Protokolli i analizës së përqendrimit frenues minimal (MIC).
Analiza e Përqendrimit Inhibitor Minimal të Bazuar në Biofilm (MIC) është një metodë thelbësore për vlerësimin e efektivitetit të agjentëve antimikrobikë ndaj mikroorganizmave të lidhur me biofilmin, të cilët shfaqin rezistencë të shtuar për shkak të matricës së tyre mbrojtëse jashtëqelizore. Një hap vendimtar në këtë analizë është prishja e strukturave të biofilmit për të çliruar qelizat e ngulitura për vlerësim të saktë të qëndrueshmërisë. Sonicatori me pllaka me shumë puse UIP400MTP lehtëson këtë proces duke përdorur ultratinguj të fokusuar për të gjeneruar kavitacion të kontrolluar, duke shkëputur në mënyrë efikase qelizat e biofilmit dhe duke i shpërndarë ato në një pezullim uniform. Ky ndërprerje precize dhe e riprodhueshme e biofilmit rrit besueshmërinë dhe performancën e analizave MIC, duke e bërë UIP400MTP një mjet thelbësor në avancimin e kërkimit të biofilmit.
Sonication për shkëputjen e biofilmit
Analiza MIC e bazuar në biofilm zakonisht mat qëndrueshmërinë bakteriale ose frenimin e rritjes duke përdorur metoda të tilla si platimi, numërimi i kolonive ose matjet e densitetit optik. Sonication është një hap kritik në analizat MIC të bazuara në biofilm kur vlerësohet ndjeshmëria antimikrobike e mikroorganizmave të lidhur me biofilm. Funksioni i tij kryesor është të shkëputë dhe të shpërndajë qelizat e ngulitura në matricën e biofilmit në një pezullim uniform për analizë të saktë.
Biofilmat janë dukshëm më rezistent ndaj agjentëve antimikrobikë në krahasim me qelizat planktonike, duke e bërë shkëputjen e duhur kritike për analiza të sakta. Gjatë këtij procesi, valët tejzanor gjenerojnë kavitacion të kontrolluar, duke copëtuar matricën e biofilmit dhe duke lëshuar qelizat e ngulitura në një pezullim uniform brenda mediumit të rikuperimit. Ky hap mundëson vlerësime të sakta të qëndrueshmërisë së qelizave të shpërndara në biofilm përmes metodave të tilla si platimi, hollimi dhe numërimi i kolonive. Ndërprerja e duhur e biofilmit nëpërmjet sonikacionit parandalon komponentët e mbetur të matricës nga mbrojtja e qelizave, gjë që përndryshe mund të çojë në një nënvlerësim të aktivitetit antimikrobik. Sonicatori me pllaka me shumë pllakë UIP400MTP është veçanërisht i përshtatshëm për këtë qëllim, duke ofruar kushte të sakta dhe të riprodhueshme të tingullit për të siguruar përgatitjen e besueshme dhe me performancë të lartë të pllakave të analizës.
Sonicator me mikropllakë UIP400MTP për shkëputje saktësisht të kontrollueshme të biofilmit në analizat MIC dhe MBEC.
Pse sonifikimi është i nevojshëm në analizat e përqendrimit frenues minimal të bazuar në biofilm
Për matjet e qëndrueshmërisë dhe numërimin e qelizave, kërkohet një shkëputje dhe shpërndarje e plotë dhe e besueshme e qelizave të vetme. UIP400MTP promovon një shkëputje uniforme, jo-dëmtuese të biofilmit dhe shpërndarje qelizore për rezultate të forta të analizës.
- Kompleksiteti i biofilmit: Biofilmat janë bashkësi mikrobike të strukturuara të mbështjella në një matricë të substancës polimerike jashtëqelizore (EPS), e cila mbron mikroorganizmat dhe i bën ata më rezistent ndaj agjentëve antimikrobikë.
- Shpërndarja uniforme: Për të matur me saktësi qëndrueshmërinë e qelizave të ngulitura në biofilm ose ndjeshmërinë e tyre ndaj antimikrobikëve, biofilmi fillimisht duhet të zhvendoset dhe të ndahet në një suspension homogjen.
Protokolli i analizës së përqendrimit frenues minimal të bazuar në biofilm
Analiza e Përqendrimit Inhibitor Minimal (MIC) përcakton përqendrimin më të ulët të një agjenti antimikrobik që kërkohet për të penguar rritjen e dukshme të mikroorganizmave. Ky protokoll është projektuar për mikroorganizmat e lidhur me biofilm, duke përdorur sonikatorin e pllakave me shumë puse UIP400MTP për prishjen e biofilmit.
