DNA:n pilkkominen ultraäänellä

DNA:n ja RNA:n pilkkomisessa pitkät DNA-molekyylit pilkotaan pienemmiksi fragmenteiksi. Tämä on keskeinen vaihe valmisteltaessa näytteitä uuden sukupolven sekvensoinnin (NGS) kirjastojen rakentamista varten. DNA:n pilkkomisessa ultraäänellä käytetään akustisen kavitaation voimia DNA:n tai RNA:n hajottamiseen fragmenteiksi, joiden koko on 100 bp – 5 kb. Menetelmä mahdollistaa fragmenttikoon tarkan hallinnan, jolloin DNA:n pituus voidaan sovittaa halutuksi optimaalisten sekvensointitulosten saavuttamiseksi.

DNA:n pilkkominen ultraäänikäsittelyllä

Hielscher Ultrasonics tarjoaa erilaisia ultraääneen perustuvia ratkaisuja DNA:n, RNA:n ja kromatiinin pilkkomiseen. Valitse anturityyppinen ultraäänilaite (esim. UP100H) suoraan ultraäänikäsittelyyn mikrokärjellä tai käytä VialTweeeter-laitetta tai CupHorn-kuppitorvea useiden näytteiden samanaikaiseen epäsuoraan DNA:n valmisteluun. Hielscher tarjoaa tarpeisiisi sopivan ihanteellisen laitteen: olipa sinulla 1 tai jopa 10 näytettä ja näytetilavuuksia mikrolitroista litroihin, Hielscherin ultraäänilaitteet täyttävät vaatimuksesi oikeanpituisten DNA-, RNA- ja kromatiinifragmenttien valmistamiseksi. Toistettavuus, helppokäyttöisyys ja tarkka hallinta mahdollistavat luotettavan kirjaston uuden sukupolven sekvensointiin.
Toisin kuin DNA:n entsymaattisessa fragmentoinnissa, ultraäänellä pilkkomisessa käytetään puhtaasti mekaanisia leikkausvoimia lisäämättä mitään kemikaaleja. Prosessiparametrien tarkalla säädöllä ultraäänellä pilkkominen tuottaa suuren molekyylipainon DNA-fragmentteja (plasmidi- ja genomista DNA:ta).
Puhdistettuja nukleiinihappoja voidaan monistaa ennen fragmentointivaihetta tai sen jälkeen.
Ultraäänikäsittelyn parametreja (teho, pulssijakso / pulssisarjat, aika ja lämpötila) voidaan hallita turvallisesti ohjelmistoasetuksilla.

