Hielscher Ultra ääni tekniikka

Ultraääni-DNA leikkaus

  • DNA: n ja RNA: n leikkauksen aikana DNA-molekyylit hajoavat pienempiin kappaleisiin. DNA / RNA-fragmentaatio on yksi tärkeimmistä esitäyttösovellusvaiheista, joita tarvitaan luomaan kirjastot seuraavan sukupolven sekvensointiin (NGS).
  • Ultraääni-DNA leikkaus käyttää akustisen kavitaation voimia murtaakseen DNA: n tai RNA: n 100 kappaleeseen – 5 kt bp.
  • Ultraäänileikkaus mahdollistaa tarkan DNA-pirstoutumisen ja sopeuttamisen haluttuun DNA-pituuteen.

Ultraääni-DNA leikkaus

Hielscher Ultrasonics tarjoaa erilaisia ​​ultrasound-pohjaisia ​​ratkaisuja DNA: lle, RNA: lle ja kromatiinileikkaukselle. Valitse mittapäätyyppisten ultraäänilaitteiden (esim. UP100H) suorasta sonikoinnista mikrotipillä tai käytä VialTweeeter-laitetta tai ultraääni-kuparia erilaisten näytteiden epäsuoraan DNA-valmistukseen samanaikaisesti. Hielscher tarjoaa ihanteellisen laitteen tarpeidesi mukaan: onko sinulla yksi tai jopa 10 näytettä, tilavuudet mikrolitista litroihin – Hielscherin ultraääniprosessorit ovat käytettävissä vastaamaan tarpeitasi DNA: n, RNA: n ja kromatiinifragmenttien valmistamiseksi oikealla pituudella. Uusittavuus, helppo käyttö ja tarkka valvonta mahdollistavat luotettavan kirjaston seuraavan sukupolven sekvensointiin.
Päinvastoin kuin entsymaattinen DNA-fragmentaatio, ultraääni leikkaus koskee puhtaita mekaanisia leikkausvoimia lisäämättä kemikaaleja. Prosessiparametrien täsmällisellä asetuksella ultraäänileikkaus tuottaa suurimolekyylipainoisia DNA-fragmentteja (plasmidi ja genominen DNA).
Puhdistettuja nukleiinihappoja voidaan monistaa ennen fragmentaatiovaiheen tai sen jälkeen.
Sonikaatioparametrit (teho, pulssi / purskeet, aika ja lämpötila) voidaan ohjata turvallisesti ohjelmiston asetusten avulla.

edut:

  • tarkka valvonta
  • sonikaatiosyklejä ja ajan, joka on tarkasti sovitettavissa haluttuun DNA-kokoon
  • suurimolekyylipainoiset DNA-fragmentit
  • lämpötilan säätö
  • Nopeasti
  • toistettavia tuloksia
  • autoklavoitava
  • erilaiset ratkaisut: Probe-tyyppinen, VialTweeter ja Cuphorn

