PMCA për zbulimin me kapacitet të lartë të prioneve duke përdorur sonikatorin UIP400MTP

Sonikatori me pllaka me shumë pus UIP400MTP ofron një zgjidhje të fuqishme për përgatitjen e mostrave me kapacitet të lartë në amplifikimin ciklik të palosjes së gabuar të proteinave (PMCA). Duke ofruar shpërndarje uniforme të energjisë nëpër shumë puse dhe duke ruajtur parametra të saktë sonikimi, ky sistem lejon përpunimin e njëkohshëm të shumë mostrave me riprodushmëri të jashtëzakonshme. Këto aftësi janë kritike për optimizimin e PMCA për të zbuluar prionet në përqendrime të ulëta në mostra biologjike sfiduese, si pështyma, ku inhibitorët e analizës mund të mbulojnë rezultatet.

Sëmundjet e prioneve, si sëmundja e shpërdorimit kronik (CWD) në cervidë dhe sëmundja e Creutzfeldt-Jakob (CJD) në njerëz, janë çrregullime neurodegenerative të shkaktuara nga proteina prioni të palosura gabim (PrP^Sc). Këto sëmundje shpesh përfshijnë nivele të ulëta të prioneve infektive në lëngje trupore, si pështyma, gjaku dhe urina, duke komplikuar diagnostikimin dhe kërkimin. Transmetimi horizontal i CWD nëpërmjet prioneve të hedhura në matrica mjedisore ka implikime veçanërisht të rëndësishme për menaxhimin e faunës së egër dhe shëndetin ekologjik. Në mënyrë të ngjashme, në sëmundje si sëmundja e Creutzfeldt-Jakob, amplifikimi i besueshëm i proteinave prioni të palosura gabim nga mostrat njerëzore është thelbësor për përparimin e diagnostikimit dhe kuptimin e progresionit të sëmundjes.

Zbatimi i një protokolli të modifikuar PMCA lejon kalimin e inhibitorëve të zakonshëm të analizës (p.sh., mukinat në pështymë) dhe arritjen e ndjeshmërisë së lartë në zbulimin e prioneve që do të ishin përndryshe të pazbulueshme ose të paqarta duke përdorur teknika si konvertimi i induktuar nga dridhjet në kohë reale (RT-QuIC). Këto përparime përmirësojnë zbulimin e prioneve për sëmundje të ndryshme, duke e bërë PMCA një mjet të pazëvendësueshëm për kërkimin dhe diagnostikimin e prioneve. Sonikatori me pllaka me shumë pus UIP400MTP lejon PMCA me kapacitet të lartë duke sonikuar shumë mostra në mikropllaka (p.sh. pllaka me 6, 24 ose 96 puse) ose në shishe në një raft tubash.

Protokolli për Amplifikimin Ciklik të Palosjes së Gabuar të Proteinave me Kapacitet të Lartë (PMCA)

Protokolli i mëposhtëm lejon përpunimin efikas të numrit të lartë të mostrave në kushte saktësisht të njëjta për rezultate kërkimore të qëndrueshme.

Përgatitja e Mostrave

Materiali Fillestar:
Përgatitni mostrat duke:

• Riresuspenduar pelletat e ekstraktimit me sarkozil në substratin PMCA.
• Inokuluar drejtpërdrejt homogenatet e trurit ose mostrat e gjakut me fara prioni.

Substrati:

• Përdorni një homogenat truri 10% (peshë/vol) të përgatitur nga minj transgjenikë që mbishqyrtojnë PrP^C (p.sh., minjtë Tg).
• Homogenizoni indin e trurit në:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• Ruani substratin në -80ºC deri në përdorim.

Vendosja e Mostrës në Mikroplakë ose Tubë:
Tubat:

• Shtoni 90 μL substrat homogenati truri dhe inokuloni me 10 μL mostre (p.sh., gjak, homogenat truri, ose pellet sarkozili).
• Vendosni 3 rruaza Teflon (diametër 1,59-mm ose 2,38-mm) në çdo tub 0,2 mL.
• Montoni tubat në një raft të pajtueshëm me sonikatorin UIP400MTP.

