Transformimi gjenetik në qelizat bimore duke përdorur ultratinguj

Transformimi i ndërmjetësuar nga Agrobacterium i Asistuar nga Sonication (SAAT) është një metodë efikase për të infektuar qelizat bimore me gjene të huaj duke përdorur Agrobacterium si transportues. Kavitacioni tejzanor shkakton sonoporim, i cili mund të përshkruhet si mikro-plagosje e synuar e indeve bimore. Nëpërmjet këtyre mikro-plagëve të krijuara në mënyrë ultrasonike, vektorët e ADN-së dhe ADN-së mund të transportohen në mënyrë efikase në matricën e qelizave.

sonoporation – Transformimi i qelizave të përmirësuara me ultratinguj

Kur ultrazërit me frekuencë të ulët (afërsisht 20 kHz) aplikohen në pezullimet e qelizave, efektet e kavitacionit akustik shkaktojnë një përshkueshmëri kalimtare të membranës në indet qelizore. Ky efekt tejzanor njihet si sonoporation dhe përdoret për transferimin e gjeneve në qeliza ose inde.
Përparësitë e ultrazërit bazohen në parimin e tij mekanik jo-termik të punës, gjë që e bën sonikimin shpesh më të gjithanshëm dhe më pak të varur nga llojet e qelizave. Aplikimi i gjithanshëm i sonoporation hap mundësinë e përdorimit të bimëve transgjenike, të cilat kanë potencial të rëndësishëm në bioprodhimin e proteinave komplekse terapeutike njerëzore. Bioreaktorë të tillë me bazë bimore mund të manipulohen lehtë gjenetikisht, parandalojnë ndotjen e mundshme me patogjenë njerëzorë, nuk dëmtojnë bakteret ndërmjetësuese të transformimit (p.sh. Agrobacterium) dhe janë një metodë e lirë dhe efikase e biosintezës.

Transformimi i qelizave me ndihmën tejzanor

Sonication është një teknikë që aplikon valë ultratinguj me frekuencë të ulët për të trazuar grimcat në tretësirë, për të përzier zgjidhjet, duke rritur kështu shpejtësinë e transferimit dhe shpërbërjes së masës. Njëkohësisht, sonikimi mund të largojë gazrat e tretur nga lëngjet. Në transformimin e bimëve, sonikimi do të shkaktojë formimin e mikroplagave në indet bimore dhe do të përmirësojë shpërndarjen e ADN-së së zhveshur në protoplastin e bimës.

Për transformimin gjenetik, Transformimi i ndërmjetësuar nga Agrobakteriumi i Ndihmuar nga Sonication (SAAT) është metoda e preferuar dhe ka një efikasitet dukshëm më të lartë se sonikimi i përdorur për të transferuar vektorët e ADN-së dhe ADN-së të zhveshur direkt në protoplast. Studime të shumta kanë treguar se transformimi i ndërmjetësuar nga Agrobacterium (SAAT) i ndihmuar me sonikacion mund të përdoret për të nxitur përçarje mekanike dhe formimin e plagëve në qelizat e bimëve nga valët ultratinguj dhe kavitacionin akustik që rezulton. Një trajtim i shkurtër me ultratinguj krijon mikro-plagë në sipërfaqen e eksplanteve. Pasi qelizat e plagosura do të lejojnë depërtimin e Agrobacterium në pjesën më të thellë të indeve bimore, duke rritur kështu gjasat që qelizat bimore të infektohen. Për më tepër, komponimet fenolike të sekretuara përmirësojnë transformimin. Mikro-plagët e krijuara në mënyrë ultrasonike e bëjnë më të realizueshëm depërtimin e eksplantit nga bakteret. SAAT u përdor me sukses për transformimin gjenetik në speciet bimore të konsideruara veçanërisht si rezistente ndaj Agrobacterium.
Duke qenë një metodë shumë e thjeshtë dhe e lirë, si dhe përmirësimi i ndjeshëm i transferimit të gjeneve të ndërmjetësuara nga Agrobacterium janë avantazhet kryesore të SAAT. Përveç aplikimit të suksesshëm të SAAT në transformimin e Chenopodium rubrum L. dhe Beta vulgaris L., kjo qasje është aplikuar edhe në prodhimin e holotoksinës rekombinante Escherichia coli të llojit të egër, të qëndrueshme ndaj nxehtësisë dhe ndihmësve të vaksinës mutant Escherichia coli LT në Nicotiana tabacum. , në të cilin titrat më të lartë sistematikë LT-B-specifik IgG u zbuluan te shpendët.
(krh. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka dhe R. Baranski, 2014)

Procedura e përgjithshme për transferimin e gjeneve nëpërmjet sonoporimit në qelizat bimore

