Ultraääni-DNA-leikkaus

DNA: n ja RNA: n leikkaamisen aikana pitkät DNA-molekyylit pirstoutuvat pienemmiksi paloiksi, mikä on ratkaiseva vaihe näytteiden valmistelussa seuraavan sukupolven sekvensointikirjaston (NGS) rakentamista varten. Ultraääni-DNA-leikkaus käyttää akustisia kavitaatiovoimia DNA: n tai RNA: n hajottamiseksi fragmenteiksi, jotka vaihtelevat välillä 100 bp - 5 kb. Tämä menetelmä mahdollistaa fragmenttikoon tarkan hallinnan, mikä helpottaa räätälöintiä haluttuun DNA-pituuteen optimaalisten sekvensointitulosten saavuttamiseksi.

DNA-leikkaus ultraäänellä

Hielscher Ultrasonics tarjoaa erilaisia ultraäänipohjaisia ratkaisuja DNA: n, RNA: n ja kromatiinin leikkaamiseen. Valitse koetintyyppisten ultraäänilaitteiden (esim. UP100H) välillä suoraa sonikaatiota varten mikrokärjen avulla tai käytä VialTweeeteriä tai ultraäänikuppia eri näytteiden epäsuoraan DNA-valmistukseen samanaikaisesti. Hielscher tarjoaa ihanteellisen laitteen tarpeisiisi nähden: jos sinulla on 1 tai enintään 10 näytettä, tilavuuksia mikrolitrasta litraan – Hielscher-sonikaattorit täyttävät vaatimuksesi valmistaa DNA-, RNA- ja kromatiinifragmentteja oikealla pituudella. Toistettavuus, helppokäyttöisyys ja tarkka ohjaus mahdollistavat luotettavan kirjaston seuraavan sukupolven sekvensointia varten.
Toisin kuin entsymaattinen DNA-pirstoutuminen, ultraäänileikkaus käyttää puhtaita mekaanisia leikkausvoimia lisäämättä kemikaaleja. Prosessiparametrien tarkalla asettamisella ultraäänileikkaus tuottaa suurimolekyylipainoisia DNA-fragmentteja (plasmidi- ja genominen DNA).
Puhdistetut nukleiinihapot voidaan monistaa ennen pirstoutumisvaihetta tai sen jälkeen.
Sonikaatioparametreja (teho, pulssisykli / purskeet, aika ja lämpötila) voidaan ohjata turvallisesti ohjelmistoasetusten avulla.

Protokollat ultraääni-DNA-leikkaukseen

Kromatiinin immunosaostusmääritystä varten

Lyhyesti sanottuna solut päällystettiin halkaisijaltaan 60 mm: n astioissa (400 000 per astia) ja transfektoitiin RhoA siRNA: lla (kuten on kuvattu); 72 tunnin kuluttua niitä inkuboitiin formaldehydillä (lopullinen pitoisuus 1 %) 10 minuutin ajan 37 °C:ssa proteiinien silloittamiseksi DNA:han. Silloitusreaktio sammutettiin lisäämällä kymmenesosa tilavuudesta 1,25-molaarista glysiiniä, jolloin saatiin lopullinen konsentraatio 125 mmol/l. Solut pestiin kahdesti jääkylmällä PBS:llä, suspendoitiin uudelleen radioimmunosaostusmäärityspuskuriin [150 mmol/l NaCl, 1 % NP40, 0,5 % deoksikolaatti, 0,1 % SDS, 5 mmol/l EDTA, 50 mmol/l Tris-HCl (pH 8,0)], joka sisälsi 1 mmol/l fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 1 Ag/ml aprotiniinia ja 1 Ag/ml pepstatiini A:ta, ja pidettiin jäällä 30 minuuttia. Sitten solulysaatit sonikoitiin jäällä a Hielscher UP200S ultraäänilaite (3 x 40 s, amplitudi 40%, sykli 1; Hielscher Ultrasonics GmbH), kunnes silloitetut kromatiinit leikattiin DNA-fragmenttien saamiseksi välillä 200 - 1,000 bp. Kymmenesosaa kokonaislysaatista käytettiin kvantitoimaan eri näytteissä olevan DNA:n määrää ja sitä pidettiin “DNA:n kokonaismäärä”. Supernatantteja inkuboitiin lohen siittiöiden DNA/proteiini agaroosi-50% lietteellä epäspesifisen taustan vähentämiseksi. Immunosaostus tehtiin sitten yön yli 4 °C:ssa 5 Ag:lla anti-NF-nB p65:tä (Upstate) tai ilman vasta-ainetta (negatiivinen kontrolli). Näitä supernatantteja täydennettiin 5 mol/l NaCl:lla ja kuumennettiin yön yli 65 °C:ssa proteiini-DNA-ristisidosten palauttamiseksi. Immunokomplekseja käsiteltiin edelleen DNaasi- ja RNaasittomalla proteinaasi K:lla, ja DNA puhdistettiin fenoli/kloroformiuutolla ja etanolisaostuksella. PCR tehtiin spesifisillä alukkeilla, jotka vastasivat sekvenssiä ihmisen iNOS-geenin promoottorialueella (p1-aluke: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2-alukke: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et ai., 2008)

