Ultraääni-DNA-pirstoutuminen seuraavan sukupolven sekvensointiin
Seuraavan sukupolven sekvensointi (NGS) edellyttää genomi-DNA:n luotettavaa sioitusta ja sirpaloitumista genomi-DNA-säikeiden sekvensoimiseksi ja genomikirjastojen luomiseksi. DNA:n hallittu sirpaloituminen DNA-fragmenttiksi on olennainen näytteenvalmistusvaihe, jota tarvitaan ennen DNA:n sekvensointia. Ultrasonication on osoittautunut tehokkaaksi ja luotettavaksi tekniikaksi tietyn pituiseen DNA-pirstoutumaan. Ultraääni-DNA:n pirstoutumisprotokollat saavuttavat toistettavissa olevia pirstoutumistutuloksia. Hielscher-ultraääniastiat pystyvät tuottamaan laajan valikoiman genomi-DNA-sirpalekokojakaumia, joita voidaan hallita tarkasti käyttöparametrien kautta. Koska Hielscherin ultraääni-DNA-vaaitusjärjestelmiä on saatavana yksi- ja useille injektiopulloille sekä mikrolevyille, näytteen valmistelusta tulee erittäin tehokasta.
E. colin EDL933: n genomisen DNA: n elektroforeettiset analyysit, jotka suoritettiin 0 - 15 min: n ultraääni. L osoittaa DNA-tikapuut. (Basselet et al. 2008)
- toistettavat / toistettavat tulokset
- tarkasti säädettävissä tietyn sirpalepituuden saamiseksi
- Nopea käsittely
- yhdenmukaiset DNA:n pirstoutumistustulokset
- laitteet näytemääriä varten (esim. useat injektiopullot tai mikrolevyt)
- suuri siirtonopeus
- tarkka lämpötilan säätö
- yksinkertainen, käyttäjäystävällinen toiminta
Seuraavan sukupolven sekvensointi: Ultraääni-DNA-pirstoutuminen kirjaston valmisteluun
Seuraavan sukupolven sekvensoitus on suoritettava (1) kirjaston valmistelun, 2) sekvensoitumisen ja 3) tietojen analyysin kolme perusvaihetta. Kirjaston valmistelun aikana DNA pirstoutetaan, sitten fragmentin päät korjataan (kiillotetaan) lisäämällä yksi adeniinipohja ja kohdefragmentit muunnetaan kaksisäikeiseksi DNA:ksi. Lopuksi niin sanotut sovittimet kiinnitetään ligation, PCR: n tai tagmentaation avulla, jotta lopullinen kirjaston DNA-tuote voidaan määrittää sekvensointia varten.
DNA:n pirstoutuminen sonikaatiolla: Varsinkin kun lyhytkestoiset sekvensointitekniikat, kuten Illumina, joka ei pysty lukemaan pidempiä DNA-fragmentteja helposti, DNA-telineet on pirstottava tiettyyn kokoon, joka voidaan saavuttaa luotettavasti ultrasonicationilla.
Ultrasonicationia voidaan luotettavasti käyttää DNA:n, RNA:n ja kromatiinin pirstoutumista varten.
Miten ultraääni-DNA-pirstoutuminen toimii?
Sonikaatio, joka tunnetaan myös nimellä akustinen näytteenkäsittely, on laajalti käytetty menetelmä DNA: n pirstomiseksi. Ultraääni-DNA-vaa'an näytteet altistetaan ultraääniaalloille valvotussa kunnossa. Ultraääni-DNA-fragmentaation toimintaperiaate perustuu ultraääniaaltojen synnyttämään värähtelyyn ja kavitaatioon. Ultraäänikavitaatiosta johtuvat leikkausvoimat rikkovat suuria molekyylipainoisia DNA-molekyylejä. Sonikaatioasetus, kuten voimakkuus (amplitudi, kesto), sykkimistila ja lämpötila, mahdollistavat tarkan DNA-sirpaloitumisen tiettyyn haluttuun DNA-fragmentin pituuteen. Vaikka DNA usein pienenee 100-600 bp käyttämällä ultrasonication, pidempiä DNA-fragmentteja jopa 1300 bp voidaan saada, kun lievempiä ultraääniolosuhteita sovelletaan.
