Sinteza e peptideve me ultratinguj duke përdorur teknikën TAGGING

Sinteza e peptideve është një shtyllë e kërkimit dhe zhvillimit farmaceutik, megjithatë metodat konvencionale – sinteza e peptideve në fazë të ngurtë (SPPS) dhe çiftimi klasik në fazë tretësire – vazhdojnë të kërkojnë shumë punë, të shpërdorojnë reagentë dhe të jenë të vështira për t’u kaluar në shkallë më të madhe. Një alternativë më efikase është shfaqur nga kombinimi i dy strategjive ortogonale: teknika TAGGING (grup ankorues i përkohshëm) për ndërtimin e peptideve në fazë tretësire dhe përpunimi me ultratinguj (sonokimik) për përshpejtimin e hapave të çiftimit, heqjes së grupeve mbrojtëse dhe përpunimit pas reaksionit. Së bashku, ato mundësojnë prodhimin e peptideve terapeutike nga sasi në gram deri në shkallë të gjerë – siç është lipopeptidi antibiotik/antikancerogjen lipobactin – me pastërti të lartë, më pak nevojë për pastrim dhe shumë më pak veprime manuale.

Çfarë përparësish ofron sinteza e peptideve me ultratinguj?

• Ekonomia e fazës së tretësirës: Reaksionet zhvillohen në tretësirë me konsum dukshëm më të ulët të aminoacideve sesa në sintezën e peptideve në fazë të ngurtë
• Pastrimi me anë të filtrimit: Peptidi i lidhur me TAG precipiton në tretës polarë, kështu që ndërmjetësit izolohen me filtrim të thjeshtë – nuk nevojitet kromatografi në kolonë apo karakterizim në çdo hap.
• Kursime shumë të mëdha të punës: Eliminimi i pastrimit të ndërmjetëm dhe i kontrolleve spektrale kursen një numër të konsiderueshëm orësh pune njerëzore gjatë një fushate të plotë sinteze.
• Përshpejtimi sonokimik: Sonikimi shkurton çdo hap kritik – heqjen e grupit mbrojtës Fmoc, çiftimin në zinxhirin anësor, ciklizimin dhe heqjen e të gjitha grupeve mbrojtëse – pa cenuar selektivitetin.
• Rendimente të larta, pastërti e lartë: Çdo çiftim fragmentesh dhe ndërtimi përfundimtar i lipobactin kryhen me rendiment të lartë; heqja e të gjitha grupeve mbrojtëse jep produktin e synuar me rendiment ~83 %.
• Gatishmëria për prodhim në shkallë të gjerë: Teknika TAGGING përshkruhet shprehimisht si një teknikë që mundëson përgatitjen në shkallë të gjerë të peptideve me pastërtinë më të lartë, duke e bërë atë një rrugë praktike për përftimin e sasive në gram dhe kilogram të lipopeptideve me rëndësi terapeutike.
• Përputhshmëria e plotë me metodat: Kjo qasje është plotësisht e përputhshme me SPPS konvencionale dhe kiminë në fazë tretësire, kështu që strategjitë ekzistuese të grupeve mbrojtëse (Fmoc, Alloc, Pbf, tBu) dhe agjentët e çiftimit (T3P, HATU, COMU, DIC/DMAP) përdoren pa ndryshime.

Çfarë është teknika TAGGING?

Në qasjen TAG, një fragment peptidik ankorohet në mënyrë kovalente te një grup ankorues (TAG) i heqshëm, i ngjashëm me rrëshirën, i cili mbetet në tretësirë. Kjo lejon që zinxhiri në rritje të trajtohet si një peptid në fazë të ngurtë, por në fazë të lëngët:

• Pas çdo çiftimi ose heqjeje të grupeve mbrojtëse, peptidi i lidhur me TAG rikuperohet si lëndë e ngurtë me filtrim të thjeshtë ose precipitim në mjedise polare/me antitretës, ndërsa papastërtitë e tretshme dhe nënproduktet largohen me larje.
• Meqë peptidi mbetet i lidhur me lidhësin, kromatografia në kolonë dhe karakterizimi i plotë i çdo ndërmjetësi eliminohen në masë të madhe, duke kursyer kohë dhe punë njerëzore të konsiderueshme.
• Reaksionet mund të kryhen në fazë tretësire, duke përdorur shumë më pak aminoacide sesa SPPS, dhe produkti përfundimtar çlirohet me shkëputjen e grupit TAG afër fundit të sintezës.

 
Për lipobactin, retrosinteza përdori tre fragmente – Fmoc-Ala-Arg-TAG, Alloc-Thr(Ile-Fmoc)-OH dhe fragmentin lipidik C₁₁H₂₃CONH-Ile-Ser(OᵗBu)-OH – të çiftuara përmes një strategjie kondensimi të fragmenteve për të përftuar peptidin e gjatë me rendimente shumë të larta. (shih Ramya et al., 2025)

Sinteza e plotë e peptidit lipobactin e ndihmuar nga TAG përshpejtohet nga sonikimi.
(Studimi: Ramya et al., 2025)

Si e përmirëson sonikimi sintezën e peptideve në fazë të tretur

Trajtimi me ultratinguj përdoret për të intensifikuar dhe shkurtuar hapat kyç në fazë të tretur. Në sintezën e lipobactin, siç përshkruhet nga Ramya et al. (2025), sonikimi zbatohet për:

Meqë kimia TAG tashmë jep ndërmjetës në formën e lëndëve të ngurta të filtrueshme, trajtimi me ultratinguj dhe TAGGING plotësojnë njëri-tjetrin: ultratingujt përshpejtojnë transferimin e masës, përzierjen dhe kinetikën e reaksionit, ndërsa ankora e mban peptidin si një lëndë të ngurtë të rikuperueshme për një rrjedhë pune të pastër me përdorim të kufizuar të kromatografisë.

Rritja e lehtë e shkallës së prodhimit të peptideve me pastërti të lartë përmes sonikimit

Një sfidë e shpeshtë gjatë kalimit të proceseve të peptideve dhe barnave peptidike nga tavolina e laboratorit në prodhim është ruajtja e efektit sonokimik në vëllime më të mëdha dhe në rrjedhje të vazhdueshme. Hielscher e trajton këtë me një gamë të pandërprerë procesorësh ultrasonikë, nga shkalla laboratorike deri në shkallën e plotë industriale, duke ofruar fuqi të validuar e të riprodhueshme dhe kontroll të dokumentuar të procesit.
 

Sonikatori industrial UIP4000hdT (4000W, 20kHz) për sintezë të peptideve të përmirësuar me ultratinguj

Literatura / Referencat

• M. Ramya, Veeranjaneyulu Avula, S. Nandeesh, B. Kirankumar, G. Nagendra (2025): TAG assisted and ultrasonication mediated total synthesis of lipobactin. Results in Chemistry, Volume 18, 2025, 102842.
• Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
• Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
• M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.