Transformimi gjenetik në qelizat bimore duke përdorur ultratinguj

Transformimi i ndërmjetësuar nga Agrobacterium me ndihmën e sonikimit (SAAT) është një metodë efikase për të infektuar qelizat bimore me gjene të huaja duke përdorur Agrobacterium si transportues. Kavitacioni ultrasonik shkakton sonoporim, i cili mund të përshkruhet si krijim i synuar i mikroplagëve në indin bimor. Nëpërmjet këtyre mikroplagëve të krijuara nga ultratingujt, ADN-ja dhe vektorët e ADN-së mund të transportohen me efikasitet në matricën qelizore.

Sonoporimi – transformimi qelizor i përmirësuar me ultratinguj

Kur ultratingujt me frekuencë të ulët (afërsisht 20kHz) aplikohen në suspensione qelizore, efektet e kavitacionit akustik shkaktojnë një rritje kalimtare të përshkueshmërisë së membranave në indet qelizore. Ky efekt ultrasonik njihet si sonoporim dhe përdoret për transferimin e gjeneve në qeliza ose inde.
Përparësitë e trajtimit me ultratinguj bazohen në parimin e tij mekanik jotermik të veprimit, i cili e bën sonikimin shpesh më të gjithanshëm dhe më pak të varur nga llojet e qelizave. Zbatimi i gjithanshëm i sonoporimit hap mundësinë e përdorimit të bimëve transgjenike, të cilat kanë potencial të konsiderueshëm në bioprodhimin e proteinave terapeutike komplekse njerëzore. Bioreaktorë të tillë me bazë bimore mund të manipulohen lehtësisht gjenetikisht, parandalojnë ndotjen e mundshme me patogjenë njerëzorë, nuk dëmtojnë bakteret që ndërmjetësojnë transformimin (p.sh. Agrobacterium) dhe përbëjnë një metodë të lirë dhe efikase të biosintezës.

Transformimi qelizor me ndihmën e ultratingujve

Sonikimi është një teknikë që aplikon valë ultrasonike me frekuencë të ulët për të vënë në lëvizje grimcat në tretësirë dhe për të përzier tretësirat, duke rritur kështu shpejtësinë e transferimit të masës dhe të tretjes. Njëkohësisht, sonikimi mund të largojë gazrat e tretura nga lëngjet. Në transformimin e bimëve, sonikimi do të shkaktojë formimin e mikroplagëve në indin bimor dhe do të përmirësojë futjen e ADN-së së zhveshur në protoplastin bimor.

Për transformimin gjenetik, transformimi i ndërmjetësuar nga Agrobacterium me ndihmën e sonikimit (SAAT) është metoda e parapëlqyer dhe ka efikasitet dukshëm më të lartë se sonikimi i përdorur për të transferuar ADN-në e zhveshur dhe vektorët e ADN-së drejtpërdrejt në protoplast. Studime të shumta kanë treguar se transformimi i ndërmjetësuar nga Agrobacterium me ndihmën e sonikimit (SAAT) mund të përdoret për të shkaktuar çarje mekanike dhe formim plagësh në qelizat bimore nëpërmjet valëve ultrasonike dhe kavitacionit akustik që rezulton prej tyre. Një trajtim i shkurtër me ultratinguj krijon mikroplagë në sipërfaqen e eksplanteve. Qelizat e plagosura do të lejojnë depërtimin e Agrobacterium në pjesën më të thellë të indeve bimore, duke rritur kështu gjasat që qelizat bimore të infektohen. Përveç kësaj, përbërjet fenolike të sekretuara përmirësojnë transformimin. Mikroplagët e krijuara nga ultratingujt e bëjnë gjithashtu më të realizueshëm depërtimin e baktereve në eksplant. SAAT u përdor me sukses për transformimin gjenetik në specie bimore që konsiderohen veçanërisht rezistente ndaj Agrobacterium.
Përparësitë kryesore të SAAT janë thjeshtësia dhe kostoja shumë e ulët e metodës, si dhe përmirësimi i konsiderueshëm i transferimit të gjeneve të ndërmjetësuar nga Agrobacterium. Përveç zbatimit të suksesshëm të SAAT në transformimin e Chenopodium rubrum L. dhe Beta vulgaris L., kjo qasje është zbatuar edhe për prodhimin në Nicotiana tabacum të holotoksinës rekombinante termolabile të tipit të egër të Escherichia coli dhe të adjuvantëve të vaksinave LT të Escherichia coli mutante, ku titrat më të lartë sistemikë të IgG-së specifike për LT-B u zbuluan te shpendët.
(krahaso Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka dhe R. Baranski, 2014)

Procedura e përgjithshme për transferimin e gjeneve nëpërmjet sonoporimit në qelizat bimore