Ultraääni-DNA-vaaitus ChIP: n aikana – Kromatiinin immunosaostus
Mukautettu Jkwchuista CC-BY-SA.03:n mukaisesti
Lämpötilan säätö DNA:n hajoamisen estämiseksi
DNA:n kaksisäikeinen molekyylimuoto on erittäin herkkä kohonneille lämpötiloille, joten lämpötilan tarkka hallinta näytteenvalmistusvaiheiden aikana on ratkaiseva tekijä luotettavien analyysitulosten kannalta.
Käytätpä sitten Hielscherin ultraäänimittapäätä, VialTweeteriä tai UIP400MTP:tä – jatkuva lämpötilan valvonta ja hallinta varmistetaan kytkettävän lämpötila-anturin ja älylaiteohjelmiston avulla. Jotta lämpötila pysyy tietyllä alueella, voit asettaa ylä- ja alalämpötilarajan. Näin ollen ultraäänilaite pysähtyy heti, kun tämä lämpötilaraja ylittyy, ja jatkaa automaattisesti sonicatea, kun lämpötila on laskenut ∆T.
Hielscher-ultraäänien hienostunut ohjelmisto takaa ihanteellisten näytekäsittelyolosuhteiden luotettavan ylläpidon.
Massanäytteen DNA-sirpaloituminen UIP400MTP-monikanavaisella levyn ultraäänitekniikalla
Elämäntieteen näytemäärät ovat kasvaneet merkittävästi viimeisen vuosikymmenen aikana. Tämä tarkoittaa, että erittäin suuri määrä näytteitä (esim. 384, 1536 tai 3456 kaivoa mikrolevyä kohti) on käsiteltävä näytteen valmistelun ja analyysin aikana johdonmukaisesti yhtäläisin edellytyksin vertailukelpoisten ja pätevien tulosten saamiseksi. UIP400MTP:n avulla Hielscher Ultrasonics seuraa massanäytteiden prosessointisuuntausta. UIP400MTP on ultraäänilaite näytteen valmistukseen mikrolevyillä. UIP400MTP voi käsitellä levyjä 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 tai 3456 kaivolla. Mikrolevytyypistä riippuen kussakin kussakin kussakin on tyypillisesti näytemääriä kymmenien nanolitrasta useisiin millilitroihin. UIP400MTP:tä käytetään laajalti elintieteellisessä tutkimuksessa, ja sitä käytetään hyvin yleisesti näytteiden valmistukseen ennen määritteitä, kuten ELISA (entsyymisidinen immunosorbenttimääritys) tai PCR: ää, ennen proteiinianalytiikkaa, sekä kromatiinin valmistukseen ennen CHiP: tä ja CHiP-seq: tä, histone-muuntelun tunnistamiseen ja muihin analyyttisiin hoitoihin (esim. geelektroforeesi, massaspektrometria).
Injektiopullo Enintään 10 injektiopullon näytteen praparointia varten
VialTweeter on laajalti käytetty laboratorio ultraäänilaite VialTweeter, joka mahdollistaa tehokkaan ja mukavan sonikoinnin jopa 10 injektiopulloa samanaikaisesti. Koska injektiopullot ja koeputket (esim. Eppendorf- injektiopullot, cryo- injektiopullot, sentrifugiputket) on äänitetty epäsuorasti, vältetään ristikontaminaatio. Koska sama ultraääni-voimakkuus toimitetaan jokaiselle näytteelle, kaikki sonikaatiotulokset ovat homogeenisia ja toistettavissa. VialTweeter tarjoaa kaikki älykkäät ominaisuudet, kuten muut digitaaliset laitteemme (esim. älykäs valikko, ohjelmoitavat asetukset, lämpötilan säätö, kaukosäädin jne.), jotta varmistetaan paras käyttömukavuus.
