Protokolli i analizës MBEC duke përdorur Sonicatorin e pllakave 96 pusesh UIP400MTP
Analiza MBEC përdoret për të përcaktuar përqendrimin e agjentëve antimikrobikë të nevojshëm për të eliminuar biofilmat e formuar në kapakët e kunjit. Për të vlerësuar qëndrueshmërinë e biofilmit, biofilmat fillimisht duhet të shkëputen nga kapakët e kunjit të një pllake 96 pusesh. Sonication është metoda më e besueshme dhe më efikase për këtë shkëputje. Sonicatori me shumë pllakë UIP400MTP është projektuar posaçërisht për të përpunuar pllakat e analizës me efikasitet dhe komoditet maksimal, duke thjeshtuar dhe përshpejtuar analizat MBEC me performancë të lartë.
Sonication për shkëputjen e biofilmit
Sonicizimi është një hap thelbësor në analizat e Përqendrimit Minimal të Çrrënjosjes së Biofilmit (MBEC), duke mundësuar largimin efektiv të qelizave të biofilmit nga ngjitja e tyre sipërfaqësore. Biofilmat janë bashkësi të strukturuara në thelb të mikroorganizmave të mbështjellë në një matricë jashtëqelizore, gjë që i bën ata dukshëm më rezistent ndaj agjentëve antimikrobikë në krahasim me qelizat planktonike. Gjatë analizave MBEC, sonikimi përdor valët tejzanor për të gjeneruar kavitacion të kontrolluar, duke ndërprerë matricën e biofilmit dhe duke lëshuar qelizat e ngulitura në një pezullim. Ky hap siguron që qelizat e biofilmit të shpërndahen në mënyrë të barabartë në mjedisin e rikuperimit, duke lehtësuar vlerësimet e sakta të qëndrueshmërisë përmes metodave të shtrimit, hollimit ose spektrofotometrisë. Pa shkëputjen e duhur të biofilmit, përbërësit e mbetur të matricës mund të mbrojnë qelizat, duke çuar në nënvlerësimin e efikasitetit antimikrobik. Prandaj, sonikimi është i domosdoshëm për marrjen e vlerave të besueshme dhe të riprodhueshme MBEC, duke reflektuar potencialin e vërtetë të çrrënjosjes së agjentëve të testuar. Sonicatori me pllaka me shumë pllakë UIP400MTP lejon përgatitjen e lehtë të mostrës me fuqi të lartë në pllakat e analizës.
Sonicator me shumë pllakë UIP400MTP lehtëson përgatitjen e mostrës me fuqi të lartë në pllakat e analizës.
Protokolli i analizës së përqendrimit minimal të çrrënjosjes së biofilmit (MBEC).
Hapi 1: Formimi i biofilmit
- Përgatitni suspensionin bakterial:
Rritni bakteret në mjedise të përshtatshme për rritjen log-fazë.
Holloni kulturën bakteriale në një densitet optik të përcaktuar (p.sh., OD600 ~ 0,1). - Inokuloni pllakën me 96 pusi:
Shtoni suspensionin bakterial (p.sh., 150–200 µL) në çdo pus të një pllake standarde mikrotitërore 96 pusesh. - Ngjitni kapakun e kunjit:
Vendoseni kapakun e kunjit mbi pllakën e inokuluar për të lejuar formimin e biofilmit në sipërfaqet e kunjit. - Inkuboni pjatën:
Inkuboni pajisjen në një temperaturë të përshtatshme (p.sh. 37°C) për 24-48 orë pa u tundur për të nxitur rritjen e biofilmit.
Hapi 2: Trajtimi me agjentë antimikrobikë
- Përgatitni zgjidhje antimikrobike:
Përgatitni një sërë përqendrimesh antimikrobike në media të freskëta.
Ekspozoni biofilmat ndaj agjentëve antimikrobikë:
Hiqeni kapakun e kunjit nga kultura bakteriale dhe shpëlajeni atë me kripë sterile ose PBS për të hequr qelizat planktonike.
