Përgatitja e mostrave me kapacitet të lartë për diagnostikën mitokondriale
Diagnostika mitokondriale në kërkim dhe klinika kryhet duke përdorur teknika të ndryshme si sekuencimi, PCR dhe analizat biokimike. Këto metoda përdoren për të identifikuar mutacionet e ADN-së dhe për të matur funksionin mitokondrial. Sekuencimi ndihmon në zbulimin e mutacioneve gjenetike, ndërsa PCR mund të kuantifikojë sekuenca specifike të ADN-së. Analizat biokimike vlerësojnë funksionalitetin e proteinave dhe enzimeve mitokondriale.
Diagnostikimi i sëmundjeve mitokondriale është veçanërisht i vështirë për shkak të variabilitetit të theksuar klinik të këtyre sëmundjeve, si dhe për shkak të ndërveprimit kompleks midis dy genomeve me trashëgimi të ndryshme: ADN-ja mitokondriale (mtDNA) dhe genomi bërthamor.
Ekstraktimi dhe fragmentimi i ADN-së duke përdorur sonikimin
Ekstraktimi i ADN-së nga indet muskulore është veçanërisht i dobishëm kur dyshohen ndryshime specifike të indit në mtDNA. Këto ndryshime mund të përfshijnë delecione të mtDNA-së në oftalmopleginë eksternë progresive kronike (CPEO), mutacione pikësore të mtDNA-së në miopati mitokondriale, ose deplecion të mtDNA-së në sindromën Alpers. ADN-ja e ekstraktuar nga indet muskulore mund të përdoret më pas për teste të ndryshme gjenetike, si Southern blot dhe PCR me gamë të gjerë për delecione, PCR në kohë reale për deplecion, ose sekuencim për mutacione pikësore.
Sonikimi, duke përdorur valë ultrasonike intensive, aplikohet për disa aplikime në diagnostikën mitokondriale. Ai përdoret për të lyer qelizat për të ekstraktuar përmbajtjen intracelulare si mitokondritë dhe ADN, për të prerë ADN-në si mtDNA dhe nDNA për sekuencim, dhe për të homogjenizuar mostrat.
Sonikator i pllakave UIP400MTP për përgatitjen e mostrave me kapacitet të lartë sonikon uniformisht mostrat në pllaka me shumë vrima dhe pllaka me 96 vrima
Si të izolohen mitokondritë nga qelizat dhe indet
Izolimi mitokondrial përfshin dy hapa thelbësorë: shkatërrimin e qelizave për të lëshuar përmbajtjen e tyre, dhe përdorimin e centrifugimit diferencial për të ndarë dhe rikuperuar fraksionet mitokondriale.
Sonikimi
Sonikatorët Hielscher janë të pajtueshëm me bufferat dhe kitet standarde të lizës, duke i bërë ata të përshtatshëm për izolimin e mitokondrive. Sonikimi shërben për dy qëllime kryesore:
- Liza e qelizave: Valët ultrasonike shkatërrojnë membranat qelizore, duke lëshuar përmbajtjen intracelulare.
- Shkatërrimi i mitokondrive: Sonikimi në një hap tjetër mund të hapë mitokondritë për të lëshuar proteinat mitokondriale ose ADN-në mitokondriale.
- Fragmentimi i mtDNA-së: Sonikimi është një teknikë e besueshme për të prerë ADN-në mitokondriale për sekuencim.
Sonikator i pllakave me shumë vrima UIP400MTP lejon përgatitjen e mostrave me kapacitet të lartë të mostrave mitokondriale. Në bashkëpunim me centrifugimin diferencial, sonikimi rrit efikasitetin e izolimit mitokondrial, duke siguruar rendimente të larta të mitokondrive të plota të përshtatshme për aplikime të ndryshme pasuese.
Sonikator i pllakave me shumë vrima Hielscher UIP400MTP punon me çdo pllakë standarde
Sonikator i pllakave me shumë vrima UIP400MTP ofron përfitime të shumta për përgatitjen e mostrave me kapacitet të lartë, p.sh. në diagnostikën mitokondriale.
Sonikator i pllakave me shumë vrima UIP400MTP për përgatitjen e mostrave me kapacitet të lartë në diagnostikën e biomarkuesve.
Udhëzime shembullore për fragmentimin e mtDNA-së me ultratinguj
Përgatitja dhe ekstraktimi:
- Mijtë C57BL/6 u vranë me dislokacion qafisor.
- Mëlqit u ekstraktuan shpejt dhe u larë në PBS steril të ftohtë me akull.
Izolimi i mitokondrive:
- Mitokondritë u izoluan duke përdorur një blerës indesh Dounce 2-mL dhe një Kit Izolimi i Mitokondrive për Indet.
- Centrifugimi fillestar në 700× g dhe 3 000× g.
