Deparafinizimi dhe nxjerrja e proteinave nga FFPE
Lehtësoni nxjerrjen e proteinave nga seksionet e indeve të ngulitura në parafinë (FFPE) të fiksuara me formalinë duke përdorur një kombinim të optimizuar të deparafinizimit, tretjes dhe sonikimit me një ultrasonikator me shumë tuba VialTweeter. Ky protokoll mbështet proteomikën e bazuar në spektrometrinë e masës në rrjedhën e poshtme dhe është në përputhje me pastrimin e SP3 dhe flukset e punës të tretjes enzimatike.
Ky SOP është menduar për personelin laboratorik të përfshirë në analizën proteomike të mostrave të indeve FFPE duke përdorur sonikacion me performancë të lartë. Është optimizuar për deri në dhjetë mostra FFPE të përpunuara paralelisht duke përdorur VialTweeter Multi-Tube Sonicator.
Sonicator VialTweeter për sonikimin e njëkohshëm të 10 mostrave, p.sh. për lizën dhe nxjerrjen e proteinave nga mostrat FFPE
Protokolli: Nxjerrja e proteinave nga mostrat FFPE duke përdorur VialTweeter
Materialet dhe reagentët
reagentët
- Ksyleni (shkalla e histologjisë)
- Etanol (absolutisht 96%)
- Buferi i lizës:
- Frenues i proteazës (opsionale; p.sh., cOmplete™ mini pa EDTA)
6 M hidroklorur guanidine
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (Tris(2-karboksietil)fosfinë)
40 mM CAA (2-kloroacetamid)
Pajisjet
- Ultrasonikator me shumë tuba VialTweeter
- Tuba mikrocentrifuge 1,5 mL ose 2,0 mL me lidhje të ulët
- Blloku i nxehtësisë ose inkubatori (konfigurimet 95°C dhe 80°C)
- Mikrocentrifugues
- Termomikser (opsionale por i rekomanduar)
Shembull i hyrjes
- 1-2 seksione të indit FFPE me trashësi 10 µm për mostër (dmth., për shishkë)
- Një total prej ~ 100 µg ind për mostër (dmth., për shishkë)
ose
Shënim: Përdorni tehe të freskëta për mikrotominë për të minimizuar ndotjen e mbeturinave të parafinës.
Procedura
- deparafinizimi
- Transferoni seksionet FFPE në tuba mikrocentrifuge me lidhje të ulët.
- Shtoni 1 mL ksilen, vorbulloni shkurtimisht.
- Inkuboni 10 minuta në temperaturën e dhomës.
- Centrifugoni në 14,000 × g për 2 minuta; hidhni supernatantin.
- Përsëriteni larjen me ksilen edhe një herë (Hapat 2–4).
- Lani peletin me 1 mL etanol 96%, vorbull, më pas centrifugoni në 14,000 × g për 2 minuta. Hidhni supernatantin.
- Përsëriteni larjen me etanol edhe një herë (gjithsej 2 larje me etanol).
- Thajeni peletin në ajër për 10 minuta në temperaturën e dhomës me kapak të hapur për të avulluar etanolin e mbetur.
- Nxjerrja e proteinave dhe sonikimi
- Shtoni 200 µL tampon lize në çdo pelet të thatë.
Shënim: Megjithëse aparati i zërit strehon deri në 1 mL, 200 µL është optimale për përpunimin në rrjedhën e poshtme. - Përziejini me vorbull ose me tubacion të butë.
- Shtoni 200 µL tampon lize në çdo pelet të thatë.
- Inkubacioni i parë termik
- Inkuboni tubat në 95 °C për 30 minuta, me trazim në 400 rpm duke përdorur një termomikser ose bllok ngrohjeje.
- Lërini mostrat të ftohen në temperaturën e dhomës për 5 minuta.
- Sonication e parë me VialTweeter
- Vendosni tubat në VialTweeter.
- Vendosni VialTweeter UP200St në vlerat e mëposhtme dhe bëni zërin.
- Inkubacioni i dytë termik
Hiqni tubat dhe inkuboni përsëri në 95 °C për 15 minuta, 400 rpm. - Sonication dytë
Përsëritni sonikacionin në VialTweeter duke përdorur të njëjtat cilësime (si më sipër) për 10 cikle të tjera (gjithsej 15 minuta). - Sqarimi i Lizatit
- Centrifugoni mostrat në 13,000 × g për 10 minuta në 23°C (temperatura e dhomës).
- Mblidhni me kujdes supernatantin në një tub të ri Eppendorf 2,0 mL Safe-lock. Shmangni shqetësimin e peletit.
- Përpunimi në rrjedhën e poshtme
Lizati tani është gati për pastrimin e SP3 dhe tretjen enzimatike.
