Proteiinipellettien liuottaminen ultraäänellä

Proteomiikassa näytteenkäsittely ei koskaan ole vähäpätöinen yksityiskohta. Se on perusta, jonka varaan tunnistuksen tarkkuus, kvantifioinnin luotettavuus ja toistettavuus rakentuvat. Yksi sitkeimmistä haasteista proteiininäytteiden käsittelyssä on proteiinipellettien tehokas uudelleenliuottaminen saostus- tai väkevöintivaiheiden jälkeen. Tässä proteiinipellettien liuottaminen ultraäänellä on noussut yhä tärkeämpään asemaan. Hallitun ultraäänikäsittelyn avulla laboratoriot voivat parantaa proteiinien talteensaantia, nopeuttaa pellettien liukenemista ja valmistella näytteitä tehokkaammin myöhempää massaspektrometriaa ja biokemiallista analyysiä varten.

Proteiinien liuottaminen: miksi ultraäänikäsittely on tärkeää nykyaikaisessa proteomiikassa

Proteiinipellettejä muodostuu usein asetoni-, etanoli-, metanoli-kloroformi-, ammoniumsulfaatti- tai TCA-saostuksessa. Näitä työnkulkuja käytetään laajalti epäpuhtauksien poistamiseen, proteiinien väkevöimiseen ja uutteiden puhdistamiseen ennen analyysiä. Saostuksen päätyttyä muodostunutta pellettiä voi kuitenkin olla vaikea liuottaa uudelleen. Tiiviit aggregaatit, hydrofobiset domeenit, kalvoihin liittyvät proteiinit ja voimakkaasti vuorovaikuttavat proteiinikompleksit vastustavat usein tavanomaista sekoittamista tai vorteksointia. Epätäydellinen liukeneminen voi tällöin johtaa näytehävikkiin, proteiinien edustavuuden vääristymiseen ja huonoon toistettavuuteen kokeiden välillä.
Ultraäänikäsittely ratkaisee juuri tämän pullonkaulan. Tuottamalla mekaanista energiaa nestemäiseen väliaineeseen ultraäänikäsittely hajottaa tiiviitä pellettirakenteita, edistää puskurin tunkeutumista ja dispergoi aggregoitunutta materiaalia liuokseen. Tuloksena on proteiinien nopeampi ja usein täydellisempi palautuminen liuokseen, mikä on erityisen arvokasta, kun käytettävissä on vähän näytettä tai kun käsitellään monimutkaisia lysaatteja tai haastavia proteomiikan kohteita.

Miksi proteiinipellettejä on vaikea liuottaa

Proteiinien saostaminen on tehokasta, koska se pakottaa proteiinit pois liuoksesta. Sama prosessi, joka tekee saostamisesta hyödyllistä, aiheuttaa kuitenkin myös ongelman proteiinien talteensaannissa pelletistä. Pelletiksi muodostuneet proteiinit voivat pakkautua tiiviisti ja denaturoitua osittain. Hydrofobiset vuorovaikutukset voivat voimistua, molekyylien välinen sitoutuminen voi lisääntyä, ja jotkin proteiinit voivat vangita suoloja, lipidejä, nukleiinihappoja tai muita matriisin komponentteja. Vaikka käytettäisiin tehokasta liuotuspuskuria, passiivinen uudelleensuspendointi on usein hidasta ja epätäydellistä.
Proteomiikassa tällä on merkitystä, koska pelletin epätäydellinen liukeneminen ei pelkästään vähennä kokonaissaantoa. Se voi jättää valikoivasti pois tiettyjä proteiiniluokkia, erityisesti kalvoproteiineja, rakenneproteiineja tai aggregaatioherkkiä proteiineja. Tämä tarkoittaa, että lopullinen analyysitulos ei välttämättä enää vastaa alkuperäisen näytteen todellista koostumusta. Korkean erotuskyvyn proteomiikassa, jossa pienet erot määrissä tai translaation jälkeisissä modifikaatioissa voivat olla biologisesti ratkaisevia, tällainen näytteenkäsittelyn aiheuttama vinouma on vakava rajoite.