DNA:n ultraäänipilkkomisen protokollat

Kromatiinin immunosaostusmääritykseen

Lyhyesti kuvattuna solut maljattiin halkaisijaltaan 60 mm:n maljoille (400 000 solua maljaa kohti) ja transfektoitiin RhoA-siRNA:lla (kuvatulla tavalla); 72 h:n kuluttua niitä inkuboitiin formaldehydin kanssa (lopullinen pitoisuus 1 %) 10 min ajan 37°C:ssa proteiinien ristisilloittamiseksi DNA:han. Ristisilloitusreaktio pysäytettiin lisäämällä kymmenesosa tilavuudesta 1,25 mol/L glysiiniä, jolloin lopulliseksi pitoisuudeksi saatiin 125 mmol/L. Solut pestiin kahdesti jääkylmällä PBS:llä, suspendoitiin uudelleen radioimmunosaostusmäärityksen puskuriin [150 mmol/L NaCl, 1 % NP40, 0,5 % deoksikolaattia, 0,1 % SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)], joka sisälsi 1 mmol/L fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 1 Ag/mL aprotiniinia ja 1 Ag/mL pepstatiini A:ta, ja pidettiin jäällä 30 min ajan. Tämän jälkeen solulysaatteja käsiteltiin ultraäänellä jäällä käyttäen Hielscher UP200S -ultraäänilaitetta (3 x 40 s, amplitudi 40 %, jakso 1; Hielscher Ultrasonics GmbH), kunnes ristisilloitettu kromatiini oli pilkkoutunut 200–1 000 bp:n DNA-fragmenteiksi. Kymmenesosa koko lysaatista käytettiin eri näytteissä olevan DNA:n määrän määrittämiseen, ja sitä pidettiin ”syötetyn DNA:n kokonaismääränä”. Supernatantteja inkuboitiin lohen siittiöiden DNA:ta / proteiiniagaroosia sisältävän 50 %:n suspension kanssa epäspesifisen taustan vähentämiseksi. Immunosaostus tehtiin tämän jälkeen yön yli 4°C:ssa käyttäen 5 Ag anti-NF-nB p65:tä (Upstate) tai ilman vasta-ainetta (negatiivinen kontrolli). Näihin supernatantteihin lisättiin 5 mol/L NaCl:ää, ja niitä kuumennettiin yön yli 65°C:ssa proteiini-DNA-ristisidosten purkamiseksi. Immunokomplekseja käsiteltiin edelleen DNaasi- ja RNaasivapaalla proteinaasi K:lla, ja DNA puhdistettiin fenoli/kloroformiuutolla ja etanolisaostuksella. PCR tehtiin spesifisillä alukkeilla, jotka vastasivat ihmisen iNOS-geenin promoottorialueella olevaa sekvenssiä (p1-aluke: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2-aluke: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

EGFP:n ilmentymistutkimukset

Ilmentymistutkimuksia varten rekombinanttikantaa L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Saksa), jonka kromosomin ssu-alueelle oli integroitu EGFP:n (tehostettu vihreä fluoresoiva proteiini) geeni, viljeltiin eri kasvatusalustoissa aiemmin kuvatulla tavalla, ja alustoihin lisättiin lisäksi 100 mg l^-1 Nourseothricin-antibioottia (Jena Bioscience, Saksa). Viljelyn aikana otettiin 1 ml:n näytteitä, jotka sentrifugoitiin (2 000 × g, 20°C, 10 min) ja pestiin 0,9 %:n NaCl-liuoksella. Pelletti suspendoitiin uudelleen puskuriin (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) ja hajotettiin ultraäänikäsittelyllä käyttäen ultraääniprosessoria UP400S (käytetty energia ∼ 400 Ws). Solujätteet poistettiin sentrifugoimalla (6 000 × g, 4°C, 5 min) ja analysoitiin natriumdodekyylisulfaatti–polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE) pelkistävissä olosuhteissa Laemmlin (1970) menetelmän mukaisesti käyttäen 12,5 %:n polyakryyliamidigeelejä. EGFP:n ilmentymistä tutkittiin sekoitetussa viljelmässä. (Fritsche et al. 2007)

Kromatiinin immunosaostus

Kromatiinin immunosaostusmääritys tehtiin käyttäen ChIP-IT^TM Express -järjestelmää (Active Motif, Carlsbad, CA, Yhdysvallat) valmistajan ohjeiden mukaisesti muutamin muutoksin. Lyhyesti kuvattuna erilaistuneet ihmisen podosyytit ristisilloitettiin 1 %:n formaldehydillä 10 min ajan huoneenlämmössä. Solut pestiin jääkylmällä PBS:llä, ja fiksaatioreaktio pysäytettiin lisäämällä 0,125 M glysiiniä 5 min ajaksi huoneenlämmössä. Solut pestiin uudelleen jääkylmällä PBS:llä ja kaavittiin maljalta. Solut kerättiin pelletiksi sentrifugoimalla ja suspendoitiin uudelleen lyysipuskuriin. Sentrifugoinnin jälkeen tumapelletti suspendoitiin uudelleen pilkkomispuskuriin, inkuboitiin jäällä 30 min ajan, ja kromatiini pilkottiin ultraäänikäsittelyllä käyttäen esimerkiksi UP100H -laitetta (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Saksa) 25 %:n teholla jäällä 5 pulssilla, kukin 20 s noin 200–600 bp:n fragmenteiksi. Pilkottu kromatiini sentrifugoitiin tämän jälkeen, ja supernatantti kerättiin. Immunosaostuksia varten 60 μl kromatiinia inkuboitiin yön yli 4°C:ssa varovasti pyörittäen joko 1 μg:n kanssa Sp1-vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, Yhdysvallat), NF-κB p65 -vasta-ainetta (Abcam, Cambridge, Yhdistynyt kuningaskunta) tai NF-κB p50 -vasta-ainetta (Abcam) tai kanin IgG:n kanssa (Zymed Laboratories) negatiivisena kontrollina. Magneettihelmiin sitoutuneet immunokompleksit kerättiin magneettitelineellä ja pestiin perusteellisesti, minkä jälkeen proteiini/DNA-ristisidokset purettiin ja DNA eluoitiin reaaliaikaista PCR-analyysiä varten. (Ristola et al. 2009)

