PMCA për zbulimin me shpejtësi të lartë të Prionëve duke përdorur Sonicatorin UIP400MTP

Sonicatori me pllaka me shumë puseta UIP400MTP ofron një zgjidhje të fuqishme për përgatitjen e mostrës me performancë të lartë në amplifikimin ciklik të palosjes së gabuar të proteinave (PMCA). Duke ofruar shpërndarje uniforme të energjisë nëpër puse të shumta dhe duke ruajtur parametrat e saktë të sonikimit, ky sistem mundëson përpunimin e njëkohshëm të mostrave të shumta me riprodhueshmëri të jashtëzakonshme. Këto aftësi janë kritike për optimizimin e PMCA për të zbuluar prionet në përqendrime të ulëta në mostrat sfiduese biologjike, si pështyma, ku frenuesit e analizës mund të errësojnë rezultatet.

Sëmundjet e Prionit, të tilla si sëmundja e humbjes kronike (CWD) në qafën e mitrës dhe sëmundja Creutzfeldt-Jakob (CJD) tek njerëzit, janë çrregullime neurodegjenerative të shkaktuara nga proteinat prion të palosura gabimisht (PrP^Sc). Këto sëmundje shpesh përfshijnë nivele të ulëta të prioneve infektive në lëngjet trupore, si pështyma, gjaku dhe urina, duke komplikuar diagnozën dhe kërkimin. Transmetimi horizontal i CWD përmes prioneve të derdhur në matricat mjedisore ka implikime veçanërisht të rëndësishme për menaxhimin e kafshëve të egra dhe shëndetin ekologjik. Në mënyrë të ngjashme, në sëmundje si sëmundja Creutzfeldt-Jakob, amplifikimi i besueshëm i proteinave të prionit të palosura gabimisht nga mostrat njerëzore është thelbësor për avancimin e diagnostikimit dhe kuptimin e përparimit të sëmundjes.

Zbatimi i një protokolli të modifikuar PMCA lejon të anashkalohen frenuesit e zakonshëm të analizës (p.sh. mucinat në pështymë) dhe të arrihet ndjeshmëri e lartë në zbulimin e prioneve që përndryshe do të ishin të pazbulueshme ose të paqarta duke përdorur teknika të tilla si konvertimi i nxitur nga tërmetet në kohë reale (RT-QuIC). Këto përparime përmirësojnë zbulimin e prionit për sëmundje të ndryshme, duke e bërë PMCA një mjet të domosdoshëm për kërkimin dhe diagnostikimin e prionit. Sonicatori me pllaka me shumë pllakë UIP400MTP lehtëson sonikimin e mostrave të shumta PMCA me performancë të lartë në mikropllaka (p.sh. pllaka me 6, 24 ose 96 pusi) ose shishe në një raft tubash.

Protokolli për Amplifikimin ciklik të papalosjes së gabuar të proteinave me përçueshmëri të lartë (PMCA)

Protokolli i mëposhtëm lejon përpunimin efikas të numrit të lartë të mostrës në të njëjtat kushte për rezultate të fuqishme kërkimore.

përgatitja e mostrës

Materiali fillestar:
Përgatitni mostrat nga:

• Risuspendimi i peletave të nxjerrjes së sarkosilit në substratin PMCA.
• Homogjenimi i trurit direkt ose mostrat e gjakut me fara prion.

Substrati:

• Përdorni një homogjenat truri 10% (wt/vol) të përgatitur nga minj transgjenikë që shprehin shumë PrP^C (p.sh. minjtë Tg).
• Homogjenizimi i indit të trurit në:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• Mbajeni substratin në -80ºC deri në përdorim.

Konfigurimi i mostrës në mikropllakë ose tuba:
Tubat:

• Shtoni 90 μL substrat të homogjenatit të trurit dhe mbilleni me 10 μL kampion (p.sh. gjaku, homogjenati i trurit ose pelet sarkosil).
• Vendosni 3 rruaza Teflon (1,59 mm ose 2,38 mm diametër) në çdo tub 0,2 mL.
• Montoni tubat në një raft të pajtueshëm me sonikatorin UIP400MTP.

6-Mikropllakë pusi:

• Shtoni 5 mL substrat homogjenat të trurit dhe farën me 500 μL kampion për pus.
• Shtoni 3 rruaza Teflon në çdo pus.

Procedura PMCA

Vendosja:
Vendoseni raftin e tubit ose mikropllakën me 6 puseta në aparatin sonik UIP400MTP sipas udhëzimeve të prodhuesit.

Programi i çiklizmit:
Kryeni 144 cikle PMCA si më poshtë:

• Inkubimi: 29 minuta e 30 sekonda në 37°C.
• Sonication: 30 sekonda në amplitudë 60%.
• Monitorimi i temperaturës: Përdorni sensorin e temperaturës me prizë për të monitoruar temperaturën e mostrës dhe programoni UIP400MTP në një maksimum. temperatura 48-50°C.

Raundet pasuese:
Pas përfundimit të raundit të parë prej 144 ciklesh, transferoni një pjesë të materialit të përforcuar:

• Hollohet 10-fish në një substrat homogjen të trurit transgjenik të miut.
• Kryeni 96 cikle PMCA për raundet pasuese, duke ruajtur të njëjtat parametra të tingullit.
• Vazhdoni për numrin e dëshiruar të raundeve (zakonisht deri në 5).

Zbulimi i PrP^Sc

1. Tretja e proteinës K:
   – Trajtoni mostrat me Proteinazë K (50 μg/mL) në 37°C për 1 orë.
   – Përfundoni tretjen duke shtuar tampon SDS-kampion dhe duke e zier për 10 minuta.
2. Analiza Western Blot:
   – Analizoni mostrat e tretura duke përdorur:
   – 6H4 ose PRC1 antitrupa anti-PrP.
   – Kryeni SDS-PAGE dhe transferojeni në membranat PVDF për zbulim.

 

 

Përpunoni më shumë mostra për rezultate më të qëndrueshme

Sonicatori me pllaka me shumë puse UIP400MTP rrit ndjeshëm efikasitetin dhe shkallëzueshmërinë e amplifikimit ciklik të palosjes së gabuar të proteinave (PMCA), duke adresuar natyrën tradicionalisht që kërkon kohë të procedurës. Duke lejuar përpunimin e njëkohshëm të deri në 96 mostrave në një pllakë 96 pusesh, sistemi thjeshton rrjedhat e punës PMCA duke ruajtur kushte të sakta dhe uniforme të sonikimit në të gjitha puset. Kjo aftësi me performancë të lartë minimizon trajtimin manual, redukton hapat që kërkojnë punë dhe siguron riprodhueshmëri, duke e bërë atë një mjet të domosdoshëm për kërkimin e prionit. Qoftë duke hetuar sëmundjen e dëmtimit kronik ose sëmundjen Creutzfeldt-Jakob, UIP400MTP lehtëson studime në shkallë të gjerë me efikasitet më të madh, duke u mundësuar studiuesve të përmbushin kërkesat e aplikacioneve moderne diagnostike dhe shkencore.

---

---

Literatura / Referencat

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.