Miten ultraäänikäsittely parantaa proteiinipellettien liuottamista

Ultraäänikäsittely parantaa liukenemista tuomalla näytteeseen korkeataajuista mekaanista energiaa. Tämä energia auttaa hajottamaan tiivistä pellettimateriaalia ja lisää liuotuspuskurin kosketusta pelletin sisällä oleviin proteiineihin. Pelkän diffuusion ja manuaalisen sekoittamisen sijaan prosessi dispergoi pelletin aktiivisesti pienemmiksi osiksi, jotka liukenevat helpommin.

Käytännön vaikutus on merkittävä. Ultraäänikäsittely voi:

• nopeuttaa tiiviiden tai vaikeasti liukenevien proteiinipellettien liukenemista
• parantaa huonosti liukenevien ja aggregoituneiden proteiinien talteensaantia
• lyhentää näytteenkäsittelyaikaa proteomiikan työnkuluissa
• edistää homogeenisempien näytteiden saamista pilkkomista ja analyysiä varten

Tämä tehostunut dispersio on erityisen hyödyllistä, kun pelletit suspendoidaan uudelleen puskureihin, jotka sisältävät ureaa, tioureaa, detergenttejä, kaotrooppisia aineita tai muita proteomiikassa yleisesti käytettyjä reagensseja. Ultraäänikäsittely auttaa näitä komponentteja saavuttamaan pelletin ja liuottamaan sen tehokkaammin, jolloin saadaan tasalaatuisempi näyteliuos.

Ultraäänellä liuottamisen edut proteomiikassa

Ultraäänellä liuottamisen keskeinen etu on, että se muuttaa usein aliarvioidun näytteenkäsittelyvaiheen hallittavaksi ja tehokkaaksi prosessiksi. Proteomiikassa tällä on suoria vaikutuksia analyysiin.

1. Ensinnäkin parempi liukeneminen lisää todennäköisyyttä, että entsymaattiseen pilkkomiseen siirtyvä näyte edustaa koko proteiinipopulaatiota. Esimerkiksi trypsiinipilkkominen edellyttää, että proteiinien laskostunut rakenne on riittävästi avautunut ja että proteiinit ovat liuoksessa entsyymin saavutettavissa. Jos osia pelletistä jää liukenematta, nämä proteiinit jäävät käytännössä peptidien muodostumisen ja siten myös havaitsemisen ulkopuolelle.
2. Toiseksi ultraäänikäsittely voi parantaa toistettavuutta. Pelletin manuaalinen uudelleensuspendointi on luonteeltaan vaihtelevaa, etenkin kun mukana on eri käyttäjiä, erikokoisia pellettejä tai erilaisia näytematriiseja. Hallittu ultraäänikäsittely vakioi näytteeseen kohdistetun fysikaalisen energian, mikä voi vähentää vaihtelua näytteenkäsittelyjen välillä ja parantaa yhdenmukaisuutta myöhemmissä työnkuluissa (LC-MS tai geelipohjaiset menetelmät).
3. Kolmanneksi ultraäänikäsittely on erittäin arvokasta pienille ja arvokkaille näytteille. Kliininen proteomiikka, biomarkkerien etsintä, soluviljelykokeet ja kudostutkimukset perustuvat usein rajalliseen materiaalimäärään. Kaikki proteiinihävikki liuottamisen aikana vähentää näytteen informaatioarvoa. Tehokas uudelleenliuottaminen ultraäänellä auttaa säilyttämään mahdollisimman paljon analyyttiä.
4. Lopuksi ultraäänikäsittely nopeuttaa työnkulkua. Useita näytteitä käsittelevät proteomiikan laboratoriot tarvitsevat toimintavarmoja ja ajankäytöltään tehokkaita näytteenkäsittelymenetelmiä. Nopeasti ja täydellisesti liukeneva pelletti ei ole vain kätevä; se vähentää viiveitä, pienentää käsittelyvirheiden riskiä ja parantaa näytteiden käsittelykapasiteettia.