Pöytäkirjat ultraääni-DNA: n leikkaukseen

Kromatiinin immuunisaostusmääritykselle

Lyhyesti, solut maljattiin 60 mm: n halkaisijoille (400 000 kpl) ja transfektoitiin RhoA siRNA: lla (kuten on kuvattu); 72 h kuluttua niitä inkuboitiin formaldehydillä (loppukonsentraatio, 1%) 10 minuutin ajan 37 ° C: ssa ristisilloitusproteiineja DNA: han. Silloitusreaktio sammutettiin lisäämällä yksi kymmenesosa tilavuudesta 1,25 mol / l glysiiniä, jolloin lopullinen konsentraatio oli 125 mmol / l. Solut pestiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä, suspendoitiin uudelleen radioimmunosaostusmäärityspuskuriin [150 mmol / 1 NaCl, 1% NP40, 0,5% deoksikolaatti, 0,1% SDS, 5 mmol / l EDTA, 50 mmol / l Tris-HCl (pH 8,0 )], joka sisälsi 1 mmol / 1 fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 1 Ag / ml aprotiniinia ja 1 Ag / ml pepstatiinia A ja pidettiin jäillä 30 minuuttia. Sitten solulysaatteja sonikoitiin jäillä a Hielscher UP200S ultrasound sonicator (3 x 40 s, amplitudi 40%, sykli 1, Hielscher Ultrasonics GmbH), kunnes silloitetut kromatiteetit leikattiin tuottamaan DNA-fragmentteja 200 ja 1 000 bp: n välillä. Yksi kymmenesosa koko lysaatista käytettiin erilaisten näytteiden DNA: n määrän määrittämiseen ja sitä pidettiin “kokonaisen tulo-DNA: n”. Supernatantteja inkuboitiin lohen sperman DNA / proteiini-agaroosi-50% lietteellä vähentämään epäspesifistä taustaa. Immunosaostus tehtiin sitten yön yli 4 ° C: ssa anti-NF-nB p65: n (Upstate) 5-ag: lla tai ilman vasta-ainetta (negatiivinen kontrolli). Näitä supernatantteja täydennettiin 5 mol / l NaCl: llä ja kuumennettiin yön yli 65 ° C: ssa proteiini-DNA: n ristiliitosten palauttamiseksi. Immunokompleksit käsiteltiin edelleen DNaasi- ja RNaasittomalla proteinaasi K: lla ja DNA puhdistettiin fenoli / kloroformi-uuttamalla ja etanolisaostuksella. PCR tehtiin spesifisinä alukkeina, jotka vastaavat ihmisen iNOS-geenin promoottorialueella olevaa sekvenssiä (p1-aluke: 5'-GAGGGCTTTCCCA-GAACCAAG-3¶; p2-aluke: GCTGGGCTACTGACCCAG-CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et ai., 2008)

EGFP-ilmentymistutkimukset

Ilmentymistutkimuksissa viljeltiin rekombinanttikanta L. tarentolae p10 :: F9Begfp1.4dBsat # 12 (Jena Bioscience, Saksa) EGFP: n (Enhanced Green Fluorescent Protein), integroidun kromosomaalisen geenin geeniin, eri väliaineilla, kuten aikaisemmin on kuvattu ja lisäksi täydennetään 100 mg: lla l-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Saksa). Viljelyn aikana otettiin 1 ml näytteitä, sentrifugoitiin (2000 x g, 20 ° C, 10 min) ja pestiin 0,9% NaCl-liuoksella. Pelletti suspendoitiin uudelleen puskuriin (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) ja hajotettiin sonifioimalla ultraääniprosessorilla Up400s (energian käyttö ~ 400 Ws). Solujätteet poistettiin sentrifugoimalla (6000 x g, 4 ° C, 5 min) ja analysoitiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE) pelkistävissä olosuhteissa Laemmli (1970) -menetelmän mukaisesti 12,5% polyakralamidi-geeleillä . EGFP-ilmentyminen tutkittiin sekoitetussa viljelmässä. (Fritsche et ai., 2007)

Hielscher's UP100H was used to prepare EHEC DNA for chip array analysis

E. colin EDL933: n genomisen DNA: n elektroforeettiset analyysit, jotka suoritettiin 0 - 15 min: n ultraääni. L osoittaa DNA-tikapuut. (Basselet et al. 2008)

Informaatio pyyntö




Huomaa, että Tietosuojakäytäntö.