Hapi 1: Përgatitja e inokulumit bakterial
- Përgatitni suspensionin bakterial:
Rritni bakteret në mjedise të përshtatshme deri në fazën e mesme logaritmike.
Holloni kulturën për të arritur një densitet të standardizuar të qelizave (p.sh. standardi McFarland 0,5 ose OD600 ~ 0,1). - Përgatitni zgjidhje antimikrobike:
Holloni agjentin antimikrobik në një mjedis të përshtatshëm për të krijuar një sërë përqendrimesh (p.sh. hollime serike të dyfishta). - Shpërndani në pjatën 96 pusi:
Shtoni tretësirat antimikrobike në pusetat e një pllake standarde 96 pusesh, me një vëllim përfundimtar të pusit ~150–200 µL.
Përfshini kontrollet e rritjes (pa antimikrobikë) dhe kontrollet e sterilitetit (pa inokulum bakterial).
Hapi 2: Formimi i biofilmit në kapakun e kunjit
- Ngjitni kapakun e kunjit:
Vendosni kapakun e specializuar të kunjit mbi pusetat e inokuluara, duke u siguruar që kunjat të jenë zhytur plotësisht në pezullimin bakterial. - Inkuboni pjatën:
Inkuboni në temperaturën e duhur (p.sh. 37°C) për një kohëzgjatje të caktuar (p.sh. 24 orë) në kushte statike për të lejuar formimin e biofilmit në kunja. - Shpëlaj kunjat:
Hiqeni kapakun e kunjit nga suspensioni bakterial dhe shpëlajeni butësisht me kripë sterile ose PBS për të hequr qelizat planktonike të lidhura lirshëm. - Ekspozimi ndaj antimikrobikëve:
Transferoni kapakun e kunjit në një pjatë të re 96 pusesh që përmban hollimet antimikrobike të përgatitura më parë.
Inkuboni për një periudhë të caktuar (p.sh. 24 orë) në kushte statike për të lejuar që agjenti antimikrobik të veprojë në biofilma.
Hapi 3: Ekspozimi antimikrobik
Sonicator me shumë pllakë UIP400MTP për përgatitjen e mostrës me performancë të lartë
Hapi 4: Sonication me mikropllakë Sonicator UIP400MTP
Hapi i sonikacionit është kritik për shkëputjen e biofilmave nga kapakët e kunjit për të vlerësuar qëndrueshmërinë. Ndiqni këto hapa për sonikatorin UIP400MTP:
- Përgatitni konfigurimin:
Mbushni një pjatë të freskët 96 pusesh me një mjet rikuperimi (p.sh., lëng mishi neutralizues ose mjedis steril rritjeje) në çdo pus. - Transferoni kapakun e kunjit:
Hiqeni kapakun e kunjit nga pllaka e trajtimit antimikrobik.
Shpëlajeni kapakun e kunjit me kripë sterile ose PBS për të hequr agjentët antimikrobikë të mbetur. - Vendoseni pllakën në sonikator:
Ngjitni kapakun e kunjit në pllakën e mesme të rikuperimit.
Vendoseni pllakën e mesme të rikuperimit në sonikatorin UIP400MTP, duke siguruar që pllaka të qëndrojë në qendër dhe të qëndrueshme si në manualin e përshkruar. - Rregulloni parametrat e tingullit:
Vendosni parametrat e tingullit në UIP400MTP (cilësimet mund të rregullohen në biofilm):
Amplituda: 70–100%.
Koha e sonikimit: 1–3 minuta (rregulluar në bazë të strukturës së biofilmit) në modalitetin e ciklit. - Sonicate:
Filloni procesin e sonikimit. Valët tejzanor do të prishin matricën e biofilmit dhe do të zhvendosin qelizat në mjedisin e rikuperimit. - Monitoroni procesin:
Përdorni sensorin e temperaturës që mbyllet për të monitoruar temperaturën e mostrës në puse. UIP400MTP mund të lidhet me një ftohës laboratori për ftohje. - Trajtimi pas sonikimit:
Transferoni menjëherë mediumin e rikuperimit që përmban biofilma të shkëputur në një pjatë të freskët sterile për analiza të mëvonshme.
(A) Pllakë që përmban TSB me 2% glukozë e përdorur për formimin e biofilmit, rikuperimin e qelizave dhe përcaktimin e MIC dhe MBEC; (B) Kapak me kunja për formimin e biofilmave stafilokoksikë.
Qelizat biofilmike të formuara në kunjat u zhvendosën me sonikacion (Teknologjia Hielscher Ultrasound) për 5 minuta në pllaka 96 pusesh që përmbajnë mjedis të freskët të kulturës për rikuperimin e qelizave.