Microwell-levyjen monisormimittapäät
Saatavana ultraäänianturin homogenoiteille UP200Ht ja UP200St, monisormimittapäät, joissa on 4 tai 8 sormea, ovat mukava vaihtoehto sonitoida useita näytteitä samanaikaisesti samoissa olosuhteissa. Esimerkiksi sonotrode MTP-24-8-96 on kahdeksan sormen mittapää, joka on ihanteellinen integrointiin automatisoituihin järjestelmiin tai monikaivolevyjen kaivojen tehokkaaseen manuaaliseen näytteenvalmistusun. Monisorminen sonotrodi on ihanteellinen automatisoitu laboratorioihin, joissa käsitellään enimmäkseen nokka- ja koeputkia, joissa käytetään tavallista ultraääninobetrodia. Monisormi- ja vakioanturit voidaan vaihtaa nopeasti muutamassa minuutissa, mikä muuttaa yhden anturin ultraäänipuhdistajan monianturiseksi ultraäänihaitariksi.
Hielscher Ultrasonicators DNA-pirstoutumiseen
Hielscher Ultrasonics tarjoaa erilaisia ultraäänipohjaisia alustoja DNA:lle, RNA:lle ja kromatiinin pirstoutumiseen. Näihin eri alustoihin kuuluvat ultraäänianturit (sonotradat), epäsuorat sonikaatioratkaisut useiden putkien tai monikuokkilevyjen (esim. 96-well-levyt, mikrotitterilevyt), sonoreaktorien ja ultraäänikuppiloiden samanaikaiseen näytteen valmistukseen. Kaikki DNA-vaa'an alustat ovat taajuussäädettyjä, suorituskykyisiä ultraääni prosessoritiimia, jotka ovat tarkasti säätökelpoisia ja tuottavat toistettavia tuloksia.
Ultraääniprosessorit näytteelle ja koolle
Hielscherin moninäyte ultraääniaineilla VialTweeter (enintään 10 testiputkelle) ja UIP400MTP (mikrolevyille / monikerroksisille levyille) on helppo lyhentää näytteen käsittelyaikaa voimakkaan ja tarkasti hallinnan vuoksi, samalla kun saadaan haluttu DNA-sirpalekokojakauma ja saanto. Ultraääni-DNA-pirstoutuminen tekee näytteenvalmistuksen tehokkaaksi, luotettavaksi ja skaalautuvaksi. Protokollia voidaan lineaarisesti skaalata yhdestä lukuisiin näytteisiin soveltamalla jatkuvasti valvottua ultraäänitutkimusta.
Anturin ultraääniastiat, joissa on yhdestä viiteen sormea, ovat ihanteellisia pienempien näytelukujen valmistukseen. Hielscherin laboratorio ultraäänilaitteiden on saatavana eri kokoisina, jotta voimme suositella sinulle ihanteellista laitetta sovellukseesi ja vaatimuksiisi.
tarkka prosessinohjaus
Tarkasti hallinnan sonikaatioasetukset ovat ratkaisevan tärkeitä, koska tyhjentävä sonifikaatio voi tuhota DNA: n, RNA: n ja kromatiinin, mutta riittämätön ultraäänisäike johtaa liian pitkiin DNA- ja kromatiinirpaleisiin. Hielscherin digitaaliset ultraääniastiat voidaan helposti asettaa tarkkoihin sonikaatioparametreihin. Tietyt sonikaatioasetukset voidaan tallentaa myös ohjelmoituna asetuksena saman menettelyn nopeaa toistamista varten.
Kaikki sonikaatiot protokollataan ja tallennetaan automaattisesti CSV-tiedostona sisäänrakennetulle SD-kortille. Tämä mahdollistaa suoritettujen kokeiden tarkan dokumentoinnin ja mahdollistaa sonikoinnin tarkistamisen helposti.