Kromatiinin immunosaostus

Ultraääni-solun hajotin UP100H (100W) lyysiä, solujen häiriöitä ja DNA leikkausta varten.Kromatiinin immunosaostusmääritys suoritettiin käyttäen ChIP-IT: täTm Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaan ja joitain muutoksia. Lyhyesti, erilaistuneet ihmis-podosyytit silloitettiin 1% formaldehydillä 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Solut pestiin jääkylmällä PBS: llä ja kiinnitysreaktio pysäytettiin lisäämällä 0,125 M glysiiniä 5 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Solut pestiin jälleen jääkylmällä PBS: llä ja kaavitettiin lautasesta. Solut pelletoitiin sentrifugoimalla ja suspensoitiin uudelleen hajotuspuskurissa. Sentrifugoinnin jälkeen pelletoidut ytimet suspendoitiin uudelleen leikkauspuskurissa, inkuboitiin jäillä 30 minuuttia ja kromatiini leikattiin sonikoimalla, esim. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Saksa) 25%: n teholla 5 pulssia 20 sekuntia jokaista jäätä noin 200-600 bp: n fragmentteihin. Sitten leikattu kromatiini sentrifugoitiin ja supernatantti kerättiin talteen. Immunosaostumuksia varten inkuboitiin 60 ui kromatiinia 1 ug: lla Sp1: tä (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-KBB65 (Abcam, Cambridge, UK) tai NF-KBB50 (Abcam) -vasta-aineita tai kanin IgG (Zymed Laboratories, Etelä-San Francisco, CA, USA), negatiivisena kontrollina, yön yli 4 ° C: ssa hellävaraisella pyörimisellä. Magneettihelmiin sidotut immunokompleksit kerättiin käyttäen magneettista jalustaa, pestiin laajasti ja proteiini / DNA-ristiinkytkimet päinvastoin ja DNA eluoitiin reaaliaikaiselle PCR-analyysille. (Ristola ym. 2009)

EHEC-DNA: n valmistaminen sirutason analyysiin

Solulysaattien ja uutettujen DNA: iden järjestely
PBS: ään suspendoituja bakteeripellettejä haluttuun loppukonsentraatioon käsiteltiin ultraäänihäiriö UP100H (Hielscher GmbH, Saksa), jossa oli mikrotippi MS1 (halkaisija 1 mm). Käyttötaajuus oli 30 kHz ja tehollinen teho oli 100 W. Toimenpiteen aikana näytteet jäähdytettiin jäävesihauteessa, sekoitettiin ja sentrifugoitiin. Näytteitä käytettiin virtaussytometrian tutkimuksissa, kun taas myöhempää käsittelyä varten näytteille suoritettiin lämpökäsittely (95 ° C, 5 min). Raakasolulysatteja käsiteltiin fenoli: kloroformi: isoamyylialkoholin (25: 24: 1) seoksella. Samanlainen tilavuus tätä seosta lisättiin lysaattinäyte, liuos vorteksoitiin voimakkaasti 15 s ja sentrifugoitiin 15 000 xg 2 min huoneenlämpötilassa (RT) noin 22 ° C: ssa. Genomisen DNA: n sisältävä ylimmäinen vesifaasi erotettiin huolellisesti ja kerättiin uudesta steriilistä Eppendorf-putkesta.
Tämän jälkeen näytteet sonikoitiin DNA: n fragmentoitumiseksi. Sonikaatiovaihe toteutettiin samoissa olosuhteissa kuin edellä on kuvattu. Genomisen DNA: n fragmentaatiovaikutusten arvioimiseksi näytteet analysoitiin agaroosigeelielektroforeesilla.
(…) Näytteet, jotka oli sonikoitu aiemmin 2,5 min, altistettiin uuttovaiheelle lämpökäsittelyn ja sentrifugoinnin jälkeen. Vapautunut DNA uutettiin kaksi kertaa fenoli: kloroformi: isoamyylialkoholisekoituksella ja sen jälkeen altistettiin toiselle sonikaatiolle 0 - 15 min. Agaroosigeelielektroforeesia käytettiin DNA: n kokojakauman määrittämiseen, joka oli altistettuna ultraäänipikkuvan jälkikäsittelyn jälkeen (kuvio oikeassa yläkulmassa). Erittäin pirstoutunut DNA havaittiin DNA-tahron läsnäolosta pikemminkin kuin suurimolekyylipainoisilla kaistoilla, jotka oli eliminoitu näytteistä, jotka sonikoitiin 2,5 min tai kauemmin. Pitempi sonikointi vähensi vähitellen fragmentin pituutta noin 150 - 600 bp: seen ja sonikaatio 15 minuutin ajan heikensi edelleen näitä fragmentteja, kuten useimmiten on havaittavissa pinnan yläosasta. Siten keskimääräinen DNA-fragmentin koko pieneni vähitellen ultraäänisoitumisaikaa ja 5 minuutin käsittelyn annettiin saada aikaan siru-array-määrityksiin parhaiten soveltuvat DNA-fragmenttien koot. Lopuksi määritettiin DNA-analyytinvalmistusmenetelmä, joka käsittää ensimmäisen 2 minuutin ultraäänikäsittelyn, DNA-uuttoa (2 x) ja sen jälkeen 5 minuutin sonikoimista. (Basselet et al. 2008)