1. Përgatitja e materialit gjenetik: Filloni duke përgatitur materialin gjenetik që dëshironi të futni në qelizat bimore. Ky mund të jetë ADN plazmidike, ARN ose acide të tjera nukleike.
2. Izolimi i qelizave bimore: Izoloni qelizat bimore që dëshironi të synoni. Në varësi të eksperimentit tuaj, këto qeliza mund të izolohen nga indet ose kulturat bimore.
3. Suspensioni qelizor: Pezulloni qelizat bimore në një mjedis ushqyes ose tretësirë tampon të përshtatshme. Kjo është thelbësore për të siguruar që qelizat të jenë të shëndetshme dhe në një gjendje të favorshme për marrjen e gjeneve.
4. Konfiguroni sonikatorin tuaj: Përgatitni sonikatorin tuaj të tipit me sondë duke paracaktuar parametrat e sonikimit, si amplituda, koha, energjia dhe temperatura. Zhytni sondën ultrasonike në suspensionin qelizor.
5. Sonikimi: Filloni procedurën e sonikimit. Lëkundja e shpejtë e majës së sondës gjeneron flluska kavitacioni në lëng. Këto flluska zgjerohen dhe shemben për shkak të valëve ultrasonike, duke krijuar forca mekanike dhe mikrorrjedha në suspension.
6. Sonoporimi: Forcat mekanike dhe mikrorrjedhat e gjeneruara nga kavitacioni krijojnë përkohësisht pore dhe vrima në membranat e qelizave bimore. Materiali gjenetik i pranishëm në suspension mund të hyjë në qelizat bimore përmes këtyre poreve.
7. Inkubimi: Pas trajtimit me sonoporim, inkuboni qelizat bimore për t’u mundësuar të rikuperohen dhe të stabilizojnë membranat e tyre. Ky është një hap vendimtar për të siguruar mbijetesën e qelizave dhe transferimin e suksesshëm të gjeneve.

Transferimi i gjeneve përmes Agrobacterium ose liposomeve

Ekzistojnë dy mënyra të zakonshme për transfektimin e qelizave bimore. Ato përdorin si bartës të materialit gjenetik ose agrobacterium, një gjini bakteresh Gram-negative, ose liposome.

• Sonoporimi i ndërmjetësuar nga Agrobacterium: Agrobacterium tumefaciens është një bakter që përdoret zakonisht në inxhinierinë gjenetike të bimëve. Në këtë metodë, DNA-ja plazmidike që përmban gjenin e dëshiruar futet në Agrobacterium, i cili më pas përzihet me qelizat bimore. Suspensioni qelizor i nënshtrohet sonoporimit duke përdorur një sonikator të tipit me sondë. Energjia ultrasonike përmirëson transferimin e materialit gjenetik nga Agrobacterium te qelizat bimore. Kjo metodë përdoret gjerësisht për modifikimin gjenetik të bimëve.
• Sonoporimi i ndërmjetësuar nga liposomet: Liposomet janë vezikula me bazë lipidike që mund të bartin material gjenetik. Në këtë metodë, liposomet e ngarkuara me DNA plazmidike ose acide të tjera nukleike përzihen me qelizat bimore. Sonoporimi me anë të një sonikatori të tipit me sondë përdoret për të lehtësuar marrjen e liposomeve nga qelizat bimore. Ultratingulli prish dyshtresat lipidike të liposomeve, duke çliruar materialin gjenetik në qelizat bimore. Kjo qasje është e dobishme për studimet e shprehjes kalimtare të gjeneve në qelizat bimore.

Përfitimet e vërtetuara shkencërisht të transformimit të ndërmjetësuar nga Agrobacterium dhe të asistuar nga sonikimi (SAAT)

Transformimi i ndërmjetësuar nga Agrobacterium dhe i asistuar nga sonikimi (SAAT) është zbatuar në shumë lloje bimësh. Një trajtim ultrasonik i shkurtër dhe relativisht i butë i kulturave të qelizave bimore shkakton sonoporim, i cili më pas mundëson depërtimin e thellë të Agrobacterium si transportues gjenesh. Më poshtë mund të lexoni studime ilustruese që dëshmojnë efektet e dobishme të SAAT.

