enzimatike efikase mbi rruaza në kushte denatyruese. SP3 minimizon humbjen e mostrës dhe është shumë e pajtueshme me mostrat me sasi të vogël materiali fillestar dhe me mostrat FFPE.

Ultratinguj me performancë të lartë! Gama e produkteve Hielscher mbulon të gjithë spektrin, nga ultrasonikatori kompakt laboratorik, përmes njësive për tryezë pune, deri te sistemet ultrasonike plotësisht industriale.

Hielscher Ultrasonics prodhon homogjenizues ultrasonikë me performancë të lartë nga përmasat laboratorike deri në përmasat industriale.