Përgatitja e mostrës me performancë të lartë për diagnostifikimin mitokondrial
Diagnostifikimi mitokondrial në kërkime dhe klinika kryhet duke përdorur teknika të ndryshme si sekuenca, PCR dhe analizat biokimike. Këto metoda përdoren për të identifikuar mutacionet e ADN-së dhe për të matur funksionin mitokondrial. Sekuenca ndihmon në zbulimin e mutacioneve gjenetike, ndërsa PCR mund të përcaktojë sasinë e sekuencave specifike të ADN-së. Analizat biokimike vlerësojnë funksionalitetin e proteinave dhe enzimave mitokondriale.
Diagnostifikimi i sëmundjeve mitokondriale është veçanërisht i vështirë për shkak të ndryshueshmërisë së theksuar klinike të këtyre sëmundjeve si dhe për shkak të ndërveprimit kompleks midis dy gjenomeve të trashëguara ndryshe: ADN-së mitokondriale (mtDNA) dhe gjenomit bërthamor.
Nxjerrja dhe fragmentimi i ADN-së duke përdorur Sonication
Nxjerrja e ADN-së nga indet e muskujve është veçanërisht e dobishme kur dyshohet për ndryshime specifike të indeve në mtDNA. Këto ndryshime mund të përfshijnë fshirje të mtDNA në oftalmoplegjinë e jashtme progresive kronike (CPEO), mutacione pikësore të mtDNA në miopatitë mitokondriale ose shterim të mtDNA në sindromën Alpers. ADN-ja e nxjerrë nga indi muskulor mund të përdoret më pas për teste të ndryshme gjenetike, si p.sh. Southern blot dhe PCR me rreze të gjatë për delecionet, PCR në kohë reale për zbrazjen, ose sekuenca për mutacione pikash.
Sonication, duke përdorur valë intensive ultratinguj, aplikohet për disa aplikime në diagnostikimin mitokondrial. Përdoret për lizimin e qelizave për nxjerrjen e përmbajtjeve ndërqelizore si mitokondria dhe ADN-në, për të prerë ADN-në si mtDNA dhe nDNA për renditje dhe për homogjenizimin e mostrave.
Sonicator i pllakave UIP400MTP për përgatitjen e mostrës me fuqi të lartë sonikon në mënyrë uniforme mostrat në pllaka me shumë pus dhe 96 pus
Si të izoloni mitokondritë nga qelizat dhe indet
Izolimi mitokondrial përfshin dy hapa thelbësorë: ndërprerjen e qelizave për të çliruar përmbajtjen e tyre dhe përdorimin e centrifugimit diferencial për të ndarë dhe rikuperuar fraksionet mitokondriale.
sonikacion
Sonicatorët Hielscher janë të pajtueshëm me tamponët dhe kompletet standarde të lizës, duke i bërë ato të përshtatshme për izolimin e mitokondrive. Sonication shërben për dy qëllime kryesore:
- Liza e qelizave: Valët ultrasonike prishin membranat qelizore, duke lëshuar përmbajtje brendaqelizore.
- Çrregullimi mitokondrial: Sonicizimi në një hap pasues mund të thyejë mitokondritë për të çliruar proteinat mitokondriale ose ADN-në mitokondriale.
- Fragmentimi i mtADNA: Sonication është një teknikë e besueshme për të prerë ADN-në mitokondriale për renditje.
Sonicatori me pllaka me shumë pllakë UIP400MTP lejon përgatitjen e mostrave me fuqi të lartë të mostrave mitokondriale. Në lidhje me centrifugimin diferencial, sonikimi rrit efikasitetin e izolimit mitokondrial, duke siguruar rendimente të larta të mitokondrive të paprekura të përshtatshme për aplikime të ndryshme në rrjedhën e poshtme.
Sonicator me pllaka Hielscher UIP400MTP punon me çdo pllakë standarde
Sonicatori me pllaka me shumë pllakë UIP400MTP ofron përfitime të shumta për përgatitjen e mostrës me kapacitet të lartë, p.sh. në diagnostikimin mitokondrial.
UIP400MTP Sonicator i pllakave Multiwell për përgatitjen e mostrës me fuqi të lartë në diagnostikimin e biomarkerëve.
Udhëzime shembullore për copëzimin tejzanor të mtADNA
Përgatitja dhe nxjerrja:
- Minjtë C57BL/6 u vranë nga dislokimi i qafës së mitrës.
- Mëlçitë u nxorrën shpejt dhe u lanë në PBS steril të ftohtë në akull.
Izolimi i mitokondrisë:
- Mitokondritë u izoluan duke përdorur një mulli të indeve Dounce 2-mL dhe një çantë izolimi të mitokondrive për indet.