• Cakto amplituda (A) në 100%
• Cakto modalitetin e pulsimit (C) në 100%
• Ora e periudhës: Aktiv
• Në kohë: 60s
• Koha e fikjes: 30s
• Vlera kufi: 15 min (korrespondon me 10 cikle)
(Shënim llogaritës: (60 s Aktiv + 30 s Joaktiv) × 10 cikle = 900 s = 15 min)
Hielscher VialTweeter me 10 tuba Eppendorf
Shënime dhe praktikat më të mira
- Rreziku i mbinxehjes gjatë sonikimit zbutet nga çiklizmi i programuar ON/OFF.
- Shmangni vorbullimin pas sonikimit për të parandaluar grumbullimin e proteinave.
Hedhja dhe Siguria e Mbetjeve
Tabela e mëposhtme ju jep një tregues të kapacitetit të përafërt përpunues të ultrasonikëve tanë të përmasave laboratorike:
| Pajisjet e rekomanduara | Vëllimi i grupit | Shkalla e rrjedhjes |
|---|---|---|
| UIP400MTP Sonicator me pllaka 96-puse | pllaka me shumë pus / mikrotitër | na |
| Kupa tejzanor | Briri i filxhanit për shishka ose gotë | na |
| GDmini2 | reaktor mikro-rrjedhës tejzanor | na |
| VialTweeter | 0.5 deri në 1.5mL | na |
| UP100H | 1 deri në 500 ml | 10 deri në 200 ml/min |
| UP200Ht, UP200 St | 10 deri në 1000 ml | 20 deri në 200 ml/min |
| UP400 St | 10 deri në 2000 ml | 20 deri në 400 ml/min |
| Shaker sitë tejzanor | na | na |
Hielscher Ultrasonics prodhon homogjenizues tejzanor me performancë të lartë për përzierjen e aplikimeve, shpërndarjen, emulsifikimin dhe nxjerrjen në shkallë laboratorike, pilot dhe industriale.
Literatura / Referencat
- Georgios Mermelekas, Mahshid Zarrineh, Rudi Branca, Fabio Socciarelli (2025): FFPE sections SP3 digestion – rapizyme and ACN. Protocols.io 2025
- Li, W., Chi, H., Salovska, B. et al. (2019): Assessing the Relationship Between Mass Window Width and Retention Time Scheduling on Protein Coverage for Data-Independent Acquisition. Journal of American Society for Mass Spectrometry. 30, 2019. 1396–1405.
- Salovska B., Li W., Bernhardt O.M., Germain P.L., Gandhi T., Reiter L., Liu Y. (2024): A Comprehensive and Robust Multiplex-DIA Workflow Profiles Protein Turnover Regulations Associated with Cisplatin Resistance. bioRxiv [Preprint]. Oct 31, 2024.
pyetjet e bëra shpesh
Pse mostrat e indeve fiksohen si FFPE?
Ruajtja e ngulitur në parafinë e fiksuar në formalinë (FFPE) stabilizon morfologjinë e indeve dhe strukturat e proteinave duke formuar lidhje tërthore kovalente nëpërmjet formaldehidit. Përfshirja në parafinë mundëson ruajtjen afatgjatë në temperaturën e dhomës duke ruajtur integritetin histologjik dhe molekular për analizat retrospektive.
Si mund të deparafinizoj mostrat FFPE?
Deparafinizimi përfshin larje të njëpasnjëshme me tretës për të hequr parafinën: zakonisht dy inkubacione me ksilen, pasuar nga dy larje me etanol (96%). Pas centrifugimit dhe tharjes, indi është gati për ekstraktim në rrjedhën e poshtme. Ky proces rikthen aksesin e mostrës për lizën dhe tretjen enzimatike.
Cili është qëllimi i inkubacionit termik?
Inkubacioni termik i referohet ekspozimit të kontrolluar të një kampioni në një temperaturë të përcaktuar për një periudhë të caktuar kohe për të nxitur ndryshime biokimike ose fizike. Në proteomikë, zakonisht përdoret për të denatyruar proteinat, për të kthyer ndërlidhjet e tërthorta të formaldehidit në indet FFPE ose për të rritur efikasitetin e tamponit të lizës. Temperatura dhe kohëzgjatja janë parametra kritikë, të përshtatur për reagimin e synuar ose llojin e mostrës.
Çfarë është SP3 Digestion?
Përgatitja e mostrës me fazë të ngurtë me një tenxhere (SP3) është një rrjedhë pune e proteomikës e bazuar në rruaza. Ai përdor rruaza paramagnetike për të lidhur proteinat, duke mundësuar pastrim efikas, përqendrim dhe tretje enzimatike në rruaza në kushte denatyrimi. SP3 minimizon humbjen e kampionit dhe është shumë i pajtueshëm me mostrat me hyrje të ulët dhe FFPE.
Hielscher Ultrasonics prodhon homogjenizues tejzanor me performancë të lartë nga laboratori te madhësia industriale.