Mikroplakë me 6 Puse:

• Shtoni 5 mL substrat homogenati truri dhe inokuloni me 500 μL mostre për pus.
• Shtoni 3 rruaza Teflon në çdo pus.

Procedura PMCA

Vendosja:
Vendosni raftin e tubave ose mikroplakën me 6 puse në sonikatorin UIP400MTP sipas udhëzimeve të prodhuesit.

Programi i Ciklit:
Kryeni 144 cikle PMCA si më poshtë:

• Inkubimi: 29 minuta dhe 30 sekonda në 37°C.
• Sonikimi: 30 sekonda në 60% amplitudë.
• Monitoroni temperaturën: Përdorni sensorin e temperaturës të lidhshëm për të monitoruar temperaturën e mostrës dhe programoni UIP400MTP në një temperaturë maks. 48–50°C.

Roundet Pasuese:
Pas përfundimit të roundit të parë të 144 cikleve, transferoni një alikot të materialit të amplifikuar:

• Holloni 10-fish në substrat të freskët homogenati truri të minjve transgjenikë.
• Kryeni 96 cikle PMCA për roundet pasuese, duke ruajtur të njëjtët parametra sonikimi.
• Vazhdoni për numrin e dëshiruar të roundeve (zakonisht deri në 5).

Zbulimi i PrP^Sc

1. Digjestionimi me Proteinazën K:
   – Trajtoni mostrat me Proteinazë K (50 μg/mL) në 37°C për 1 orë.
   – Ndani digjestionimin duke shtuar buffer SDS-moistre dhe duke zierë për 10 minuta.
2. Analiza Western Blot:
   – Analizoni mostrat e digjestionuara duke përdorur:
   – Antitrupa anti-PrP 6H4 ose PRC1.
   – Kryeni SDS-PAGE dhe transferoni në membrana PVDF për zbulim.

 

Hielscher UIP400MTP është sonikatori më i përshtatshëm për pllakat tuaja me shumë puse, pllakat PCR ose epruvetat e mostrave. Me fuqi të vazhdueshme sonikimi prej 400 vatësh, është projektuar për aplikime si: liza qelizore, emulsifikimi, ekstraktimi i proteinave, fragmentimi i ADN-së / ARN-së, deaglomerimi, ekstraktimi nga mostrat FFPE, shkëputja e qelizave dhe biofilmave ose emulsifikimi. UIP400MTP nuk është banjë ultrasonike. Është një sonotrodë në formë kupe me intensitet të lartë për sonikim të përqendruar. Ky sonikator i fuqishëm pa kontakt siguron sonikim të njëtrajtshëm në të gjitha puset e pllakës suaj standarde. Ju keni kontroll të saktë mbi amplitudën, fuqinë dhe pulsimin. Kohëmatësi i integruar dhe sonda e temperaturës sigurojnë rezultate të qëndrueshme. Sonikatori i pllakave UIP400MTP i ftoh mostrat me një banjë uji; ftohësi i jashtëm ofrohet si opsion.

 

Përpunoni Më Shumë Mostra për Rezultate Më të Qëndrueshme

Sonikatori me pllaka me shumë pus UIP400MTP përmirëson ndjeshëm efikasitetin dhe shkallëzueshmërinë e amplifikimit ciklik të palosjes së gabuar të proteinave (PMCA), duke adresuar natyrën tradicionalisht kohë-humbëse të procedurës. Duke lejuar përpunimin e njëkohshëm të deri në 96 mostrave në një pllakë me 96 puse, sistemi thjeshton proceset e punës PMCA ndërsa mban kushte sonikimi të sakta dhe uniforme në të gjitha puset. Kjo aftësi me kapacitet të lartë minimizon trajtimin manual, redukton hapat me punë intensive dhe siguron riprodushmëri, duke e bërë atë një mjet të pazëvendësueshëm për kërkimin e prioneve. Pavarësisht nëse po hetoni sëmundjen e shpërdorimit kronik ose sëmundjen e Creutzfeldt-Jakob, UIP400MTP lejon studime me shkallë të gjerë me efikasitet më të madh, duke i mundësuar studiuesit të plotësojnë kërkesat e aplikimeve moderne diagnostikuese dhe shkencore.

---

---

Literatura / Referencat

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.