- Centrifugimi fillestar në 700× g dhe 3000× g.
- Kryeni dy hapa shtesë të larjes me tampon C.
Izolimi i ADN-së:
- Peleti nga centrifugimi i parë në 700 × g u përdor për të izoluar ADN-në bërthamore (nADN).
- ADN-ja u izolua duke përdorur kolona spin.
- ADN-ja mitokondriale (mtDNA) është nxjerrë nga mitokondritë e izoluara.
- ADN-ja bërthamore (nADN) u nxor nga ekstrakte të papërpunuara bërthamore, të dyja nga indet e mëlçisë së miut.
Fragmentimi i ADN-së:
- ADN-ja u copëtua në akull duke përdorur një sonikator tejzanor UP50H 30-kHz/50-W me një sonotrode mikro-maje 0,5 mm në 14 μm për 2 × 30 sekonda.
Vizualizimi dhe kuantifikimi i fragmentimit:
- Fragmentimi pas ultrasonifikimit u vizualizua në një xhel agarozë 1% me ngjyrë të sigurt të ADN-së SYBR.
- Bollëku relativ i mtDNA dhe nDNA u përcaktua nga qPCR.
(krh. Mariero et al., 2019)
Për përgatitjen e mostrës me fuqi të lartë, sonikatori i pllakave me shumë puse UIP400MTP lehtëson përgatitjen e numrave të mëdhenj të mostrave në pllaka standarde 96 pusesh, shumë pusesh dhe mikrotitrash.
Lexoni më shumë rreth avantazheve të përgatitjes së mostrës me performancë të lartë duke përdorur UIP400MTP!
Këshilla për izolimin optimal të mitokondrisë duke përdorur sonication:
- Kontrolli i temperaturës: Kryeni të gjitha hapat në një interval temperaturash nga 0°C deri në 4°C. Kjo është kritike për ruajtjen e integritetit dhe funksionalitetit të mitokondrive.
- Efikasiteti dhe shpejtësia: Punoni me shpejtësi dhe pastroni mitokondritë vetëm në masën që kërkohet për aplikimin tuaj specifik. Manipulimi i tepërt mund të çojë në humbje të konsiderueshme të përmbajtjes mitokondriale.
- Hollimi i pezullimeve: Mbani përqendrime të ulëta të pezullimeve të qelizave dhe organeleve gjatë gjithë procesit të izolimit. Kjo ndihmon për të minimizuar rreziqet e bllokimit dhe aglutinimit, duke përmirësuar kështu pastërtinë e mitokondrive të izoluara.
- Vëllimi i mostrës: Zgjidhni për përgatitje të shumta në shkallë të vogël dhe jo një të vetme të madhe. Kjo qasje zakonisht rezulton në rendimente më të mira, pasi rritja e shkallës nuk rrit proporcionalisht sasinë e mitokondrive të rikuperueshme. Sonicatori me pllaka me shumë pllakë UIP400MTP lehtëson lizën e shpejtë dhe të besueshme të qelizës për izolimin e mitokondrive, si dhe nxjerrjen e proteinave nga mitokondria.
Këto udhëzime do ta bëjnë procesin e izolimit duke përdorur lizën tejzanor dhe centrifugimin më efikas, duke prodhuar preparate mitokondriale me cilësi të lartë të përshtatshme për aplikime në rrjedhën e poshtme.
Hielscher Sonicators – Cilësi e prodhuar në Gjermani
Ultrasonikët Hielscher janë të njohur për cilësinë e tyre më të lartë dhe standardet e dizajnit. Qëndrueshmëria dhe funksionimi i lehtë lejojnë integrimin e qetë të ultrasonikëve tanë në objektet industriale. Kushtet e vështira dhe mjediset kërkuese trajtohen lehtësisht nga ultrasonikët Hielscher.
Hielscher Ultrasonics është një kompani e certifikuar ISO dhe i kushton theks të veçantë ultratingujve me performancë të lartë që paraqesin teknologjinë më të fundit dhe lehtësinë ndaj përdorimit. Sigurisht, ultrasonikët Hielscher janë në përputhje me CE dhe plotësojnë kërkesat e UL, CSA dhe RoHs.
Sonicator me pllaka 96 pusesh UIP400MTP për sonikimin e pllakave mikrotitërore dhe shumëpushash
Literatura / Referencat
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Pyetjet e bëra më shpesh në lidhje me Mitokondrinë dhe Diagnostifikimin Mitokondrial
Çfarë janë mitokondritë?
Mitokondritë janë organele të lidhura me membranë që gjenden në qelizat e shumicës së organizmave eukariote. Ato njihen si qendrat e fuqisë së qelizës sepse prodhojnë energji në formën e adenozinës trifosfatit (ATP) përmes procesit të frymëmarrjes qelizore. Për më tepër, mitokondritë kanë ADN-në e tyre dhe luajnë role kyçe në procese të tjera qelizore, duke përfshirë rregullimin e ciklit qelizor dhe vdekjen e qelizave.