1. Përgatitja e materialit gjenetik: Filloni duke përgatitur materialin gjenetik që dëshironi të futni në qelizat bimore. Kjo mund të jetë ADN plazmide, ARN ose acide të tjera nukleike.
2. Izolimi i qelizave bimore: Izoloni qelizat bimore që dëshironi të synoni. Në varësi të eksperimentit tuaj, këto qeliza mund të izolohen nga indet ose kulturat bimore.
3. Pezullimi i qelizave: Pezulloni qelizat bimore në një mjedis ose tampon të përshtatshëm. Kjo është thelbësore për të siguruar që qelizat janë të shëndetshme dhe në një gjendje të favorshme për marrjen e gjeneve.
4. Konfiguro Sonicatorin tuaj: Përgatitni sonikatorin tuaj të llojit të sondës duke vendosur parametra të paracaktuar me sonik, si amplituda, koha, energjia dhe temperatura. Zhytni sondën tejzanor në suspensionin e qelizës.
5. Sonicizimi: Filloni procedurën e sonikimit. Lëkundja e shpejtë e majës së sondës gjeneron flluska të kavitacionit në lëng. Këto flluska zgjerohen dhe shemben për shkak të valëve ultrasonike, duke krijuar forca mekanike dhe mikrostream në pezullim.
6. Sonoporation: Forcat mekanike dhe mikrotransmetimi i krijuar nga kavitacioni krijojnë përkohësisht pore dhe vrima në membranat e qelizave bimore. Materiali gjenetik i pranishëm në suspension mund të hyjë në qelizat bimore përmes këtyre poreve.
7. Inkubacioni: Pas trajtimit me sonoporacion, inkuboni qelizat bimore për t'i lejuar ato të rikuperojnë dhe të stabilizojnë membranat e tyre. Ky është një hap vendimtar për të siguruar mbijetesën e qelizave dhe transferimin e suksesshëm të gjeneve.

Transferimi i gjeneve nëpërmjet Agrobacterium ose Liposomes

Ekzistojnë dy forma të zakonshme për të transfektuar qelizën bimore. Ata përdorin ose agrobacterium, një gjini bakteresh Gram-negative, ose liposome si bartës të materialit gjenetik.

• Sonoporimi i ndërmjetësuar nga Agrobacterium: Agrobacterium tumefaciens është një bakter që përdoret zakonisht në inxhinierinë gjenetike të bimëve. Në këtë metodë, ADN-ja plazmidike që përmban gjenin e dëshiruar futet në Agrobacterium, i cili më pas përzihet me qelizat bimore. Pezullimi i qelizave i nënshtrohet sonoporimit duke përdorur një sonikator të tipit sondë. Energjia ultrasonike rrit transferimin e materialit gjenetik nga Agrobacterium në qelizat bimore. Kjo metodë përdoret gjerësisht për modifikimin gjenetik të bimëve.
• Sonoporimi i ndërmjetësuar nga liposome: Liposomet janë vezikula me bazë lipide që mund të mbajnë material gjenetik. Në këtë metodë, liposomet e ngarkuara me ADN plazmide ose acide të tjera nukleike përzihen me qelizat bimore. Sonoporimi duke përdorur një sonikator të tipit sondë përdoret për të lehtësuar marrjen e liposomeve nga qelizat bimore. Ekografia prish shtresat e dyfishta lipidike të liposomeve, duke lëshuar materialin gjenetik në qelizat bimore. Kjo qasje është e dobishme për studimet kalimtare të shprehjes së gjeneve në qelizat bimore.

Përfitimet e vërtetuara shkencërisht të transformimit të ndërmjetësuar nga agrobakteri me ndihmën e zërit (SAAT)

Transformimi i ndërmjetësuar nga Agrobacterium-Assisted-Sonication (SAAT) është aplikuar në lloje të shumta bimore. Një trajtim i shkurtër dhe relativisht i butë me ultratinguj i kulturave të qelizave bimore shkakton sonoporim, i cili më pas lejon një depërtim të thellë të Agrobacterium si transportues i gjeneve. Më poshtë mund të lexoni studime shembullore që demonstrojnë efektet e dobishme të SAAT.