- Kryeni dy hapa shtesë larjeje me buffer C.
Izolimi i ADN-së:
- Precipitati nga centrifugimi i parë në 700× g u përdor për të izoluar ADN-në bërthamore (nDNA).
- ADN-ja u izolua duke përdorur kolona spin.
- ADN-ja mitokondriale (mtDNA) u ekstraktua nga mitokondritë e izoluara.
- ADN-ja bërthamore (nDNA) u ekstraktua nga ekstrakte bërthamore të papërpunuara, të dyja nga indet e mëlqisë së miut.
Fragmentimi i ADN-së:
- ADN-ja u fragmentua në akull duke përdorur një sonikator ultrasonik 30-kHz/50-W UP50H me një sonotrodë mikro-majë 0,5-mm në 14 μm për 2 × 30 sekonda.
Vizualizimi dhe kuantifikimi i fragmentimit:
- Fragmentimi pas ultrasonifikimit u vizualizua në një xhel agarozë 1% me ngjyrosës të sigurt për ADN-në SYBR.
- Abundanca relative e mtDNA dhe nDNA u përcaktua nga qPCR.
(shih. Mariero et al., 2019)
Për përgatitjen e mostrave me kapacitet të lartë, sonifikatori i pllakave me shumë pus UIP400MTP lejon përgatitjen e numrave të mëdha të mostrave në pllaka standarde 96-pus, me shumë pus dhe mikro-titer.
Lexoni më shumë për përparësitë e përgatitjes së mostrave me kapacitet të lartë duke përdorur UIP400MTP!
Këshilla për izolimin optimal të mitokondrive duke përdorur sonifikim:
- Kontrolli i temperaturës: Kryeni të gjitha hapat në një interval temperature nga 0°C në 4°C. Kjo është kritike për të ruajtur integritetin dhe funksionalitetin e mitokondrive.
- Efikasiteti dhe shpejtësia: Punoni shpejt dhe pastrojeni mitokondritë vetëm deri në masën e kërkuar për aplikimin tuaj specifik. Manipulimi i tepërt mund të çojë në humbje të konsiderueshme të përmbajtjes mitokondriale.
- Hollimi i suspendimeve: Mbani përqendrime të ulëta të suspendimeve të qelizave dhe organeleve gjatë gjithë procesit të izolimit. Kjo ndihmon në minimizimin e rreziqeve të kapjes dhe aglutinimit, duke përmirësuar kështu pastërtinë e mitokondrive të izoluara.
- Vëllimi i mostrës: Zgjidhni përgatitje të shumta në shkallë të vogël në vend të një të vetme në shkallë të madhe. Ky qasje zakonisht rezulton në rendimente më të mira, pasi rritja e shkallës nuk rrit në mënyrë proporcionale sasinë e mitokondrive të rikuperueshme. Sonifikatori i pllakave me shumë pus UIP400MTP lejon lizën e shpejtë dhe të besueshme të qelizave për izolimin e mitokondrive si dhe ekstraktimin e proteinave nga mitokondritë.
Këto udhëzime do ta bëjnë procesin e izolimit duke përdorur lizë ultrasonike dhe centrifugim më efikas, duke dhënë përgatitje mitokondriale me cilësi të lartë të përshtatshme për aplikimet e mëvonshme.
Sonifikatorët Hielscher – Cilësi e bërë në Gjermani
Ultrasonifikatorët Hielscher janë të njohur për standardet e tyre më të larta të cilësisë dhe dizajnit. Qëndrueshmëria dhe operimi i lehtë lejojnë integrimin e qetë të ultrasonifikatorëve tanë në impiante industriale. Kushtet e vështira dhe mjediset kërkesë trajtohen lehtësisht nga ultrasonifikatorët Hielscher.
Hielscher Ultrasonics është një kompani e certifikuar ISO dhe i jep rëndësi të veçantë ultrasonifikatorëve me performancë të lartë që karakterizohen nga teknologji moderne dhe lehtësi përdorimi. Natyrisht, ultrasonifikatorët Hielscher janë në përputhje me CE dhe plotësojnë kërkesat e UL, CSA dhe RoHs.
Sonifikatori i pllakave 96-pus UIP400MTP për sonifikimin e pllakave mikro-titer dhe me shumë pus
Literatura / Referencat
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Pyetje të shpeshta për Mitokondritë dhe Diagnostikën Mitokondriale
Çfarë janë Mitokondritë?
Mitokondritë janë organele të lidhura me membranë që gjenden në qelizat e shumicës e organizmave eukariotë. Ato njihen si centralet energjetike të qelizës sepse ato prodhojnë energji në formën e adenozinë trifosfatit (ATP) nëpërmjet procesit të frymëmarrjes qelizore. Përveç kësaj, mitokondritë kanë ADN-në e tyre dhe luajnë role kyçe në procese të tjera qelizore, duke përfshirë rregullimin e ciklit qelizor dhe vdekjen qelizore.