Ultraäänikäsittely verrattuna tavanomaisiin uudelleensuspendointimenetelmiin

Perinteisiin pellettien uudelleensuspendointimenetelmiin kuuluu tavallisesti pipetointia, sekoittamista, vorteksointia, pitkää inkubointia tai toistuvia lämmitysvaiheita. Vaikka nämä tekniikat voivat toimia löyhästi pakkautuneille pelleteille, ne ovat usein vaikeuksissa erittäin tiiviin tai hydrofobisen proteiinimateriaalin kanssa. Pelkkä mekaaninen sekoittaminen ei välttämättä hajota pellettirakennetta täysin, jolloin jäljelle jää näkyviä hiukkasia tai näkymättömiä liukenemattomia fraktioita.
Ultraäänikäsittely tarjoaa aktiivisemman ja kohdennetumman lähestymistavan. Sen sijaan, että se olisi riippuvainen puskurin hitaasta diffuusiosta, se hajottaa pelletin fysikaalisesti ja edistää nopeaa homogenointia. Tämä ei poista sopivan uudelleensuspendointipuskurin tarvetta, mutta tehostaa puskurin toimintaa huomattavasti.
Verrattuna täysin manuaalisiin menetelmiin ultraäänellä liuottaminen tarjoaa usein paremman prosessinhallinnan, suuremman tehokkuuden ja paremman soveltuvuuden vaativiin proteomiikan sovelluksiin. Tämä tekee ultraäänikäsittelystä houkuttelevan vaihtoehdon laboratorioille, jotka tavoittelevat sekä analyysien laatua että toiminnan luotettavuutta.

Parhaat käyttökohteet proteiinipellettien liuottamiselle ultraäänellä

Ultraäänellä liuottaminen on erityisen hyödyllistä työnkuluissa, joihin kuuluu:

• proteiinien saostaminen ennen massaspektrometriaa,
• solulysaateista tai kudosuutteista saatujen pellettien palauttaminen liuokseen,
• kalvorikkaiden tai aggregaatioherkkien proteiinien talteensaanti,
• ja näytteenkäsittely kvantitatiivista proteomiikkaa varten, jossa toistettavuus on olennaista.

Se on myös erittäin merkityksellistä, kun pellettejä on säilytetty, kuivattu liikaa tai valmistettu monimutkaisista biologisista matriiseista. Tällaisissa tapauksissa passiivinen uudelleensuspendointi voi muuttua erityisen tehottomaksi, kun taas ultraäänikäsittely auttaa palauttamaan näytteen käyttökelpoisuuden vähäisemmällä manuaalisella työllä.

Löydä paras ultraäänilaite proteiinien liuotustyönkulkuusi!

Arvokkaita näytteitä tai pieniä materiaalimääriä käsitteleville tai suuren näytteenkäsittelykapasiteetin proteomiikkaa harjoittaville laboratorioille Hielscherin valikoima tarjoaa useita ultraäänikäsittelymuotoja, jotka voidaan sovittaa tarkasti työnkulkuun.
Valitsetpa Hielscherin anturityyppisen ultraäänilaitteen, VialTweeter Multi-Tube Sonicator -laitteen tai UIP400MTP Microplate Sonicator -laitteen, jokainen ultraäänilaitemalli vastaa erilaiseen näytteenkäsittelytilanteeseen. Niillä kaikilla on kuitenkin sama keskeinen etu: toistettava ultraäänienergia tehokkaaseen ja hallittuun näytteenkäsittelyyn.

Anturityyppiset ultraäänilaitteet

Ultraäänianturit, kuten UP200Ht, soveltuvat erityisen hyvin yksittäisten näytteiden suoraan ultraäänikäsittelyyn. Proteomiikan laboratorioille UP200Ht on hyvä valinta, kun proteiinipelletit tarvitsevat intensiivistä uudelleensuspendointia pienissä tai keskisuurissa tilavuuksissa, erityisesti silloin, kun menetelmän hallinta ja toistettavuus ovat tärkeitä. Suora ultraäänikäsittely anturilla voi hajottaa tiivistä pellettimateriaalia nopeasti ja auttaa liuotuspuskureita saavuttamaan proteiinit, jotka muuten jäisivät osittain liukenematta.
Yleiskatsaus kaikista anturityyppisistä ultraäänilaitteista!
 
 
 

VialTweeter Multi-Tube Sonicator

Kun useita suljettuja näyteputkia on käsiteltävä samoissa olosuhteissa, Multi-Tube Sonicator VialTweeter tarjoaa selvän edun. VialTweeter mahdollistaa pienten tilavuuksien intensiivisen ultraäänikäsittelyn käsittelemällä useita suljettuja näyteputkia steriileissä olosuhteissa. Samanaikainen näytteenkäsittely useissa koeputkissa samoissa olosuhteissa sekä pienempi ristikontaminaation, näytehävikin ja aerosolien muodostumisen riski suljetuissa näyteputkissa tapahtuvan käsittelyn aikana tekevät laitteesta VialTweeter luotettavan näytteenkäsittelytyökalun. Proteomiikassa tämä on erittäin merkityksellistä käsiteltäessä arvokkaita pellettejä useista rinnakkaisnäytteistä tai kliinisistä näytteistä, jolloin putkien välinen yhdenmukaisuus on ratkaisevan tärkeää.
Lue lisää laitteesta VialTweeter!

