Formimi i fibrileve amiloide duke përdorur Sonicatorin e mikropllakës UIP400MTP

Fibrilet amiloide, njësoj si kristalet, formohen përmes një procesi të bërthamës dhe rritjes pasuese. Megjithatë, për shkak të pengesës së lartë të energjisë së lirë të bërthamimit, formimi spontan i fibrilit amiloid ndodh vetëm pas një faze të zgjatur të vonesës. Ultratingulli është shfaqur si një mjet i fuqishëm për nxitjen e bërthamimit të amiloidit, duke përshpejtuar ndjeshëm formimin e fibrileve. Kur kombinohet me një lexues mikropllakash duke përdorur fluoreshencën e tioflavinës T (ThT), tingulli me ultratinguj mundëson zbulimin me shpejtësi të lartë të fibrileve amiloide në mostra të shumta njëkohësisht.

Formimi i fibrileve amiloide të induktuara në mënyrë tejzanore me mikropllakën e zërit UIP400MTP

Me sonikatorin e pllakave me shumë puseta UIP400MTP, fibrilet amiloide të së njëjtës cilësi në sasi të mëdha mund të sintetizohen me shpejtësi për qëllime kërkimore. Kjo qasje efikase lejon studimin e amiloidogenicitetit të proteinave. Kjo teknikë lehtëson fibrilimin e shpejtë dhe të riprodhueshëm të amiloidit, siç tregohet me β2-mikroglobulinën (β2-m), një proteinë amiloidogjene e lidhur me amiloidozën e lidhur me dializën.

Qasje e thjeshtë eksperimentale: Fibrilimi amiloide i induktuar me ultratinguj

Për të nxitur formimin e fibrileve, një mikropllakë 96 pusesh u vendos në qendër të sonikatorit të pllakave me shumë puseta UIP400MTP, i cili siguron ekspozim të njëtrajtshëm me ultratinguj në të gjitha pusetat. Kushtet eksperimentale ishin si më poshtë:

1. Çdo pus përmbante 0,2 ml tretësirë β2-mikroglobuline (0,3 mg/ml, pH 2,5) të plotësuar me 5 μM ThT.
2. Pllaka iu nënshtrua cikleve të ultrazërit, të tilla si ultratingulli 1-minutësh i ndjekur nga 9 minuta pauzë.
3. Pas sonifikimit, fluoreshenca ThT u mat duke përdorur një lexues mikropllake.

(krh. So et al., 2011)

Krahasimi me agjitacionin konvencional

Krahasuar me metodat tradicionale të agjitacionit, ultratingulli reduktoi në mënyrë drastike fazën e vonesës së formimit të fibrilit. Në kushte konvencionale të tundjes së mikropllakës, vetëm 1 nga 10 puse shfaqën fluoreshencë të rritur ThT pas 20 orësh. Në të kundërt, duke përdorur ultratinguj me cikël (15 minuta sonication e ndjekur nga qetësi 5 minuta), një rritje domethënëse e fluoreshencës ThT u zbulua menjëherë pas trajtimit të parë të sonikacionit.

Përshpejtimi i shpejtë i kinetikës së fibrilimit

Rezultatet e marra nga So et al. (2011) tregoi se formimi spontan i fibrilit të β2-mikroglobulinës në pH 2.5 mund të përshpejtohet nga disa orë në vetëm 10-15 minuta me ultratinguj.
Imazhet e mikroskopit të forcës atomike (AFM) konfirmuan se fibrilet e krijuara nëpërmjet ultrazërit 10-minutësh çdo 15 minuta ishin morfologjikisht të padallueshme nga ato të formuara duke përdorur ultratinguj 1 minutësh çdo 10 minuta. Kjo nxjerr në pah riprodhueshmërinë dhe qëndrueshmërinë e fibrilimit të amiloidit të induktuar në mënyrë ultrasonike.

Imazhet AFM të fibrileve amiloide të prodhuara me ultratinguj 1-minutësh çdo 10 min (i), me sonikacion 10-minutësh çdo 15 minuta (ii) dhe nga reaksioni i mbjelljes pa ultratingull (iii). Shiriti i shkallës së bardhë përfaqëson 1 μm.
Studimi dhe imazhet: ©So et al., 2011

Fibrilimi në kushte të pH neutrale

Edhe në kushte neutrale të pH, formimi i fibrilit u arrit pas një vonese prej 1.5 orësh, duke demonstruar se ultrazërit ul ndjeshëm pengesën energjike ndaj bërthamimit dhe rritjes. Kjo mbështet më tej hipotezën se fibrilacioni amiloid është kryesisht një reaksion fizik, i kufizuar kryesisht nga pengesa e energjisë bërthamore, të cilën ultratingulli e redukton në mënyrë efektive.

Ndikimi në Kërkimin e Sëmundjeve të lidhura me Amiloidin

Formimi i lehtë dhe i besueshëm i fibrileve amiloide duke përdorur sonikatorin e mikropllakës UIP400MTP ka implikime të rëndësishme për kërkimin e sëmundjes Alzheimer (AD) dhe çrregullime të tjera të lidhura me amiloidin, si sëmundja e Parkinsonit, diabeti i tipit II dhe amilodoza sistemike. Në AD, grumbullimi i amiloid-β (Aβ) është një shenjë kryesore patologjike, megjithatë studimi i kinetikës së fibrilimit të tij mbetet sfidues për shkak të fazave të gjata të vonesës dhe ndryshueshmërisë në metodat konvencionale. Formimi i fibrileve të drejtuara nga ultrazërit përshpejton bërthamimin, duke siguruar riprodhueshmëri të lartë dhe ndryshueshmëri të reduktuar, gjë që është thelbësore për shqyrtimin e frenuesve të mundshëm dhe për të kuptuar mekanizmat amilodogjenë. Për më tepër, aftësia e performancës së lartë të UIP400MTP mundëson hetime në shkallë të gjerë për palosjen dhe grumbullimin e proteinave, duke lehtësuar zbulimin e agjentëve terapeutikë që mund të modulojnë formimin e fibrileve dhe potencialisht të zbusin progresionin neurodegjenerativ.

Ky studim vendos ultratingullimin duke përdorur sonikatorin e pllakave me shumë puse UIP400MTP si një metodë shumë efikase për përshpejtimin e formimit të fibrilit amiloid. Përparësitë kryesore të kësaj qasjeje përfshijnë:

• Reduktim dramatik në kohën e vonesës për fibrilacion.
• Ekspozim uniform i ultrazërit në të gjitha puset, duke mundësuar formimin e fibrilit të riprodhueshëm.
• Aftësia e shqyrtimit me performancë të lartë, duke e bërë atë të përshtatshme për kërkime të gjenomit të gjerë të amiloidogenicitetit të proteinave.

Duke integruar ultratingullin me zbulimin e fluoreshencës ThT, kjo metodë ofron një platformë të shpejtë, të shkallëzuar dhe të besueshme për studimin e fibrilimit amiloid. Duke pasur parasysh efikasitetin e saj dhe potencialin e lartë të performancës, kjo qasje mund të lehtësojë sintezën e lehtë të fibrileve amiloide për kërkime biofizike dhe farmaceutike, duke ofruar një mjet premtues për studimet e lidhura me amiloidin dhe shqyrtimin e ilaçeve.