Selaimen kaukosäätimellä kaikkia digitaalisia ultraääniaimia voidaan käyttää ja valvoa minkä tahansa vakioselaimen kautta. Lisäohjelmiston asentamista ei tarvita, koska lähiverkkoyhteys mahdollistaa hyvin yksinkertaisen plug-n-play-asennuksen.
Paras käyttäjäystävällisyys ultraääninäytteiden valmistelussa
Kaikki Hielscher-ultraäänikoneet on suunniteltu tuottamaan tehokas ultraääni, mutta samalla ne ovat aina erittäin käyttäjäystävällisiä ja helppokäyttöisia. Kaikki asetukset on jäsennelty hyvin selkeään valikkoon, johon pääsee helposti värillisillä kosketusnäytöillä tai selaimen kaukosäätimellä. Älykäs ohjelmisto, jossa on ohjelmoitavissa olevia asetuksia ja automaattinen tietojen tallennus, takaa optimaaliset sonikaatioasetukset luotettaville ja toistettavissa oleville tuloksille. Puhdas ja helppokäyttöinen valikkoliittymä muuttaa Hielscherin ultraäänilaitteet käyttäjäystävällisiksi ja tehokkaiksi laitteiksi.
Alla olevassa taulukossa on viitteitä laboratorion ultraääniaintemme likimääräisen prosessointikapasiteetin kapasiteetista, jotka ovat ihanteellisia näytteenvalmistustehtäviin, kuten DNA: n ja RNA: n pirstoutumiseen, solulyysiin sekä proteiinin uuttamiseen:
| Laite | Teho [W] | Tyyppi | Tilavuus [ml] |
|---|---|---|---|
| UIP400MTP-työkalu | 400 | mikrolevyille | 6 – 3456 kaivoa | VialTweeter | 200 | enintään 10 injektiopullolle ja puristinmahdollisuudelle | 00,5 – 1,5 |
| UP50H | 50 | Probe-tyyppinen | 00,01 – 250 |
| UP100H | 100 | Probe-tyyppinen | 00,01 – 500 |
| Uf200 ः t | 200 | Probe-tyyppinen | 00,1 – 1000 |
| UP200St | 200 | Probe-tyyppinen | 00,1 – 1000 |
| UP400St | 400 | Probe-tyyppinen | 5,0 – 2000 |
| Cuphorn | 200 | CupHorn, sonoreaktori | 10 – 200 |
| GDmini2 | 200 | kontaminoitumaton virtaussolu |
Ota meihin yhteyttä! / Kysy meiltä!
Ultraääni moninäytevalmisteyksikkö VialTweeter mahdollistaa jopa 10 injektiopullon samanaikaisen sonikoinnin. VialPress-puristinlaitteella voidaan painaa jopa 4 lisäputkea eteen voimakasta sonikaatiota varten.
Sonotrode MTP-24-8-96:ssa on kahdeksan ultraäänianturia mikrotitterilevyjen kaivojen sonikaatioon.
Kirjallisuus / Referenssit
- Poptsova, M., Il’icheva, I., Nechipurenko, D. et al. (2014): Non-random DNA fragmentation in next-generation sequencing. Scientific Reports 4, 4532; 2014.
- Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): Sample processing for DNA chip array-based analysis of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). Microbial Cell Factories 7:29. 2008.
- Doublier S., Riganti Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA Silencing Reverts the Resistance to Doxorubicin in Human Colon Cancer Cells. Molecular Cancer Research 6(10), 2008.
- Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid N.H.H., Simonsson M. (2008): Method evaluation of Fusarium DNA extraction from mycelia and wheat for down-stream real-time PCR quantification and correlation to mycotoxin levels. Journal of Microbiological Methods 2008.
- Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Characterization of the growth behavior of Leishmania tarentolae – a new expression system for recombinant proteins. Journal of Basic Microbiology 47, 2007. 384–393.
- Ristola M., Arpiainen S., Saleem M. A., Mathieson P. W., Welsh G. I., Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Regulation of Neph3 gene in podocytes – key roles of transcription factors NF-κB and Sp1. BMC Molecular Biology 10:83, 2009.
- Rodriguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Munoz M., Vendrell E., Peinado M. A. (2008): Genome-wide tracking of unmethylated DNA Alu repeats in normal and cancer cells. Nucleic Acids Research Vol. 36, No. 3, 2008. 770-784.
- Weiske J. Huber O. (2006): The Histidine Triad Protein Hint1 Triggers Apoptosis Independent of Its Enzymatic Activity. The Journal of Biological chemistry. Vol. 281, No. 37, 2006. 27356–27366.
Tosiasiat, jotka kannattaa tietää
Mikä on seuraavan sukupolven sekvenssi?
Seuraavan sukupolven sekvensoimalla, myös Next Gen Sequencing (NGS), suurilla määrillä sekvensoimalla tai toisen sukupolven sekvensoimalla, tarkoitetaan massiivisen rinnakkaisen sekvensoinnin lähestymistapaa, jossa erittäin suuret (massiiviset) määrät miljoonien sirpaleita sekvensoituvat samanaikaisesti juoksua kohden.
Seuraavan sukupolven sekvensoitus on suoritettava (1) kirjaston valmistelun, 2) sekvensoitumisen ja 3) tietojen analyysin kolme perusvaihetta. Kirjaston valmistelun aikana DNA-säikeet on sirpattava tietyn pituisiksi DNA-palasiksi. Sonikaatio on yksi suositeltava tekniikka DNA:n pirstomiseen.
DNA-sekvensoitusprosessin aikana nukleotidien järjestys DNA:ssa – tunnetaan nimellä nukleiinihapposekvenssi – määritetään. Nukleiinihapposekvenssi koostuu neljästä nukleotidietähdestä – adeniinista, sytosiinista, guaniinista, tyriinistä – mikä koodi tiedoksi.
Seuraavan sukupolven sekvensointi ohjaa life sciencen ja personoidun lääketieteen tutkimusta, koska DNA- ja RNA-sekvensointia käytetään voimakkaasti genomitutkimuksessa, syöpätutkimuksessa, harvinaisten ja monimutkaisten sairauksien tutkimuksessa, mikrobitutkimuksessa, maatalousgenomiikassa ja monilla muilla tutkimusaloilla.
Seuraavan sukupolven sekvenssi vs. Sanger-sekvenssi
Vaikka seuraavan sukupolven sekvensointi (NGS) on mahdollista sekvensoida massiivisia määriä genominäytteitä, Sanger Sequencing (tunnetaan myös nimellä ketjun lopetusmenetelmä tai ensimmäisen sukupolven sekvensointi) pystyy sekvensoimaan vain pieniä näytelukuja. Sangerin sekvensoiminen sekvensoi vain yhden DNA-fragmentin kerrallaan, ja se voidaan suorittaa yhdessä päivässä. Acccuracyn vuoksi Sangerin sekvensointia pidetään myös kultastandarditekniikkana, jota käytetään seuraavan sukupolven sekvensoimalla saatujen tulosten todentamisessa.
Sanger-sekvensoimalla saavutetaan noin 800bp:n lukupituus (tyypillisesti 500–600 bp rikastamattomalla DNA:lla). Sangerin sekvensointien pidemmät lukupituusedut ovat merkittäviä muita sekvensointimenetelmiä enemmän, erityisesti genomin toistuvien alueiden sekvensoimisen kannalta. Lyhytkeksisen sekvenssitiedon haaste on erityisen tärkeä uusien genomien (de novo) sekvensoinnissa ja hyvin uudelleen järjestettyjen genomisegmenttien sekvensoinnissa, tyypillisesti syövän genomeissa tai kromosomialueilla, joilla on rakenteellista vaihtelua. [cp. Morozova ja Marra, 2008]
Hielscher Ultrasonics valmistaa korkealaatuisia ultraäänihomygenisoijia laboratorio että teollisen koon mukaan.