Transformimi i ashvagandës i asistuar me ultratinguj

Për të përmirësuar efikasitetin e transformimit te W. somnifera (e njohur si ashwagandha ose qershia dimërore), Dehdashti dhe kolegët (2016) hulumtuan përdorimin e acetosiringonit (AS) dhe sonikimit.
Acetosiringoni (AS) u shtua në tri faza: në kulturën e lëngshme të Agrobacterium, gjatë infektimit me Agrobacterium dhe gjatë bashkëkultivimit të eksplanteve me Agrobacterium. Shtimi i 75 μM AS në kulturën e lëngshme të Agrobacterium rezultoi optimal për induktimin e gjeneve vir.
Aplikimi shtesë i sonikimit (SAAT) dha shprehjen më të lartë të gjeneve. Shprehja e gjenit gusA në rrënjët me qime rezultoi më e mira kur gjethet dhe majat e lastarëve u sonikuan përkatësisht për 10 dhe 20s. Efikasiteti i transformimit me protokollin e përmirësuar u regjistrua në 66,5 dhe 59,5% përkatësisht për eksplantet e gjetheve dhe të majave të lastarëve. Krahasuar me protokollet e tjera, efikasiteti i transformimit me këtë protokoll të përmirësuar rezultoi 2,5 herë më i lartë për gjethet dhe 3,7 herë më i lartë për majat e lastarëve. Analizat Southern blot konfirmuan 1–2 kopje të transgjenit gusA në linjat W1-W4, ndërsa në linjën W5 të krijuar me protokollin e përmirësuar u zbuluan 1–4 kopje të transgjenit.

Efekti i kohëzgjatjes së transformimit të ndërmjetësuar nga Agrobacterium dhe të asistuar nga sonikimi (SAAT) në frekuencën e transformimit të eksplanteve të gjetheve (a) dhe të majave të lastarëve (b) të W. somnifera
(studimi dhe grafiku: © Dehdashti et al., 2016)

Transformimi i pambukut i asistuar nga ultratingujt

Hussain et al. (2007) demonstrojnë efektet e dobishme të transformimit të pambukut të asistuar nga sonikimi. Kavitacioni akustik i shkaktuar nga ultratingujt me frekuencë të ulët krijon mikroplagë në sipërfaqen e indit bimor dhe nën të (sonoporim) dhe i mundëson Agrobacterium të depërtojë më thellë dhe të përshkojë tërësisht indin bimor. Kjo mënyrë e krijimit të plagëve rrit probabilitetin e infektimit të qelizave bimore që ndodhen më thellë në ind. Për të vlerësuar efikasitetin e transformimit me SAAT, u mat shprehja e gjenit GUS. Sistemi raportues GUS është një sistem me gjen raportues, veçanërisht i dobishëm në biologjinë molekulare të bimëve dhe në mikrobiologji. Duke rregulluar parametra të ndryshëm të SAAT, shprehja kalimtare e GUS në pambuk, duke përdorur embrione të pjekura si eksplante, u rrit ndjeshëm. GUS u zbulua për herë të parë 24h pas inkubimit të eksplanteve dhe deri në 48h, shprehja e GUS ishte shumë intensive, gjë që shërbeu si tregues i dobishëm i transformimit të suksesshëm të eksplantit të pambukut pas transformimit të ndërmjetësuar nga Agrobacterium dhe të asistuar nga sonikimi (SAAT). Në krahasimin e teknikave të ndryshme të transformimit (përkatësisht biolistike, Agro, BAAT, SAAT), transformimi i ndërmjetësuar nga Agrobacterium dhe i asistuar nga sonikimi (SAAT) tregoi rezultate transformimi shumë më të mira se të gjitha teknikat e tjera.

Zgjedhja e procedurës së transformimit në bazë të shprehjes kalimtare të GUS. Transformimi i ndërmjetësuar nga Agrobacterium dhe i asistuar nga sonikimi (SAAT) tregon një shprehje kalimtare ndjeshëm më të lartë.
(studimi dhe grafiku: © Hussain et al., 2007)

Zgjidhje ultrasonike me performancë të lartë për sonoporim dhe SAAT

Hielscher Ultrasonics ka përvojë shumëvjeçare në zhvillimin dhe prodhimin e sonikatorëve me performancë të lartë për laboratorë, qendra kërkimore, si dhe për prodhim industrial me kapacitete përpunimi shumë të larta. Për mikrobiologjinë dhe shkencat e jetës, Hielscher ofron zgjidhje të ndryshme për të përmbushur kërkesat e ndryshme të indeve specifike dhe të trajtimeve të tyre. Për trajtimin e njëkohshëm me ultratinguj të shumë mostrave, Hielscher ofron UIP400MTP për pllaka me shumë puse, VialTweeter për sonikimin e deri në 10 flakonëve (p.sh., tuba Eppendorf) ose CupHorn ultrasonik. Sonikatorët me sondë janë të disponueshëm me fuqi nga 50 deri në 400 vat si homogjenizues laboratorikë, ndërsa sistemet industriale mbulojnë intervalin e fuqisë nga 500 vat deri në 16kW.
Ju lutemi, na kontaktoni dhe na tregoni për aplikimin tuaj dhe kërkesat e procesit. Stafi ynë me përvojë të gjerë do t’ju rekomandojë me kënaqësi sonikatorin më të përshtatshëm për procesin tuaj biologjik.
Tabela e mëposhtme ju jep një orientim për kapacitetin e përafërt të përpunimit të sonikatorëve tanë: