Plasmidivalmiste ultraäänellä

Ultrasonication on luotettava tekniikka plasmidi-DNA: n pirstomiseksi. Tarkasti säädettävä amplitudi, pulsaatiotila ja lämpötilan säätö ovat ultraäänilaitteen tärkeimmät ominaisuudet vahingoittamattomalle plasmidipirstoutumiselle. Lisäksi tiettyjen aineiden käyttö auttaa suojaamaan plasmidin hajoamiselta. Hielscher Ultrasonics tarjoaa erilaisia ratkaisuja kontrolloituun plasmidipirstoutumiseen yksittäisistä injektiopulloista, samanaikaisesti lukuisten näytteiden sonikaatiosta sekä monikuoppalevyistä. Lue lisää onnistuneesta ultraääniplasmidipirstoutumisesta!

Plasmidileikkaus ultraäänellä

Kun DNA-näytteet altistetaan ultraääniaalloille, ultraäänellä tuotetut värähtelyt luovat akustisen kavitaation nesteessä, joka leikkaa tai rikkoo suurimolekyylipainoisia DNA-molekyylejä mekaanisten voimien kautta. Sonikaatio on yleisimmin käytetty menetelmä irtotavarana DNA-leikkauskokeissa, mukaan lukien sovellukset, kuten Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), joille pienet fragmenttikoot ovat ehdottoman tärkeitä korkean resoluution saavuttamiseksi. (vrt. Tseng et al., 2012)
Plasmidi-DNA (pDNA) on spesifinen DNA-muoto, jolle on tunnusomaista sen rengasmuoto ja jota esiintyy bakteereissa ja joissakin eukaryooteissa.
Superkäämitetty pDNA on haluttu plasmidi-DNA: n muoto, koska se osoittaa parhaat tulokset loppupään prosesseissa, kuten automaattisessa sekvensoinnissa ja transfektiossa. Ultrasonication soveltuu pDNA: n, mukaan lukien supercoiled pDNA, hajottamiseen onnistuneesti.
(2008) osoitti, että plasmidisonikaatio, jonka tiedetään pirstovan superkelattua DNA: ta, on tehokas tapa parantaa sekvenssiphred20-lukupituuksia siihen pisteeseen, että ne eivät eroa merkittävästi Beckman Coulterin kontrollimallista tai entsymaattisesti linearisoiduista plasmideista.

Plasmidivektoreiden käyttö

Plasmideja käytetään usein työkaluina geenien kloonaamiseen, siirtämiseen ja manipulointiin. Kun plasmideja käytetään kokeellisesti näihin tarkoituksiin, niitä kutsutaan vektoreiksi. DNA-fragmentteja tai geenejä voidaan lisätä plasmidivektoriin, jolloin muodostuu niin kutsuttu rekombinanttiplasmidi. Plasmidivektoreita käytetään ajoneuvoina rekombinantti-DNA: n ajamiseksi isäntäsoluun ja ne ovat keskeinen osa molekyylikloonausta.
“Ei-virusvektoreita tutkitaan laajasti niiden mahdollisesta käytöstä geeniterapiassa erilaisten monimutkaisten sairauksien hoidossa. Ei-virusvektorit suojaavat plasmidi-DNA: ta fysikaaliselta, kemialliselta ja entsymaattiselta hajoamiselta ja toimittavat DNA-molekyylin kohdekohtaan. Esimerkiksi kationiset liposomit, kitosaani ja muut positiivisesti varautuneet nanohiukkaset muodostavat komplekseja plasmidi-DNA: n kanssa sähköstaattisten vuorovaikutusten kautta. Helposti muodostuvat kationiset liposomit/plasmidi-DNA-kompleksit ovat kuitenkin suhteellisen suuria (ts. 300–400 nm) ja luonteeltaan heterogeenisiä, minkä vuoksi niitä on vaikea käyttää farmaseuttisissa sovelluksissa. Suuret ja heterogeeniset plasmidi-DNA / liposomit, plasmidi-DNA / aerosolit ja plasmidi-DNA/peptidikompleksit voidaan pelkistää pienemmiksi ja homogeenisiksi hiukkasiksi ultraäänellä.” (Sarker et ai., 2019)
Merkittävä esimerkki plasmidivektoreiden käytöstä on CRISPR–Cas9. CRISPR–Cas9-järjestelmä toimitetaan tyypillisesti soluihin yhtenä suurena plasmidina tai useina pienempinä plasmideina, jotka koodaavat kohdesekvenssiä, CRISPR-ohjainta ja Cas9:ää.

DNA-ladattujen PLGA-nanohiukkasten ultraäänivalmistus nanosaostumalla

(2020) käyttivät poly(maitohappo-koglykolihappoa) (PLGA) muodostaakseen nanohiukkasen kantajan CRISPR-Cas9-plasmidin mallin toimittamiseksi primaarisiin luuytimestä peräisin oleviin makrofageihin. PLGA-nanohiukkasten nanosaostukseen käytettiin PLGA: ta, jossa oli kaksi eri pääteryhmää (esteri- ja amiiniryhmät), tavoitteena oli, että positiivisesti varautuneet amiinin päätykappaleet lisäävät kapselointitehokkuutta ja kuormitusta sen ja DNA: n negatiivisesti varautuneen selkärangan välisten varausvuorovaikutusten vuoksi. 50 ml: n polypropeenikartiomaisessa sentrifugiputkessa 100 mg Pluronic F127 liuotettiin 20 ml: aan autoklaavissa olevaa DI-vettä pyörresekoittamalla, jota seurasi 30 minuutin lempeä sonikaatio ultraäänihauteella (katso CupHorn). Autoklaavissa oleva magneettinen sekoitustanko lisättiin ja liuosta sekoitettiin 600 kierrosta minuutissa 30 minuutin ajan, kun muut liuokset valmistettiin. Muovisia labwareja käytettiin lasiesineiden sijasta kauttaaltaan DNA: n epäspesifisen adsorption minimoimiseksi. DMF:ään liuotetut PLGA-liuokset (44,48 mg/ml) ja THF:ään liuotetut TIPS-pentacene (0,667 mg/ml) valmistettiin erikseen. PLGA jätettiin hiljaa kastumaan DMF:ään 30 minuutiksi ennen kuin se sonikoidaan 30 minuutiksi (katso koko protokolla Jo et ai., 2020)

Plasmidi-DNA-suojaus sonikoinnin aikana

DNA, mukaan lukien plasmidit ja superkäämitetyt plasmidit, hajoaa erittäin herkästi. Kaikki käytettävissä olevat pirstoutumismenetelmät tunnetaan tietyistä haitoista. Ultraääni-DNA-pirstoutuminen on yksi edullisimmista menetelmistä, koska hallittu sonikaatio yhdessä suojatoimenpiteiden kanssa mahdollistaa DNA-säikeiden leikkaus- ja lämpövaurioiden vähentämisen.
Matalan amplitudin asetusten, pulsaatiotilan ja lämpötilan säätämisen lisäksi ultraääni-DNA-leikkauksen aikana tiettyjen aineiden käyttö osoitti merkittävää suojaavaa vaikutusta DNA: n hajoamista vastaan. Esimerkiksi erilaiset polymeerit, peptidit ja lipidit suojaavat plasmidi-DNA: ta ultrasonicationin aikana.

Plasmidi-DNA:n ja plasmidi-DNA/IL-nanokompleksien stabiilisuutta ultraäänileikkausjännitystä vastaan tutkittiin agaroosigeelielektroforeesimäärityksellä. Sekä plasmidi-DNA että plasmidi-DNA/IL-nanokompleksit altistettiin ultraäänileikkausstressille eri ajankohtina. Plasmidi-DNA altistettiin ultraäänileikkausstressille 0, 10, 20, 30 ja 40 minuutin ajan. Plasmidi-DNA/IL-nanokompleksit altistettiin kuitenkin ultraäänileikkausstressille 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ja 120 minuutin ajan.
(tutkimus ja kuva: ©Sarker et al., 2019)

(2019) osoitti, että kun plasmidi-DNA / ioninen neste (pDNA / IL) nanorakenteet altistettiin ultraäänileikkausjännitykselle 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ja 120 minuutin ajan ja kompleksoitiin kaupallisesti saatavilla olevan kationisen geeninsiirtoaineen lipofektamiinin kanssa, fluoresoivien positiivisten solujen prosenttiosuus oli 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65 % ja 50 % (ks. jäljempänä oleva kaavio). Positiivisten fluoresoivien solujen prosenttiosuus kasvoi, kun nanorakenteisiin kohdistettiin ultraäänileikkausjännitystä 10 ja 20 minuutin ajan, ja laski sen jälkeen hitaasti.

Ionisen nesteen [Bmim][PF6] vaikutus plasmidi-DNA:n kulkeutumiseen COS7-soluihin. Plasmidi-DNA/IL (ioninen neste) nanokomplekseja altistettiin ultraäänileikkausjännitykselle jopa 120 minuutin ajan ja kompleksoitiin LA:lla ennen toimittamista COS7-soluihin. Aineisto osoittaa GFP-positiivisten HeLa-solujen keskimääräisen määrän (%) laskettuna 10 eri mikroskooppikentässä ja koe suoritettiin useita kertoja kolmena eri päivänä. (Tutkimus ja kaavio: ©Sarker et al., 2019)

Ultraäänilysaatin valmistus

Ultraäänisolujen lyysiprotokolla
Aloita rikastetulla solunäytteellä, joka on valmistettu soluerotusmenetelmällä (esim. immunomagneettinen solujen erotus, fluoresenssiaktivoitu solujen lajittelu (FACS), tiheysgradienttisentrifugointi, immunotiheyssolueristys).
Solunäytteissä on oltava lyysipuskurin tilavuus, joka sopii kokeelliseen tavoitteeseen ja koetintyyppiseen ultraäänilaitteeseen.
Hypotoniset puskurit ovat edullisia, koska ne parantavat ultraäänisolujen lyysiä. On tärkeää, että lisäaineita ja suolapitoisuutta käytetään asianmukaisesti.
Valitse ultraäänilyysilaite: Injektiopullojen epäsuoraan sonikaatioon suositellaan VialTweeteriä tai CupHornia. Multiwell-levyille UIP400MTP on ihanteellinen ultraäänilaite. Ja klassinen koetintyyppinen sonikaatio, ultraäänihomogenisaattori UP100H: na tai UP200Ht: nä mikrokärjellä ovat sopivimpia.
Protokolla koetintyyppiselle sonikaatiolle: Aseta ultraäänilaitteen anturi näytteen tilavuuteen mikrosentrifugiputkessa ja sonikoidaan noin 10 sekunnin ajan. DNA-näytteestä riippuen sonikaatio voidaan toistaa vielä yksi tai kaksi kertaa. Tarvittava ultraäänienergian syöttö (Ws / ml) riippuu näytteen viskositeetista ja DNA-tyypistä. Jäähdytys ultraäänilaitteen jäähauteen ja pulsaatiotilan kautta auttaa estämään näytteen lämpöhajoamisen.
Ultraäänilyysin jälkeen näyte sentrifugoidaan pellettijätteiden erottamiseksi (sisältää lysoimattomia soluja, ytimiä ja hajoamattomia organelleja)
Jos näytettä ei käsitellä välittömästi edelleen, se voidaan säilyttää sopivassa lämpötilassa sen elinkelpoisuuden säilyttämiseksi.

Ultrasonicators DNA: n pirstoutumiseen

Hielscher Ultrasonics tarjoaa erilaisia ultraäänipohjaisia alustoja DNA: lle, RNA, ja kromatiinin pirstoutuminen. Näitä eri alustoja ovat ultraäänianturit (sonotrodit), epäsuorat sonikaatioratkaisut useiden putkien tai monikuoppalevyjen (esim. 96-kuoppalevyt, mikrotitterilevyt), sonoreaktorien ja ultraäänikuppien samanaikaiseen näytteenvalmistukseen. Kaikki DNA-leikkausalustat saavat virtansa taajuusviritetyistä, korkean suorituskyvyn ultraääniprosessoreista, jotka ovat tarkasti hallittavissa ja tuottavat toistettavia tuloksia.

Ultraääniprosessorit mihin tahansa näytenumeroon ja kokoon

Hielscherin moninäytteisillä ultraäänilaitteilla VialTweeter (jopa 10 koeputkelle) ja UIP400MTP (mikrolevyille / multiwell-levyille) on helppo lyhentää näytteen käsittelyaikaa intensiivisen ja tarkasti hallittavan ultrasonication ansiosta samalla kun saadaan haluttu DNA-fragmentin kokojakauma ja saanto. Ultraääni-DNA-pirstoutuminen tekee plasmidin valmistusvaiheista tehokkaita, luotettavia ja skaalautuvia. Protokollat voidaan skaalata lineaarisesti yhdestä lukuisiin näytteisiin soveltamalla vakioita ultraääniparametreja.
Koettimen ultraäänilaitteet, joissa on yhdestä viiteen sormea, ovat ihanteellisia pienempien näytemäärien valmistukseen. Hielscherin laboratorioultraäänilaitteita on saatavana eri tehotasoilla, jotta voit valita ihanteellisen ultraäänihäiritsijän DNA-sovellukseesi.