Çfarë e dallon mtDNA nga ADN gjenomike?
ADN-ja mitokondriale (mtDNA) ndryshon nga ADN-ja gjenomike (gDNA) në disa mënyra kryesore. MtADNA ndodhet në mitokondri, është rrethore dhe trashëgohet nga nëna, ndërsa gADN-ja ndodhet në bërthamën e qelizës, është lineare dhe trashëgohet nga të dy prindërit. MtADNA është shumë më e vogël, duke koduar vetëm 37 gjene, ndërsa gADN përmban rreth 20,000-25,000 gjene. MtADNA është e pranishme në kopje të shumta për qelizë, ka një shkallë më të lartë mutacioni dhe kryesisht kodon për proteinat e përfshira në funksionin mitokondrial. Në të kundërt, gADN është tipike diploide, ka një shkallë më të ulët mutacioni dhe kodon një grup të gjerë gjenesh të nevojshme për zhvillimin dhe funksionin e organizmit. Për më tepër, transkriptimi dhe përkthimi i mtDNA ndodh brenda mitokondrive, ndërsa transkriptimi i gADN ndodh në bërthamë dhe përkthimi ndodh në citoplazmë. Këto dallime pasqyrojnë rolet e tyre të dallueshme dhe origjinën evolucionare.
Çfarë është ekstrakti pa qeliza?
Një ekstrakt pa qeliza është një zgjidhje që përmban përmbajtjen e qelizave të lizuara, duke përfshirë proteinat, acidet nukleike dhe përbërës të tjerë qelizorë, por pa membrana qelizore të paprekura. Ky ekstrakt përdoret në kërkimet biokimike dhe molekulare të biologjisë për të studiuar proceset qelizore in vitro, duke u mundësuar studiuesve të analizojnë reaksionet dhe mekanizmat jashtë qelizave të gjalla.
Çfarë roli luajnë testet PCR në diagnostikimin mitokondrial?
Testet PCR luajnë një rol kritik në diagnostikimin mitokondrial duke mundësuar zbulimin e mutacioneve, fshirjeve ose variacioneve të numrit të kopjeve në ADN mitokondriale (mtDNA). Ato lejojnë përforcimin e rajoneve specifike të mtDNA për të identifikuar variantet patogjene të lidhura me çrregullimet mitokondriale. Teknikat e bazuara në PCR, të tilla si PCR sasiore (qPCR) dhe PCR me rreze të gjatë, përdoren gjithashtu për të vlerësuar integritetin e mtDNA, nivelet e heteroplasmisë dhe zbrazjen e mtDNA, duke ofruar njohuri thelbësore për funksionin dhe sëmundjen mitokondriale.
Mësoni se si UIP400MTP Microplate Sonicator lehtëson testet dhe analizat PCR!
Çfarë është Centrifugimi Diferencial?
Centrifugimi diferencial është një teknikë e përdorur gjerësisht për fraksionimin e qelizave dhe izolimin mitokondrial. Kjo metodë ndan strukturat qelizore bazuar në koeficientin e tyre të sedimentimit, i cili varet si nga dendësia ashtu edhe nga forma. Procesi përfshin aplikimin e niveleve të ndryshme të forcës centrifugale në kampione në solucione kripe të puferuara me dendësi specifike. Strukturat me koeficientë të ngjashëm sedimentimi do të vendosen në fund të tubit të grumbullimit në të njëjtën kohë, duke lejuar rikuperimin e tyre.
Si përdoret centrifugimi diferencial për izolimin e mitokondrive?
Centrifugimi diferencial i lejon studiuesit të ndajnë në mënyrë efektive fraksionet mitokondriale nga komponentët e tjerë qelizorë. Izolimi i mitokondrive përfshin disa hapa centrifugimi dhe rikuperimin pasues të izolimit.
Centrifugimi fillestar: Aplikoni një forcë të ulët centrifugale për të sedimentuar mbeturina dhe bërthama të mëdha qelizore.
Centrifugimet e mëvonshme: Rriteni forcën centrifugale në mënyrë hap pas hapi në fraksionet e peletit të pasuruara me mitokondri. Çdo hap i centrifugimit heq strukturat me koeficientë sedimentimi në mënyrë progresive më të larta.
Rikuperimi i fraksionit: Pas çdo centrifugimi, peleti mblidhet dhe supernatanti i nënshtrohet forcave g më të larta për të izoluar fraksionin tjetër. Kjo përsëritet derisa të arrihet pastërtia e dëshiruar e mitokondrive.