(Foto dhe studim: ©de Oliveira et al., 2016)
Hapi 4: Vlerësimi i qëndrueshmërisë
Biofilma të shkëputur nga pllaka dhe kultura:
- Kryeni hollime serike të mediumit të rikuperimit dhe pllakës në agar për të numëruar njësitë formuese të kolonive (CFU).
- Vlerësoni MIC:
Përcaktoni MIC si përqendrimi më i ulët antimikrobik që frenon plotësisht rritjen e dukshme të mikrobeve në mjedisin e rikuperimit.
Përqendrimi frenues minimal i MIC: Shembull i pllakës së mikrotitrit dhe interpretimi i rezultateve të mikrodilucionit.
(Studimi dhe imazhi: ©Jaskiewicz et al. 2019)
Dizajn, Prodhim dhe Konsulencë – Cilësi e prodhuar në Gjermani
Ultrasonikët Hielscher janë të njohur për cilësinë e tyre më të lartë dhe standardet e dizajnit. Qëndrueshmëria dhe funksionimi i lehtë lejojnë integrimin e qetë të ultrazërit tanë në objektet industriale. Kushtet e vështira dhe mjediset kërkuese trajtohen lehtësisht nga sonikatorët Hielscher.
Hielscher Ultrasonics është një kompani e certifikuar ISO dhe i kushton theks të veçantë ultratingujve me performancë të lartë që paraqesin teknologjinë më të fundit dhe lehtësinë ndaj përdorimit. Sigurisht, ultrasonikët Hielscher janë në përputhje me CE dhe plotësojnë kërkesat e UL, CSA dhe RoHs.
Drejtoni përgatitjen e mostrës në pllaka 96 pusesh dhe pllaka analize duke përdorur sonikatorin me pllaka me shumë pllakë UIP400MTP
Literatura / Referencat
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
pyetjet e bëra shpesh
Çfarë është analiza MIC?
Analiza e Përqendrimit Minimal Inhibitor (MIC) është një test i standardizuar që përdoret për të përcaktuar përqendrimin më të ulët të një agjenti antimikrobik që kërkohet për të penguar rritjen e dukshme të një mikroorganizmi. Zakonisht kryhet duke përdorur metodat e mikrohollimit të lëngut ose hollimit të agarit, ku mikroorganizmat ekspozohen ndaj hollimeve serike të agjentit antimikrobik. Analizat MIC janë kritike për vlerësimin e efikasitetit antimikrobik, drejtimin e trajtimit klinik dhe vlerësimin e niveleve të rezistencës si në mikroorganizmat planktonikë ashtu edhe në mikroorganizmat e lidhur me biofilm.
Cili është ndryshimi midis analizës së përqendrimit frenues minimal të bazuar në biofilm dhe analizës MBIC?
Analiza e përqendrimit frenues minimal të bazuar në biofilm (MIC) dhe analiza e Përqendrimit Inhibitor Minimal të Biofilmit (MBIC) janë të lidhura, por të dallueshme në qëllimin dhe metodologjinë e tyre.
Analiza MIC e bazuar në biofilm vlerëson përqendrimin më të ulët të një agjenti antimikrobik të nevojshëm për të penguar rritjen ose qëndrueshmërinë e dukshme të biofilmit, duke u fokusuar në qelizat e lidhura me biofilmin në vend të baktereve planktonike. Në të kundërt, analiza MBIC mat në mënyrë specifike aftësinë e një agjenti antimikrobik për të parandaluar formimin e biofilmit, në vend që të trajtojë biofilmat e paraformuar. Ndërsa të dyja analizat merren me bakteret e lidhura me biofilm, analiza MIC e bazuar në biofilm trajton trajtimin, dhe analiza MBIC thekson parandalimin, duke i bërë ato mjete plotësuese për studimin e efikasitetit antimikrobik kundër biofilmave.
Cilat biofilma përdoren në analizat MIC?
Biofilmat mikrobikë dhe qelizat planktonike përdoren të dyja në analizat e Përqendrimit Frenues Minimal (MIC) për të studiuar efikasitetin antimikrobik në kushte të ndryshme.
- Qelizat planktonike:
Qelizat planktonike janë qeliza mikrobike të vetme lundruese që shërbejnë si model standard për analizat tradicionale të MIC. Mikroorganizmat e zakonshëm përfshijnë Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus dhe Candida albicans. Këto analiza përcaktojnë MIC-në e nevojshme për të penguar rritjen e qelizave me jetë të lirë dhe janë kritike për shqyrtimin fillestar antimikrobik. - Qelizat e lidhura me biofilm:
Qelizat biofilmike janë mikroorganizma të ngulitur në një matricë jashtëqelizore, e cila rrit ndjeshëm rezistencën e tyre ndaj antimikrobikëve. Analizat e Biofilm MIC shpesh përfshijnë:- Bakteret gram-negative: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa dhe Klebsiella pneumoniae, të njohura për formimin e biofilmave në infeksione dhe mjedise industriale.