Kromatiinin immuunisaostus (ChIP)

Ultra ääni prosessori UP100H DNA, RNA ja Chromatin shearing. (Klikkaa suuremmaksi!)HEK293-soluja viljeltiin edellä kuvatulla tavalla ja kiinnitettiin 2 mM disukkinimidyyli- glutaraatilla 45 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Tämän jälkeen solut pestiin kahdesti PBS: llä. Kromatiini ristiliitettiin 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa käyttäen 1% (v / v) formaldehydiä ja pestiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä. Silloitusreaktio pysäytettiin inkuboimalla glysiinin kanssa lopullisessa pitoisuudessa 0,125 M 5 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Trypsiinin kanssa inkuboinnin jälkeen solut kaavittiin soluviljelyastiaan ja pestiin kahdesti PBS: llä. Solupelletti suspendoitiin uudelleen hajotuspuskurissa (5 mM Putket, pH 8,0, 85 mM KCl ja 0,5% (v / v) Nonidet P-40), inkuboitiin jäillä 10 min ja homogenisoitiin Dounce-homogenisaattorilla. Tämän jälkeen ytimet pelletoitiin sentrifugoimalla (3500 xg, 5 min, 4 ° C) ja suspendoitiin uudelleen ydinpuskuriin (50 mM Tris-HCI, pH 8,1, 10 mM EDTA ja 1% (paino / tilavuus) SDS). Nuclei häiriintyi sonikaatiolla kolmella 20-pulssilla a UP50H hajoittamiseksi (Hielscher Ultraschall Technologie) syklin 0,5 ja amplitudin 30% asettamisessa, jolloin saadaan genomisia DNA-fragmentteja, joiden koko on 200-1000 bp. ChIP: n suhteen 50 g DNA: ta laimennettiin 4-kertaisesti immunosaostuspuskurissa (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (til./til.) Triton X-100 ja 0,01% v) SDS). (Weiske et ai., 2006)

Histoni-modifikaatioanalyysi kromatiinin immunosaostuksella (ChIP)

Lyhyesti, 6 x 106 solut pestiin kahdesti PBS: llä ja ristisilloitettiin viljelylevylle 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa 0,5-prosenttisen formaldehydin läsnäollessa. Ristisilloitusreaktio pysäytettiin lisäämällä 0,125 M glysiiniä. Kaikki seuraavat vaiheet suoritettiin 48 ° C: ssa. Kaikki puskurit esihyytettiin ja sisälsivät proteaasi-inhibiittoreita (Complete Mini, Roche). Solut pestiin kahdesti PBS: llä ja kaavittiin sitten. Kerätyt pelletit liuotettiin 1 ml: aan lyysauspuskuria (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) ja sonikoitiin kylmässä etanolikylvyssä 10 sykliä 100%: n amplitudilla käyttämällä UP50H hajoittamiseksi (Hielscher, Teltow, Saksa). Kromatiinifragmentaatio visualisoitiin 1-prosenttisessa agaroosigeelissä. Saadut fragmentit olivat 200-500 pb: n alueella. Liukoinen kromatiini saatiin sentrifugoimalla sonikaattiset näytteet 14 000 g: n lämpötilassa 10 minuutin ajan 48 ° C: ssa. Liukoinen fraktio laimennettiin 1/10 laimennuspuskurissa (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) ja sitten jaettiin ja varastoitiin 80 ° C: ssa käyttöä varten. (Rodriguez et ai., 2008)