EGFP-ilmentymistä koskevat tutkimukset

Ilmentymistutkimuksissa rekombinanttikantaa L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Saksa) EGFP:n (Enhanced Green Fluorescent Protein) geenillä, kromosomi-ssu integroituna, viljeltiin eri väliaineissa aiemmin kuvatulla tavalla ja täydennettiin lisäksi 100 mg:lla l^-1 Nourseotrisiini (Jena Bioscience, Saksa). Viljelyn aikana otettiin 1 ml näytteitä, sentrifugoitiin (2000 × g, 20 °C, 10 min) ja pestiin 0,9-prosenttisella NaCl-liuoksella. Pelletti suspendoitiin uudelleen puskuriin (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) ja hajotettiin sonifikaamalla ultraääniprosessorilla UP400S (energian käyttö ∼ 400 Ws). Solujätteet poistettiin sentrifugoimalla (6000 × g, 4 °C, 5 min) ja analysoitiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE) pelkistysolosuhteissa Laemmlin (1970) menetelmän mukaisesti 12,5% polyakraamidigeeleillä. EGFP:n ilmentymistä tutkittiin kiihtyneessä viljelmässä. (Fritsche ym. 2007)

kromatiinin immunosaostus

Kromatiinin immunosaostusmääritys suoritettiin ChIP-IT:llä^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti tietyin muutoksin. Lyhyesti sanottuna erilaistuneet ihmisen podosyytit silloitettiin 1% formaldehydin kanssa 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Solut pestiin jääkylmällä PBS:llä ja kiinnitysreaktio pysäytettiin lisäämällä 0,125 M glysiiniä 5 minuutin ajan huoneenlämmössä. Solut pestiin uudelleen jääkylmällä PBS: llä ja kaavittiin astiasta. Solut pelletoidaan sentrifugoimalla ja suspendoidaan uudelleen lyysipuskuriin. Sentrifugoinnin jälkeen pelletoidut ytimet suspendoitiin uudelleen leikkauspuskuriin, inkuboitiin jäällä 30 minuutin ajan ja kromatiini leikattiin sonikaatiolla, esim. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Saksa) 25%: n teholla 5 pulssia 20 sekuntia kukin jäällä noin 200–600 bp: n palasiksi. Sitten leikattu kromatiini sentrifugoitiin ja supernatantti kerättiin. Immunosaostuksia varten 60 μl kromatiinia inkuboitiin negatiivisena kontrollina 1 μg:lla Sp1:tä (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, Iso-Britannia) tai NF-κB p50 (Abcam) -vasta-aineita tai negatiivisena kontrollina kanin IgG:tä (Zymed Laboratories) yön yli 4 °C:ssa kevyesti kiertäen. Magneettisiin helmiin sitoutuneet immunokompleksit kerättiin magneettijalustalla, pestiin laajasti, ja proteiini/DNA-sillat käännettiin ja DNA eluoitiin reaaliaikaista PCR-analyysiä varten. (Ristola ym. 2009)

EHEC-DNA-valmistelu sirumatriisianalyysiä varten

Solulysaattien ja uutettujen DNA:iden järjestely
PBS:ssä haluttuun loppupitoisuuteen suspendoituneet bakteeripelletit käsiteltiin ultraäänihäiriö UP100H (Hielscher GmbH, Saksa) varustettu mikrokärjellä MS1 (halkaisija 1 mm). Toimintataajuus oli 30 kHz ja tehollinen lähtöteho 100 W. Toimenpiteen aikana näytteet jäähdytettiin jäävesihauteessa, sekoitettiin ja sentrifugoitiin. Näytteitä hyödynnettiin virtaussytometriatutkimuksissa, ja myöhempää käsittelyä varten näytteille tehtiin lämpökäsittely (95 °C, 5 min). Raakasolulysaatit käsiteltiin fenoli:kloroformi:isoamyylialkoholin seoksella (25:24:1). Lysaattinäytteeseen lisättiin yhtä suuri määrä tätä seosta, liuosta pyörrettiin voimakkaasti 15 sekunnin ajan ja sentrifugoitiin 15 000 x g:ssa 2 minuutin ajan huoneenlämmössä (RT) noin 22 °C:ssa. Genomi-DNA:n sisältävä ylin vesifaasi erotettiin huolellisesti ja kerättiin uuteen steriiliin Eppendorf-putkeen.
Tämän jälkeen näytteet sonikoitiin DNA: n hajottamiseksi. Sonikaatiovaihe toteutettiin samoissa olosuhteissa kuin edellä on kuvattu. Genomi-DNA: n pirstoutumisvaikutusten arvioimiseksi näytteet analysoitiin agaroosigeelielektroforeesilla.
(…) Näytteille, jotka oli sonikoitu aiemmin 2,5 minuutin ajan, tehtiin uuttovaihe lämpökäsittelyn ja sentrifugoinnin jälkeen. Vapautunut DNA uutettiin kaksi kertaa fenoli: kloroformi: isoamyylialkoholiseoksella, ja sen jälkeen altistettiin toiselle sonikaatiolle 0 - 15 minuutin ajan. Agaroosigeelielektroforeesia käytettiin määrittämään DNA: n kokojakauma, joka altistettiin uuttamisen jälkeiselle ultraäänipirstoutumiselle (kuva oikeassa yläkulmassa). Erittäin pirstoutunut DNA ilmeni DNA-tahran läsnäolosta eikä suurimolekyylipainoisista nauhoista, jotka eliminoitiin näytteistä, jotka sonikoituivat 2,5 minuutin ajan tai pidempään. Pidempi sonikaatio pienensi vähitellen fragmenttien pituuksia noin 150 - 600 bp: iin, ja sonikaatio 15 minuutin ajan heikensi edelleen näitä fragmentteja, kuten voidaan nähdä enimmäkseen tahran yläosassa. Siten keskimääräinen DNA-fragmentin koko pieneni vähitellen ultraäänellä ja 5 minuutin hoito mahdollisti siruryhmämäärityksiin sopivimpien DNA-fragmenttien koon. Lopuksi perustettiin DNA-analyytin valmistusmenetelmä, joka sisälsi ensimmäisen 2 minuutin ultraäänikäsittelyn, DNA: n uuttamisen (2×) ja sitä seuraavan 5 minuutin sonikaation. (Basselet ym. 2008)