Vendoseni kapakun e kunjit në një pjatë të re 96 pusesh që përmban solucionet antimikrobike. - Inkuboni pjatën:
Inkuboni për një periudhë të caktuar (p.sh. 24 orë) për të lejuar ekspozimin antimikrobik.
Sonicator me shumë pllakë UIP400MTP për përgatitjen e mostrës me performancë të lartë
Hapi 3: Sonication me 96-pus Plate Sonicator UIP400MTP
Hapi i sonikacionit është kritik për shkëputjen e biofilmave nga kapakët e kunjit për të vlerësuar qëndrueshmërinë. Ndiqni këto hapa për sonikatorin UIP400MTP:
- Përgatitni konfigurimin:
Mbushni një pjatë të freskët 96 pusesh me mjet rikuperimi (p.sh., lëng mishi neutralizues ose medium i freskët i rritjes) në çdo pus. - Transferoni kapakun e kunjit:
Hiqeni kapakun e kunjit nga pllaka e trajtimit antimikrobik.
Shpëlajeni kapakun e kunjit me kripë sterile ose PBS për të hequr agjentët antimikrobikë të mbetur. - Vendosni pjatën dhe sonikatorin:
Ngjitni kapakun e kunjit në pllakën e mesme të rikuperimit.
Vendoseni pllakën e mesme të rikuperimit në platformën e sonikatorit UIP400MTP, duke u siguruar që pllaka të jetë në qendër dhe të qëndrueshme. - Rregulloni parametrat e tingullit:
Vendosni parametrat e tingullit në UIP400MTP (Cilësimet mund të rregullohen në biofilm):
Amplituda: 70–100%.
Koha e sonikimit: 1–3 minuta (rregulluar në bazë të qëndrueshmërisë së biofilmit) në modalitetin e ciklit. - Sonicate:
Filloni procesin e sonication. Dridhja tejzanor do të zhvendosë biofilmat nga sipërfaqet e kunjit në mediumin e rikuperimit. - Monitoroni procesin:
Përdorni sensorin e temperaturës që mbyllet për të monitoruar temperaturën e mostrës në puse. UIP400MTP mund të lidhet me një ftohës laboratori për ftohje. - Trajtimi pas sonikimit:
Transferoni menjëherë mediumin e rikuperimit (tani që përmban biofilma të shkëputur) në një pjatë të freskët sterile për analizë në rrjedhën e poshtme.
(A) Pllakë që përmban TSB me 2% glukozë e përdorur për formimin e biofilmit, rikuperimin e qelizave dhe
përcaktimi i MIC dhe MBCB; (B) Kapak me kunja për formimin e biofilmave stafilokoksikë. përcaktimi i MIC dhe MBCB; (B) Kapak me kunja për formimin e biofilmave stafilokoksikë.
Qelizat biofilmike të formuara në kunjat u zhvendosën me sonikacion (Teknologjia Hielscher Ultrasound) për 5 minuta në pllaka 96 pusesh që përmbajnë mjedis të freskët të kulturës për rikuperimin e qelizave.
(Foto dhe studim: ©de Oliveira et al., 2016)
Hapi 4: Vlerësimi i qëndrueshmërisë
Biofilma të shkëputur nga pllaka dhe kultura:
- Kryeni hollime serike të mediumit të rikuperimit dhe pllakës në agar për të numëruar njësitë formuese të kolonive (CFU).
Përndryshe, përdorni një analizë të qëndrueshmërisë kolorimetrike ose të bazuar në fluoreshencë. - Regjistroni rezultatet:
Përcaktoni MBEC si përqendrimin më të ulët të antimikrobikut që çrrënjosi qëndrueshmërinë e biofilmit të dallueshëm.
Dizajn, Prodhim dhe Konsulencë – Cilësi e prodhuar në Gjermani
Ultrasonikët Hielscher janë të njohur për cilësinë e tyre më të lartë dhe standardet e dizajnit. Qëndrueshmëria dhe funksionimi i lehtë lejojnë integrimin e qetë të ultrazërit tanë në objektet industriale. Kushtet e vështira dhe mjediset kërkuese trajtohen lehtësisht nga sonikatorët Hielscher.