Laite Teho [W] Tyyppi Tilavuus [ml]
VialTweeter 200 erillinen 00,5 1,5
UP50H 50 kädessä pidettävässä tai valmiustilassa 00,01 250
UP100H 100 kädessä pidettävässä tai valmiustilassa 00,01 500
Uf200 ः t 200 kädessä pidettävässä tai valmiustilassa 00,1 1000
UP200St 200 standasennettava 00,1 1000
UP400St 400 standasennettava 5,0 2000
Cuphorn 200 CupHorn, sonoreaktori 10 200
GDmini2 200 kontaminoitumaton virtaussolu

Informaatio pyyntö




Huomaa, että Tietosuojakäytäntö.


Hielscher's VialTweeter is is´deal for the simultaneous preparation of multiple samples

VialTweeter ultraäänimaisen näytteen valmistamiseksi

Ota meihin yhteyttä! / Kysy meiltä!

Kysy lisä tietoja

Käytä alla olevaa lomaketta, jos haluat lisätietoja ylimääräisestä homogenoinnista. Olemme iloisia voidessamme tarjota sinulle ultrasonic-järjestelmän, joka vastaa tarpeitasi.









Huomaathan, että Tietosuojakäytäntö.


Kirjallisuus / Viitteet

  • Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): Näyteprosessointi enterohemorrhagisen Escherichia colin (EHEC) DNA-chip-array-analyysiin. Mikrobiologiset solutehtaat 7:29. 2008.
  • Doublier S., Riganti Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA-hiljaisuus palauttaa resistenssin doksorubisiinille ihmisen paksusuolen syöpää soluissa. Molecular Cancer Research 6 (10), 2008.
  • Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid NHH, Simonsson M. (2008): Fusarium-DNA: n uuttamismenetelmän arviointi myseelistä ja vehnästä alaspäin reaaliaikaiselle PCR-kvantifioimiselle ja korrelaatiolle mykotoksiinipitoisuuksille . Journal of Microbiological Methods 2008.
  • Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Leishmania tarentolae: n kasvukäyttäytymisen karakterisointi - uusi ilmentämisjärjestelmä rekombinanttiproteiineille. Journal of Basic Microbiology 47, 2007. 384-393.
  • Ristola M., Arpiainen S., Saleem MA, Mathieson PW, Walesin GI, Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Neph3-geenin säätely podosyyteissä - transkriptiotekijöiden NF-κB ja Sp1 keskeiset roolit. BMC Molecular Biology 10:83, 2009.
  • Rodriguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Munoz M., Vendrell E., Peinado MA (2008): Genomin laajuinen seuranta metyloimattomien DNA-Alu-toistojen suhteen normaaleissa ja syöpäsoluissa. Nucleic Acids Research Vol. 36, nro 3, 2008. 770 - 784.
  • Weiske J. Huber O. (2006): Histidiinitriaksien proteiinihintti1 herättää apoptoosin riippumattomaksi sen entsymaattisesta aktiivisuudesta. Journal of Biological chemistry. Vol. 281, nro 37, 2006. 27356 - 27366.


Tosiasiat, jotka kannattaa tietää

Ultraääni / akustinen kavitaatio luo voimakkaita voimia, jotka edistävät kiteytymistä ja saostumista (Click to enlarge!)

Ultraääni-DNA leikkaus perustuu akustiseen kavitaatioon ja sen hydrodynaamiin leikkausvoimiin