EHEC-DNA:n valmistelu mikrosiruanalyysiä varten

Solulysaattien ja uutetun DNA:n valmistelu
PBS:ään haluttuun lopulliseen pitoisuuteen suspendoidut bakteeripelletit käsiteltiin käyttäen UP100H-ultraäänihajotinta (Hielscher GmbH, Saksa), joka oli varustettu MS1-mikrokärjellä (halkaisija 1 mm). Toimintataajuus oli 30 kHz ja efektiivinen lähtöteho 100 W. Käsittelyn aikana näytteitä jäähdytettiin jäävesihauteessa, sekoitettiin ja sentrifugoitiin. Näytteitä käytettiin virtaussytometriatutkimuksiin, ja myöhempää käsittelyä varten näytteille tehtiin lämpökäsittely (95°C, 5 min). Raa’at solulysaatit käsiteltiin fenoli:kloroformi:isoamyylialkoholi-seoksella (25:24:1). Lysaattinäytteeseen lisättiin yhtä suuri tilavuus tätä seosta, liuosta sekoitettiin voimakkaasti vorteksilla 15 s ajan ja sentrifugoitiin 15 000 x g:llä 2 min ajan huoneenlämmössä (RT), noin 22°C:ssa. Genomista DNA:ta sisältävä ylempi vesifaasi erotettiin huolellisesti ja kerättiin uuteen steriiliin Eppendorf-putkeen.
Tämän jälkeen näytteet sonikoitiin DNA: n hajottamiseksi. Sonikaatiovaihe toteutettiin samoissa olosuhteissa kuin edellä on kuvattu. Genomi-DNA: n pirstoutumisvaikutusten arvioimiseksi näytteet analysoitiin agaroosigeelielektroforeesilla.
(…) Aiemmin 2,5 min ajan sonikoiduille näytteille tehtiin lämpökäsittelyn ja sentrifugoinnin jälkeen uuttovaihe. Vapautunut DNA uutettiin kahdesti fenoli:kloroformi:isoamyylialkoholi-seoksella, minkä jälkeen se sonikoitiin toisen kerran 0 – 15 min ajan. Agaroosigeelielektroforeesilla määritettiin uuton jälkeen ultraäänellä pilkotun DNA:n kokojakauma (kuva oikealla ylhäällä). Voimakkaasti pilkkoutunut DNA näkyi DNA-vanana suurimolekyylisten juovien sijaan; nämä juovat hävisivät näytteistä, joita oli sonikoitu 2,5 min tai pidempään. Pidempi sonikointi lyhensi fragmentteja vähitellen noin 150 – 600 bp:n pituisiksi, ja 15 min sonikointi pilkkoi näitä fragmentteja edelleen, mikä näkyy lähinnä vanan yläosassa. Näin ollen DNA-fragmenttien keskimääräinen koko pieneni vähitellen ultraäänikäsittelyn keston myötä, ja 5 min käsittelyllä saatiin mikrosiruanalyyseihin parhaiten soveltuvat DNA-fragmenttikoot. Lopuksi kehitettiin DNA-analyytin valmistusmenettely, joka käsitti ensin 2 min ultraäänikäsittelyn, DNA:n uuton (2×) ja sitä seuraavan 5 min sonikoinnin. (Basselet et al. 2008)