Hielscher Ultrasonics është një kompani e certifikuar ISO dhe i kushton theks të veçantë ultratingujve me performancë të lartë që paraqesin teknologjinë më të fundit dhe lehtësinë ndaj përdorimit. Sigurisht, ultrasonikët Hielscher janë në përputhje me CE dhe plotësojnë kërkesat e UL, CSA dhe RoHs.
Drejtoni përgatitjen e mostrës në pllaka 96 pusesh dhe pllaka analize duke përdorur sonikatorin me pllaka me shumë pllakë UIP400MTP
Literatura / Referencat
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Microplate Sonicator Validated in Peer-Reviewed Proteomics Study
pyetjet e bëra shpesh
Çfarë është analiza MBEC?
Analiza e Përqendrimit Minimal të Çrrënjosjes së Biofilmit (MBEC) është një metodë e standardizuar e përdorur për të përcaktuar përqendrimin më të ulët të një agjenti antimikrobik që kërkohet për të zhdukur bakteret e lidhura me biofilmin. Ai përfshin rritjen e biofilmave në sipërfaqe të specializuara, ekspozimin e tyre ndaj përqendrimeve të ndryshme antimikrobike dhe vlerësimin e qëndrueshmërisë së qelizave të shkëputura pas ndërprerjes së biofilmit, zakonisht përmes sonikacionit, për të vlerësuar efikasitetin e trajtimit.
Cili është ndryshimi midis MBIC dhe MBEC?
Përqendrimi minimal frenues i biofilmit (MBIC) është përqendrimi më i ulët i një agjenti antimikrobik që kërkohet për të parandaluar formimin e biofilmit, ndërsa përqendrimi minimal i çrrënjosjes së biofilmit (MBEC) është përqendrimi më i ulët i nevojshëm për të çrrënjosur një biofilm të krijuar. MBIC fokusohet në parandalimin e biofilmave, ndërsa MBEC vlerëson efikasitetin e trajtimit ndaj biofilmave të pjekur.
Cilat pllaka përdoren zakonisht për analizat MBEC?
Pllakat e mikrotitrave që përdoren zakonisht për analizat MBEC janë zakonisht pllaka 96 pusesh të bëra nga polistireni ose polipropileni. Këto materiale sigurojnë një sipërfaqe të përshtatshme për formimin e biofilmit dhe janë kimikisht rezistente ndaj agjentëve antimikrobikë të testuar gjatë analizës. Pllakat e polistirenit preferohen gjerësisht për shkak të qartësisë së tyre optike, e cila është e dobishme për analizat në rrjedhën e poshtme të tilla si matjet spektrofotometrike ose të bazuara në fluoreshencë. Dizajni i këtyre pllakave përfshin kapakë të ndashëm me kunj, të cilët janë thelbësorë për analizën pasi në kunjat formohen biofilma që janë të zhytur në puset që përmbajnë media rritjeje. Pllakat e standardizuara, të tilla si ato në përputhje me protokollin e analizës MBEC, janë projektuar posaçërisht për të siguruar riprodhueshmëri dhe përputhshmëri me sonikatorin UIP400MTP ose pajisje të tjera përpunimi.
Çfarë janë pllakat me kapak PEG?
Pllakat me kapak PEG janë sisteme të specializuara të pllakave me shumë puse ku kapaku është i pajisur me kunja ose kunja të vogla polietileni glikol (PEG) që shtrihen në çdo pus. Këto kunja ofrojnë një sipërfaqe për formimin e biofilmit mikrobik në kushte të kontrolluara, duke imituar rritjen e biofilmit në botën reale. Dizajni lejon që biofilmat të zhvillohen në kunja ndërsa puset përmbajnë media të rritjes ose agjentë antimikrobikë, duke mundësuar testimin me performancë të lartë të ndjeshmërisë së biofilmit ndaj trajtimeve, të tilla si në analizat MBEC dhe MBIC.
Hielscher Ultrasonics prodhon homogjenizues tejzanor me performancë të lartë nga laboratori te madhësia industriale.