- Bakteret gram-pozitive: Staphylococcus aureus (përfshirë MRSA), Staphylococcus epidermidis dhe Enterococcus faecalis, zakonisht të implikuar në infeksionet e lidhura me pajisjen.
- Kërpudhat: Candida albicans dhe specie të ngjashme, të rëndësishme në infeksionet fungale të lidhura me biofilm.
- Biofilma të specieve të përziera: Këto përdoren ndonjëherë për të përsëritur biofilmat polimikrobikë natyralë, të tillë si ato që gjenden në plagët kronike ose biofokusjet industriale.
Duke krahasuar vlerat MIC për qelizat planktonike dhe qelizat e lidhura me biofilmin, studiuesit mund të vlerësojnë rezistencën e shtuar të biofilmave dhe të identifikojnë agjentë efektivë kundër këtyre komuniteteve mikrobike më elastike.
Cili është ndryshimi midis MIC dhe MBEC?
Përqendrimi frenues minimal (MIC) është përqendrimi më i ulët i një agjenti antimikrobik që kërkohet për të parandaluar formimin e biofilmit, ndërsa përqendrimi minimal i çrrënjosjes së biofilmit (MBEC) është përqendrimi më i ulët i nevojshëm për të çrrënjosur një biofilm të krijuar. MIC fokusohet në parandalimin e biofilmit, ndërsa MBEC vlerëson efikasitetin e trajtimit ndaj biofilmave të pjekur.
Cilat pllaka përdoren zakonisht për analizat MBEC?
Pllakat e mikrotitrave që përdoren zakonisht për analizat MBEC janë zakonisht pllaka 96 pusesh të bëra nga polistireni ose polipropileni. Këto materiale sigurojnë një sipërfaqe të përshtatshme për formimin e biofilmit dhe janë kimikisht rezistente ndaj agjentëve antimikrobikë të testuar gjatë analizës. Pllakat e polistirenit preferohen gjerësisht për shkak të qartësisë së tyre optike, e cila është e dobishme për analizat në rrjedhën e poshtme të tilla si matjet spektrofotometrike ose të bazuara në fluoreshencë. Dizajni i këtyre pllakave përfshin kapakë të ndashëm me kunj, të cilët janë thelbësorë për analizën pasi në kunjat formohen biofilma që janë të zhytur në puset që përmbajnë media rritjeje. Pllakat e standardizuara, të tilla si ato në përputhje me protokollin e analizës MBEC, janë projektuar posaçërisht për të siguruar riprodhueshmëri dhe përputhshmëri me sonikatorin UIP400MTP ose pajisje të tjera përpunimi.
Çfarë janë pllakat me kapak PEG?
Pllakat me kapak PEG janë sisteme të specializuara të pllakave me shumë puse ku kapaku është i pajisur me kunja ose kunja të vogla polietileni glikol (PEG) që shtrihen në çdo pus. Këto kunja ofrojnë një sipërfaqe për formimin e biofilmit mikrobik në kushte të kontrolluara, duke imituar rritjen e biofilmit në botën reale. Dizajni lejon që biofilmat të zhvillohen në kunja, ndërkohë që puset përmbajnë media të rritjes ose agjentë antimikrobikë, duke mundësuar testimin me performancë të lartë të ndjeshmërisë së biofilmit ndaj trajtimeve, si në analizat MBEC, MBIC dhe MIC.
Cili është Avantazhi i Zhvendosjes së Biofilmit tejzanor në krahasim me Skrapimin e Qelizës?
Zhvendosja e biofilmit tejzanor ofron një avantazh të rëndësishëm ndaj gërvishtjes së qelizave duke ofruar një metodë jo-invazive, uniforme dhe shumë efikase për heqjen e biofilmave nga sipërfaqet. Ndryshe nga gërvishtja, e cila mund të jetë jokonsistente dhe të dëmtojë sipërfaqen ose qelizat e poshtme, valët ultrasonike depërtojnë në matricën e biofilmit, duke e ndarë atë pa cenuar integritetin e strukturave ngjitur. Kjo metodë siguron riprodhueshmëri, minimizon rrezikun e kontaminimit dhe është veçanërisht efektive për aplikimet që kërkojnë heqje të saktë të biofilmit, si në studimet mikrobiologjike ose testimin e pajisjeve mjekësore. Lexoni më shumë se si UIP400MTP Sonicator shkëlqen skrapimin e qelizave!
Hielscher Ultrasonics prodhon homogjenizues tejzanor me performancë të lartë nga laboratori te madhësia industriale.