Kromatiinin immunosaostus (ChIP)

HEK293-soluja viljeltiin edellä kuvatulla tavalla ja fiksoitiin 2 mM disukkinimidyyliglutaraatilla 45 min ajan huoneenlämmössä. Tämän jälkeen solut pestiin kahdesti PBS:llä. Kromatiini ristisilloitettiin 10 min ajan huoneenlämmössä käyttäen 1 % (v/v) formaldehydiä ja pestiin kahdesti jääkylmällä PBS:llä. Ristisilloitusreaktio pysäytettiin inkuboimalla glysiinin kanssa, jonka lopullinen pitoisuus oli 0,125 M, 5 min ajan huoneenlämmössä. Trypsiini-inkuboinnin jälkeen solut kaavittiin soluviljelymaljalta ja pestiin kahdesti PBS:llä. Solupelletti suspendoitiin uudelleen lyysipuskuriin (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl ja 0,5 % (v/v) Nonidet P-40), inkuboitiin jäällä 10 min ajan ja homogenisoitiin Dounce-homogenisaattorilla. Tämän jälkeen tumat kerättiin pelletiksi sentrifugoimalla (3 500 x g, 5 min, 4 °C) ja suspendoitiin uudelleen tumapuskuriin (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA ja 1 % (w/v) SDS). Tumat hajotettiin ultraäänikäsittelyllä kolmella 20 s:n pulssilla käyttäen UP50H-ultraäänilaitetta (Hielscher Ultraschall Technologie) jaksoasetuksella 0,5 ja 30 %:n amplitudilla, jolloin saatiin genomisen DNA:n fragmentteja, joiden pääasiallinen koko oli 200–1 000 bp. ChIP-määritystä varten 50g DNA:ta laimennettiin 4-kertaisesti immunosaostuspuskuriin (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1 % (v/v) Triton X-100 ja 0,01 % (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Histonimuokkausten analyysi kromatiinin immunosaostuksella (ChIP)

Lyhyesti kuvattuna 6 x 10⁶ solua pestiin kahdesti PBS:llä ja ristisilloitettiin viljelylevyllä 15 min ajan huoneenlämmössä 0,5 %:n formaldehydin läsnä ollessa. Ristisilloitusreaktio pysäytettiin lisäämällä 0,125 M glysiiniä. Kaikki seuraavat vaiheet tehtiin 48°C:ssa. Kaikki puskurit oli esijäähdytetty, ja ne sisälsivät proteaasi-inhibiittoreita (Complete Mini, Roche). Solut pestiin kahdesti PBS:llä ja kaavittiin tämän jälkeen. Kerätyt pelletit liuotettiin 1 ml:aan lyysipuskuria (1 % SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) ja käsiteltiin ultraäänellä kylmässä etanolihauteessa 10 jakson ajan 100 %:n amplitudilla käyttäen UP50H-ultraäänilaitetta (Hielscher, Teltow, Saksa). Kromatiinin fragmentoituminen visualisoitiin 1 %:n agaroosigeelissä. Saatujen fragmenttien koko oli 200–500pb. Liukoinen kromatiini saatiin sentrifugoimalla ultraäänikäsiteltyjä näytteitä 14 000g:ssä 10 min ajan 48°C:ssa. Liukoinen fraktio laimennettiin suhteessa 1/10 laimennuspuskuriin (1 % Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), jaettiin sitten osanäytteiksi ja säilytettiin 80°C:ssa käyttöön asti. (Rodriguez et al. 2008)