Mikrolevyjen ultraäänilaite UIP400MTP

Suuren näytteenkäsittelykapasiteetin laboratorioissa mikrolevyjen ultraäänilaite UIP400MTP tuo ultraäänikäsittelyn edut levypohjaisiin työnkulkuihin. UIP400MTP kuvataan mikrolevyjen ja monikuoppalevyjen ultraäänilaitteena, joka mahdollistaa tasaisen ultraäänikäsittelyn standardilevyillä, mukaan lukien 96-kuoppaiset levyt, ja sen soveltuvuutta automatisoituun näytteenkäsittelyyn korostetaan esimerkiksi proteomiikan, diagnostiikan ja lääkekehityksen aloilla. Järjestelmä on suunniteltu useiden näytteiden samanaikaiseen käsittelyyn, ja sen etuja ovat esimerkiksi pienempi ristikontaminaatioriski, vähäisempi työvoiman tarve, parempi näytteiden talteensaanti ja integrointi automatisoituihin työnkulkuihin.
Käytännön proteomiikassa tämä tarkoittaa, että pellettien liuottaminen, solujen lyysi, uuttaminen ja niihin liittyvät näytteenkäsittelyvaiheet voidaan skaalata huomattavasti tehokkaammin. Yksittäisten näytteiden käsittelyn sijaan laboratoriot voivat ultraäänikäsitellä kokonaisia levyjä yhdenmukaisella energiansyötöllä. Tämä on arvokasta aina, kun työnkuluissa on yhdistettävä näytteenkäsittelykapasiteetti ja analyysien tarkkuus, esimerkiksi seulontatutkimuksissa, kvantitatiivisessa proteomiikassa tai vakioiduissa näytteenkäsittelyketjuissa. UIP400MTP ei siis ole vain työtä helpottava laite; se on järjestelmä, joka tukee laajempaa kehitystä kohti automaatiota, toistettavuutta ja toimintavarmaa suuren näytteenkäsittelykapasiteetin proteomiikkaa.
Lue lisää mikrolevyjen ultraäänilaitteesta UIP400MTP!

Suunnittelu, valmistus ja konsultointi – Saksassa valmistettua laatua

Hielscherin ultraäänilaitteet tunnetaan korkeimmista laatu- ja suunnittelustandardeistaan. Kestävyys ja helppokäyttöisyys mahdollistavat ultraäänilaitteidemme sujuvan integroinnin teollisuuslaitoksiin. Hielscherin ultraäänilaitteet selviytyvät helposti ankarista olosuhteista ja vaativista ympäristöistä.

Hielscher Ultrasonics on ISO-sertifioitu yritys, joka painottaa erityisesti suorituskykyisiä ultraäänilaitteita, joissa yhdistyvät huipputeknologia ja käyttäjäystävällisyys. Hielscherin ultraäänilaitteet ovat luonnollisesti CE-vaatimusten mukaisia ja täyttävät UL:n, CSA:n ja RoHs:n vaatimukset.

Kirjallisuus / viitteet

• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• Susana Jorge, Kevin Pereira, Hugo López-Fernández, William LaFramboise, Rajiv Dhir, Javier Fernández-Lodeiro, Carlos Lodeiro, Hugo M. Santos, Jose L. Capelo-Martínez (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, Volume 206, 2020.
• Lindemann C, Lupilova N, Müller A, Warscheid B, Meyer HE, Kuhlmann K, Eisenacher M, Leichert LI. (2013): Redox proteomics uncovers peroxynitrite-sensitive proteins that help Escherichia coli to overcome nitrosative stress. Journal of Biological Chemistry 288(27); 2013. 19698-714.
• Gonçalo Martins, Javier Fernández-Lodeiro, Jamila Djafari, Carlos Lodeiro, J.L. Capelo, Hugo M. Santos (2019): Label-free protein quantification after ultrafast digestion of complex proteomes using ultrasonic energy and immobilized-trypsin magnetic nanoparticles. Talanta, Volume 196, 2019. 262-270.