Kromatiinin immunosaostus (ChIP)

HEK293-soluja viljeltiin edellä kuvatulla tavalla ja kiinnitettiin 2 mM disukkinidityyliglutaraatilla 45 minuutin ajan huoneenlämmössä. Tämän jälkeen solut pestiin kahdesti PBS: llä. Kromatiinia silloitettiin 10 minuutin ajan huoneenlämmössä käyttäen 1% (v/v) formaldehydiä ja pestiin kahdesti jääkylmällä PBS:llä. Silloitusreaktio pysäytettiin inkuboimalla glysiinin kanssa lopullisessa pitoisuudessa 0,125 M 5 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Trypsiinillä inkuboinnin jälkeen solut kaavittiin soluviljelymaljasta ja pestiin kahdesti PBS:llä. Solupelletti suspendoitiin uudelleen lyysipuskuriin (5 mM putket, pH 8,0, 85 mM KCl ja 0,5% (v/v) Nonidet P-40), inkuboidaan jäällä 10 minuutin ajan ja homogenoidaan Dounce-homogenisaattorilla. Tämän jälkeen ytimet pelletoitiin sentrifugoimalla (3500 x g, 5 min, 4 °C) ja suspendoitiin uudelleen ydinpuskuriin (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA ja 1 % (w/v) SDS). Sonikaatio häiritsi ytimiä kolmella 20 sekunnin pulssilla UP50H-sonikaattori (Hielscher Ultraschall Technologie) syklin 0,5 ja amplitudin 30%: n asetuksella, jolloin saadaan genomi-DNA-fragmentteja, joiden irtokoko on 200 - 1000 bp. ChIP: n osalta 50 g DNA: ta laimennettiin 4-kertaisesti immunosaostuspuskurissa (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 ja 0,01% (w/v) SDS). (Weiske ym. 2006)

Histonimodifikaatioanalyysi kromatiinin immunosaostuksella (ChIP)

Lyhyesti, 6 x 10⁶ solut pestiin kahdesti PBS:llä ja silloitettiin viljelylevyllä 15 minuutin ajan huoneenlämmössä 0,5-prosenttisen formaldehydin läsnä ollessa. Silloitusreaktio pysäytettiin lisäämällä 0,125 M glysiiniä. Kaikki seuraavat vaiheet suoritettiin 48 °C:ssa. Kaikki puskurit olivat esijäähdytettyjä ja sisälsivät proteaasi-inhibiittoreita (Complete Mini, Roche). Solut pestiin kahdesti PBS: llä ja kaavittiin sitten. Kerätyt pelletit liuotettiin 1 ml: n lyysipuskuriin (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) ja sonikoidaan kylmässä etanolihauteessa 10 syklin ajan 100%: n amplitudilla käyttäen a UP50H-sonikaattori (Hielscher, Teltow, Saksa). Kromatiinin pirstoutuminen visualisoitiin 1% agaroosigeelissä. Saadut fragmentit olivat alueella 200–500pb. Liukoinen kromatiini saatiin sentrifugoimalla sonikoidut näytteet 14 000 g: ssa 10 minuutin ajan 48 ° C: ssa. Liukoinen fraktio laimennettiin suhteessa 1/10 laimennuspuskuriin (1 % Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), minkä jälkeen se laimennettiin ja varastoitiin 80 °C:seen käyttöön asti. (Rodriguez ym. 2008)