Transformimi i asistuar me ultratinguj i Ashwagandha

Për të përmirësuar efikasitetin e transformimit në W. somnifera (i njohur si ashwagandha ose qershia e dimrit), Dehdashti dhe kolegët (2016) hetuan përdorimin e acetosiringonit (AS) dhe sonikacionit.
Acetosyringoni (AS) u shtua në tre faza: Kultura e lëngshme Agrobacterium, Infeksioni Agrobacterium dhe bashkëkulturimi i eksplanteve me Agrobacterium. Shtimi i 75 μM AS në kulturën e lëngshme të Agrobacterium u gjet se ishte optimale për induksionin e gjeneve vir.
Aplikimi shtesë i sonication (SAAT) rezultoi në shprehjen më të lartë të gjenit. Shprehja e gjenit gusA në rrënjët me qime u zbulua se ishte më e mira kur gjethet dhe majat e lastarëve u sonikuan për 10 dhe 20, respektivisht. Efikasiteti i transformimit të protokollit të përmirësuar u regjistrua përkatësisht 66.5 dhe 59.5% në rastin e eksplanteve me majën e gjetheve dhe lastarëve. Kur krahasohet me protokollet e tjera, efikasiteti i transformimit të këtij protokolli të përmirësuar u zbulua të ishte 2,5 herë më i lartë për gjethet dhe 3,7 herë më shumë për majat e xhirimeve. Analizat Southern blot konfirmuan 1-2 kopje të transgjenit gusA në linjat W1-W4, ndërsa 1-4 kopje transgjene u zbuluan në linjën W5 të krijuar nga protokolli i përmirësuar.

Efekti i kohëzgjatjes së transformimit të ndërmjetësuar nga Agrobacterium (SAAT) i ndihmuar nga sonikimi në frekuencën e transformimit të eksplanteve të gjethes (a) dhe majës së kërcitjes (b) të W. somnifera
(studim dhe grafik: © Dehdashti et al., 2016)

Transformimi i pambukut me ndihmën tejzanor

Hussain et al. (2007) demonstrojnë efektet e dobishme të transformimit të pambukut të ndihmuar nga sonication. Kavitacioni akustik i shkaktuar nga ekografia me frekuencë të ulët krijon mikroplagë në dhe nën sipërfaqen e indeve bimore (sonoporation) dhe lejon Agrobacterium të udhëtojë më thellë dhe plotësisht në të gjithë indin bimor. Kjo mënyrë lënduese rrit probabilitetin e infektimit të qelizave bimore të shtrira më thellë në inde. Për të vlerësuar efikasitetin e transformimit të SAAT, u mat shprehja e gjenit GUS. Sistemi i raportuesit GUS është një sistem gjen raportues, veçanërisht i dobishëm në biologjinë molekulare të bimëve dhe mikrobiologjinë. Duke rregulluar parametra të ndryshëm SAAT, shprehja kalimtare e GUS në pambuk duke përdorur embrione të pjekur si eksplant u përmirësua ndjeshëm. GUS u zbulua fillimisht 24 orë pas inkubimit të eksplanteve dhe nga 48 orë, shprehja GUS ishte shumë intensive, e cila shërbeu si një tregues i dobishëm i transformimit të suksesshëm të eksplantit të pambukut pas transformimit të ndërmjetësuar nga Agrobacterium (SAAT) me ndihmën e sonikacionit. Krahasimi i teknikave të ndryshme të transformimit (përkatësisht biolistic, Agro, BAAT, SAAT), transformimi i ndërmjetësuar nga Agrobacterium i ndihmuar nga sonication (SAAT) tregoi rezultatet më të mira të transformimit.

Zgjedhja e procedurës së transformimit në bazë të shprehjes kalimtare të GUS. Transformimi i ndërmjetësuar nga Agrobacterium i ndihmuar nga sonication (SAAT) tregon një shprehje kalimtare dukshëm më të lartë.
(studim dhe grafik: © Hussain et al., 2007)

Zgjidhje tejzanor me performancë të lartë për Sonoporation dhe SAAT

Hielscher Ultrasonics ka një përvojë të gjatë në zhvillimin dhe prodhimin e ultrazërit me performancë të lartë për laboratorët, objektet kërkimore si dhe prodhimin industrial me xhiro shumë të larta. Për mikrobiologjinë dhe shkencën e jetës, Hielscher ofron zgjidhje të ndryshme për të përmbushur kërkesat e ndryshme të nevojshme për inde specifike dhe trajtimet e tyre. Për sonifikimin e njëkohshëm me ultratinguj të mostrave të shumta, Hielscher ofron UIP400MTP për pllaka me shumë pus, VialTweeter për sonikimin e deri në 10 shisheve (p.sh. tuba Eppendorf) ose CupHorn tejzanor. Ultrasonikët e tipit sonda janë të disponueshëm nga 50 deri në 400 vat si homogjenizues laboratorik, ndërsa sistemet industriale mbulojnë diapazonin e fuqisë nga 500 vat deri në 16 kW.
Ju lutemi na kontaktoni dhe na tregoni për kërkesat tuaja të aplikimit dhe procesit. Stafi ynë me përvojë të mirë do të jetë i lumtur të rekomandojë ultrasonikatorin më të përshtatshëm për procesin tuaj biologjik.
Tabela e mëposhtme ju jep një tregues të kapacitetit të përafërt të përpunimit të ultrasonikëve tanë: