Plasmidien valmistelu ultraäänikäsittelyllä

Ultraäänikäsittely on luotettava menetelmä plasmidi-DNA:n fragmentointiin. Tarkasti säädettävä amplitudi, pulssitila ja lämpötilan hallinta ovat ultraäänilaitteen tärkeimmät ominaisuudet plasmidien vaurioitumattoman fragmentoinnin kannalta. Lisäksi tiettyjen aineiden käyttö auttaa suojaamaan plasmideja hajoamiselta. Hielscher Ultrasonics tarjoaa erilaisia ratkaisuja plasmidien hallittuun fragmentointiin yksittäisissä näytepulloissa sekä lukuisten näytteiden ja monikuoppalevyjen samanaikaiseen ultraäänikäsittelyyn. Lue lisää onnistuneesta plasmidien fragmentoinnista ultraäänellä!

Plasmidien pilkkominen ultraäänikäsittelyllä

Kun DNA-näytteet altistetaan ultraääniaalloille, ultraäänen synnyttämät värähtelyt aiheuttavat nesteessä akustista kavitaatiota, joka pilkkoo tai katkaisee suuren molekyylipainon DNA-molekyylejä mekaanisten voimien avulla. Ultraäänikäsittely on laajimmin käytetty menetelmä suurten DNA-määrien pilkkomiskokeissa, muun muassa kromatiinin immunosaostuksessa (ChIP), jossa pienet fragmenttikoot ovat ehdottoman tärkeitä suuren erotuskyvyn saavuttamiseksi. (vrt. Tseng et al., 2012)
Plasmidi-DNA (pDNA) on erityinen DNA:n muoto, jolle on ominaista rengasmainen rakenne ja jota esiintyy bakteereissa ja joissakin aitotumallisissa eliöissä.
Superkiertynyt pDNA on plasmidi-DNA:n toivottu muoto, sillä se tuottaa parhaat tulokset jatkoprosesseissa, kuten automatisoidussa sekvensoinnissa ja transfektiossa. Ultraäänikäsittely soveltuu pDNA:n, myös superkiertyneen pDNA:n, onnistuneeseen fragmentointiin.
Thompson et al. (2008) osoittivat, että plasmidien ultraäänikäsittely, jonka tiedetään fragmentoivan superkiertynyttä DNA:ta, on tehokas tapa kasvattaa sekvenssien phred20-lukupituuksia niin, etteivät ne enää eroa merkitsevästi Beckman Coulterin kontrollitemplaatilla tai entsymaattisesti linearisoiduilla plasmideilla saavutetuista lukupituuksista.

Plasmidivektorien käyttö

Plasmideja käytetään usein välineinä geenien kloonaukseen, siirtoon ja muokkaukseen. Kun plasmideja käytetään kokeellisesti näihin tarkoituksiin, niitä kutsutaan vektoreiksi. DNA-fragmentteja tai geenejä voidaan liittää plasmidivektoriin, jolloin syntyy niin kutsuttu rekombinanttiplasmidi. Plasmidivektoreita käytetään rekombinantti-DNA:n kuljettamiseen isäntäsoluun, ja ne ovat molekyylikloonauksen keskeinen osa.
”Ei-virusperäisiä vektoreita tutkitaan laajasti niiden mahdollisen geeniterapiakäytön vuoksi erilaisten monimutkaisten sairauksien hoidossa. Ei-virusperäiset vektorit suojaavat plasmidi-DNA:ta fysikaaliselta, kemialliselta ja entsymaattiselta hajoamiselta ja kuljettavat DNA-molekyylin kohteeseen. Esimerkiksi kationiset liposomit, kitosaani ja muut positiivisesti varautuneet nanohiukkaset muodostavat plasmidi-DNA:n kanssa komplekseja sähköstaattisten vuorovaikutusten kautta. Helposti muodostuvat kationisten liposomien ja plasmidi-DNA:n kompleksit ovat kuitenkin suhteellisen suuria (eli 300–400 nm) ja luonteeltaan heterogeenisiä, mikä vaikeuttaa niiden käyttöä farmaseuttisissa sovelluksissa. Suuret ja heterogeeniset plasmidi-DNA:n ja liposomien, plasmidi-DNA:n ja aerosolien sekä plasmidi-DNA:n ja peptidien kompleksit voidaan pienentää pienemmiksi ja homogeenisiksi hiukkasiksi ultraäänikäsittelyllä.” (Sarker et al., 2019)
Merkittävä esimerkki plasmidivektorien käytöstä on CRISPR–Cas9. CRISPR–Cas9-järjestelmä kuljetetaan soluihin tyypillisesti yhtenä suurena plasmidina tai useina pienempinä plasmideina, jotka koodaavat kohdesekvenssiä, CRISPR-ohjainta ja Cas9:ää.

DNA:ta sisältävien PLGA-nanohiukkasten valmistus nanopresipitaatiolla ja ultraäänikäsittelyllä

Jo et al. (2020) käyttivät poly(maito-ko-glykolihappoa) (PLGA) muodostaakseen nanohiukkaskantajan CRISPR–Cas9-malliplasmidin kuljettamiseen primaarisiin luuytimestä peräisin oleviin makrofageihin. PLGA-nanohiukkasten nanopresipitaatiossa käytettiin PLGA:ta, jossa oli kaksi erilaista pääteryhmää (esteri- ja amiiniryhmät). Tavoitteena oli, että positiivisesti varautuneet amiinipääteryhmät lisäävät kapselointitehokkuutta ja kuormitusta niiden ja DNA:n negatiivisesti varautuneen rungon välisten varausvuorovaikutusten ansiosta. Kartionmuotoisessa 50 mL:n polypropeenisessa sentrifugiputkessa liuotettiin 100 mg Pluronic F127:ää 20 mL:aan autoklavoitua deionisoitua vettä vorteksisekoituksella, minkä jälkeen tehtiin 30 min:n hellävarainen ultraäänikäsittely ultraäänihauteessa (katso CupHorn). Liuokseen lisättiin autoklavoitu magneettisekoitussauva, ja liuosta sekoitettiin nopeudella 600 RPM 30 min:n ajan samalla, kun muut liuokset valmistettiin. Kaikissa vaiheissa käytettiin muovisia laboratoriovälineitä lasisten sijaan DNA:n epäspesifisen adsorption minimoimiseksi. DMF:ään liuotettu PLGA (44,48 mg/ ml) ja THF:ään liuotettu TIPS-pentaseeni (0,667 mg/ml) valmistettiin erillisinä liuoksina. PLGA:n annettiin kostua DMF:ssä liikkumatta 30 min:n ajan ennen 30 min:n ultraäänikäsittelyä. (koko menetelmäohje: katso Jo et al., 2020)

Plasmidi-DNA:n suojaaminen ultraäänikäsittelyn aikana

DNA, mukaan lukien plasmidit ja superkiertyneet plasmidit, on erittäin herkkää hajoamiselle. Kaikilla käytettävissä olevilla fragmentointimenetelmillä tiedetään olevan tiettyjä haittapuolia. DNA:n ultraäänifragmentointi on yksi suosituimmista menetelmistä, sillä hallittu ultraäänikäsittely yhdessä suojaavien toimenpiteiden kanssa mahdollistaa leikkausvoimien ja lämmön aiheuttamien DNA-juosteiden vaurioiden vähentämisen.
Pienen amplitudin, pulssitilan ja lämpötilan hallinnan lisäksi tiettyjen aineiden käyttö osoitti merkittävää suojaavaa vaikutusta DNA:n hajoamista vastaan DNA:n ultraäänipilkkomisen aikana. Esimerkiksi erilaiset polymeerit, peptidit ja lipidit suojaavat plasmidi-DNA:ta ultraäänikäsittelyn aikana.

Plasmidi-DNA:n ja plasmidi-DNA/IL-nanokompleksien kestävyyttä ultraäänen aiheuttamaa leikkausjännitystä vastaan tutkittiin agaroosigeelielektroforeesilla. Sekä plasmidi-DNA että plasmidi-DNA/IL-nanokompleksit altistettiin ultraäänen aiheuttamalle leikkausjännitykselle eri pituisiksi ajoiksi. Plasmidi-DNA altistettiin ultraäänen aiheuttamalle leikkausjännitykselle 0, 10, 20, 30 ja 40 minuutiksi. Plasmidi-DNA/IL-nanokompleksit puolestaan altistettiin ultraäänen aiheuttamalle leikkausjännitykselle 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ja 120 minuutiksi.
(tutkimus ja kuva: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) osoittivat, että kun plasmidi-DNA:n ja ionisen nesteen (pDNA/IL) nanorakenteet altistettiin ultraäänen aiheuttamalle leikkausjännitykselle 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ja 120 min:n ajaksi ja niistä muodostettiin komplekseja kaupallisesti saatavilla olevan kationisen geeninsiirtoaineen lipofektamiinin kanssa, fluoresenssipositiivisten solujen osuudet olivat vastaavasti 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% ja 50% (katso alla oleva kaavio). Fluoresenssipositiivisten solujen osuus kasvoi, kun nanorakenteet altistettiin ultraäänen aiheuttamalle leikkausjännitykselle 10 ja 20 min:n ajaksi, ja pieneni sen jälkeen hitaasti.

Ionisen nesteen [Bmim][PF6] vaikutus plasmidi-DNA:n kuljettamiseen COS7-soluihin. Plasmidi-DNA/IL-nanokompleksit (IL = ioninen neste) altistettiin ultraäänen aiheuttamalle leikkausjännitykselle jopa 120 minuutin ajan, ja niistä muodostettiin komplekseja LA:n kanssa ennen kuljettamista COS7-soluihin. Tiedot osoittavat GFP-positiivisten HeLa-solujen keskimääräisen määrän (%) laskettuna 10 eri mikroskooppikentästä, ja koe suoritettiin useita kertoja kolmena eri päivänä. (Tutkimus ja kaavio: ©Sarker et al., 2019)

Lysaatin valmistus ultraäänellä

Solujen ultraäänilyysin menetelmäohje
Aloita rikastetusta solunäytteestä, joka on valmistettu solunerotusmenetelmällä (esimerkiksi immunomagneettinen solunerotus, fluoresenssiaktivoitu solulajittelu (FACS), tiheysgradienttisentrifugointi tai immunotiheyteen perustuva soluneristys).
Solunäytteiden lyysipuskurin tilavuuden on oltava sopiva kokeen tavoitteeseen ja anturityyppiseen ultraäänilaitteeseen nähden.
Hypotonisia puskureita suositaan, sillä ne tehostavat solujen ultraäänilyysiä. On tärkeää käyttää lisäaineita ja suolapitoisuutta asianmukaisesti.
Valitse ultraäänilyysilaitteesi: näytepullojen epäsuoraan ultraäänikäsittelyyn suositellaan laitetta VialTweeter tai CupHorn. Monikuoppalevyille UIP400MTP on ihanteellinen ultraäänilaite. Perinteiseen anturityyppiseen ultraäänikäsittelyyn soveltuu parhaiten mikrokärjellä varustettu ultraäänihomogenisaattori, kuten UP100H tai UP200Ht.
Anturityyppisen ultraäänikäsittelyn menetelmäohje: Aseta ultraäänilaitteen anturi mikrosentrifugiputkessa olevaan näytteeseen ja käsittele ultraäänellä noin 10 sekuntia. DNA-näytteestä riippuen ultraäänikäsittely voidaan joutua toistamaan vielä kerran tai kahdesti. Tarvittava ultraäänienergian syöttö (Ws/mL) riippuu näytteen viskositeetista ja DNA:n tyypistä. Jäähauteella jäähdyttäminen ja ultraäänilaitteen pulssitila auttavat ehkäisemään näytteen hajoamista lämmön vaikutuksesta.
Ultraäänilyysin jälkeen näyte sentrifugoidaan pellettiin kerääntyvän solujätteen erottamiseksi (sisältää hajottamattomia soluja, tumia ja hajottamattomia soluelimiä).
Jos näytettä ei jatkokäsitellä välittömästi, sitä voidaan säilyttää sopivassa lämpötilassa sen elinkykyisyyden säilyttämiseksi.

Ultraäänilaitteet DNA:n fragmentointiin

Hielscher Ultrasonics tarjoaa erilaisia ultraääneen perustuvia laiteratkaisuja DNA:n, RNA:n ja kromatiinin fragmentointiin. Näihin erilaisiin ratkaisuihin kuuluvat ultraäänianturit (sonotrodit), epäsuoran ultraäänikäsittelyn ratkaisut useiden putkien tai monikuoppalevyjen (esimerkiksi 96-kuoppalevyjen ja mikrotiitterilevyjen) samanaikaiseen näytteenkäsittelyyn, ultraäänireaktorit ja CupHorn-ultraäänilaitteet. Kaikkien DNA:n pilkkomiseen tarkoitettujen laiteratkaisujen voimanlähteinä toimivat taajuusviritetyt, suorituskykyiset ultraääniprosessorit, jotka ovat tarkasti säädettävissä ja tuottavat toistettavia tuloksia.

Ultraääniprosessorit kaikille näytemäärille ja -ko’oille

Hielscherin usean näytteen ultraäänilaitteilla VialTweeter (enintään 10 koeputkelle) ja UIP400MTP (mikrolevyille/monikuoppalevyille) näytteiden käsittelyajan lyhentäminen on helppoa voimakkaan ja tarkasti säädettävän ultraäänikäsittelyn ansiosta, samalla kun saavutetaan haluttu DNA-fragmenttien kokojakauma ja saanto. DNA:n ultraäänifragmentointi tekee plasmidien valmisteluvaiheista tehokkaita, luotettavia ja skaalattavia. Menetelmäohjeet voidaan skaalata lineaarisesti yhdestä näytteestä lukuisiin näytteisiin käyttämällä vakioituja ultraääniparametreja.
Yhdestä viiteen sormella varustetut anturityyppiset ultraäänilaitteet ovat ihanteellisia pienempien näytemäärien käsittelyyn. Hielscherin laboratorio-ultraäänilaitteita on saatavilla eri tehotasoilla, joten voit valita ihanteellisen ultraäänihajottimen DNA:han liittyvään sovellukseesi.