Çfarë e dallon mtDNA nga ADN-ja Gjenomike?
ADN-ja mitokondriale (mtDNA) ndryshon nga ADN-ja gjenomike (gDNA) në disa mënyra kyçe. MtDNA ndodhet në mitokondri, është rrethore dhe trashëgohet nga nëna, ndërsa gDNA ndodhet në bërthamën e qelizës, është lineare dhe trashëgohet nga të dy prindërit. MtDNA është shumë më e vogël, duke koduar vetëm 37 gjene, ndërsa gDNA përmban rreth 20 000-25 000 gjene. MtDNA është e pranishme në kopje të shumëfishta për qelizë, ka një shkallë më të lartë mutacioni dhe kryesisht kodon për proteina të përfshira në funksionin mitokondrial. Në kontrast, gDNA është zakonisht diploide, ka një shkallë më të ulët mutacioni dhe kodon një gamë të gjerë gjenesh të nevojshme për zhvillimin dhe funksionin e organizmit. Përveç kësaj, transkriptimi dhe translacioni i mtDNA ndodhin brenda mitokondrive, ndërsa transkriptimi i gDNA ndodh në bërthamë dhe translacioni ndodh në citoplazmë. Këto dallime pasqyrojnë rolet e tyre të dallueshme dhe origjinat evolucionare.
Çfarë është Ekstrakti Pa Qeliza?
Ekstrakti pa qelizë është një tretësirë që përmban përmbajtjen e qelizave të lizuara, duke përfshirë proteinat, acidet nukleike dhe komponentë të tjerë qelizorë, por pa membranat qelizore të plota. Ky ekstrakt përdoret në kërkimet biokimike dhe të biologjisë molekulare për të studiuar proceset qelizore in vitro, duke i mundësuar studiuesit të analizojnë reaksionet dhe mekanizmat jashtë qelizave të gjalla.
Çfarë roli luajnë testet PCR në diagnostikën mitokondriale?
Testet PCR luajnë një rol kritik në diagnostikën mitokondriale duke mundësuar zbulimin e mutacioneve, delecioneve ose variacioneve të numrit të kopjeve në ADN-në mitokondriale (mtDNA). Ato lejojnë amplifikimin e rajoneve specifike të mtDNA-së për të identifikuar variantet patogjene të lidhura me çrregullimet mitokondriale. Teknikat e bazuara në PCR, të tilla si PCR-ja kuantitative (qPCR) dhe PCR-ja me distancë të gjatë, përdoren gjithashtu për të vlerësuar integritetin e mtDNA-së, nivelet e heteroplazmisë dhe deplecionin e mtDNA-së, duke ofruar njohuri thelbësore mbi funksionin dhe sëmundjet mitokondriale.
Mësoni se si Sonikatorja e Mikropllakës UIP400MTP lehtëson testet dhe analizat PCR!
Çfarë është Centrifugimi Diferencial?
Centrifugimi diferencial është një teknikë e përdorur gjerësisht për fraksionimin qelizor dhe izolimin e mitokondrive. Ky metodë ndan strukturat qelizore bazuar në koeficientin e tyre të sedimentimit, i cili varet nga densiteti dhe forma. Procesi përfshin aplikimin e niveleve të ndryshme të forcës centrifugale ndaj mostrave në tretësira kripe të bufferuara me densitete specifike. Strukturat me koeficientë të ngjashëm sedimentimi do të vendosen në fund të tubit të mbledhjes në të njëjtën kohë, duke lejuar rikuperimin e tyre.
Si përdoret Centrifugimi Diferencial për Izolimin e Mitokondrive?
Centrifugimi diferencial u mundëson studiuesve të ndajnë me efikasitet fraksionet mitokondriale nga komponentët e tjerë qelizorë. Izolimi i mitokondrive përfshin disa hapa centrifugimi dhe rikuperimin e mëvonshëm të izolatit.
Centrifugimi Fillestar: Aplikoni një forcë të ulët centrifugale për të sedimentuar rrënojat e mëdha qelizore dhe bërthamat.
Centrifugimet Pasuese: Rrisni forcën centrifugale hap pas hapi për të pelletuar fraksionet e pasuruara me mitokondrie. Çdo hap centrifugimi heq strukturat me koeficientë sedimentimi gjithnjë e më të lartë.
Rikuperimi i Fraksionit: Pas çdo centrifugimi, pelleti mblidhet dhe supernatanti i nënshtrohet forcave më të larta g për të izoluar fraksionin tjetër. Kjo përsëritet derisa të arrihet pastërtia e dëshiruar e mitokondrive.