Ultrasonication on luotettava tekniikka plasmidi-DNA: n fragmentoimiseksi. Tarkasti hallittava amplitudi, pulssitila ja lämpötilan säätö ovat ultraäänilaitteen tärkeimpiä ominaisuuksia vahingoittamattomalle plasmidien pirstoutumiselle. Lisäksi tiettyjen aineiden käyttö auttaa suojaamaan plasmidien hajoamiselta. Hielscher Ultrasonics tarjoaa erilaisia ratkaisuja hallittuun plasmidien pirstoutumiseen yksittäisistä injektiopulloista, samanaikaisesti lukuisten näytteiden ja monikuoppalevyjen sonikointiin. Lue lisää onnistuneesta ultraääniplasmidin pirstoutumisesta!

Plasmidileikkaus ultrasonicationin avulla

Kun DNA-näytteet altistetaan ultraääniaalloille, ultraäänellä tuotetut värähtelyt luovat akustisen kavitaation nesteeseen, joka leikkaa tai rikkoo suurimolekyylipainoisia DNA-molekyylejä mekaanisten voimien kautta. Sonikaatio on yleisimmin käytetty menetelmä irtotavarana oleviin DNA-leikkauskokeisiin, mukaan lukien sovellukset, kuten kromatiinin immunosaostus (ChIP), joille pienet fragmenttikoot ovat ehdottoman tärkeitä korkean resoluution saavuttamiseksi. (vrt. Tseng et al., 2012)
Plasmidi-DNA (pDNA) on DNA: n spesifinen muoto, jolle on tunnusomaista sen renkaan muoto ja jota esiintyy bakteereissa ja joissakin eukaryooteissa.
Supercoiled pDNA on haluttu plasmidi-DNA: n muoto, koska se osoittaa parhaat tulokset alavirran prosesseissa, kuten automaattisessa sekvensoinnissa ja transfektiossa. Ultrasonication soveltuu pDNA: n fragmentointiin, mukaan lukien supercoiled pDNA, onnistuneesti.
(2008) osoitti, että plasmidisonikaatio, jonka tiedetään fragmentoivan ylikypsää DNA: ta, on tehokas tapa parantaa sekvenssin phred20-lukupituuksia siihen pisteeseen, että ne eivät eroa merkittävästi Beckman Coulterin kontrollimallista tai entsymaattisesti linearisoiduista plasmideista.

Plasmid-vektorien käyttö

Plasmideja käytetään usein työkaluina geenien kloonaamiseen, siirtämiseen ja manipulointiin. Kun plasmideja käytetään kokeellisesti näihin tarkoituksiin, niitä kutsutaan vektoreiksi. DNA-fragmentit tai geenit voidaan lisätä plasmidivektoriin, jolloin syntyy niin sanottu rekombinanttiplasmidi. Plasmid-vektoreita käytetään ajoneuvoina rekombinantti-DNA: n ohjaamiseksi isäntäsoluun, ja ne ovat keskeinen osa molekyylikloonausta.
“Ei-virusvektoreita tutkitaan laajasti niiden mahdollisen käytön suhteen geeniterapiassa erilaisten monimutkaisten sairauksien hoitoon. Ei-virusvektorit suojaavat plasmidi-DNA:ta fysikaalista, kemiallista ja entsymaattista hajoamista vastaan ja toimittavat DNA-molekyylin kohdekohtaan. Esimerkiksi kationiset liposomit, kitosaani ja muut positiivisesti varautuneet nanohiukkaset muodostavat komplekseja plasmidi-DNA: n kanssa sähköstaattisten vuorovaikutusten kautta. Helposti muodostuneet kationiset liposomit/plasmidi-DNA-kompleksit ovat kuitenkin suhteellisen suuria (eli 300–400 nm) ja luonteeltaan heterogeenisiä, mikä vaikeuttaa niiden käyttöä farmaseuttisissa sovelluksissa. Suuret ja heterogeeniset plasmidi-DNA/liposomit, plasmidi-DNA/aerosolit ja plasmidi-DNA/peptidikompleksit voidaan pelkistää pienemmiksi ja homogeenisiksi hiukkasiksi ultrasonicationin avulla.” (Sarker et al., 2019)
Merkittävä esimerkki plasmidivektoreiden käytöstä on CRISPR–Cas9. CRISPR–Cas9-järjestelmä toimitetaan tyypillisesti soluihin yhtenä suurena plasmidina tai useina pienempinä plasmideina, jotka koodaavat kohdesekvenssiä, CRISPR-opasta ja Cas9:ää.

DNA-ladattujen PLGA-nanohiukkasten ultraäänivalmistus nanosaostuksella

(2020) käytti poly(maitohappo-koglykolihappo) (PLGA) muodostaakseen nanopartikkelikannattimen MALLIN CRISPR–Cas9-plasmidien toimittamiseksi primaarisiin luuytimestä johdettuihin makrofageihin. PLGA-nanohiukkasten nanosaostukseen käytettiin PLGA:ta, jossa oli kaksi eri loppuryhmää (esteri- ja amiiniryhmä), tavoitteena, että positiivisesti varautuneet amiinipään korkit lisäävät kapselointitehokkuutta ja kuormitusta sen ja DNA: n negatiivisesti varautuneen selkärangan välisten varausvuorovaikutusten vuoksi. 50 ml: n polypropeenikartiomaisessa sentrifugiputkessa 100 mg Pluronic F127 liuotettiin 20 ml: n autoklaavoituun DI-veteen pyörresekoittamalla, jota seurasi 30 min lempeää sonikaatiota ultraäänihauteella (katso CupHorn). Autoklaavinen magneettinen sekoitustanko lisättiin ja liuosta sekoitettiin 600 RPM: llä 30 minuutin ajan, kun muut liuokset valmistettiin. Muovisia laboratoriotuotteita käytettiin lasiesineiden sijasta kaikkialla DNA: n epäspesifisen adsorption minimoimiseksi. DMF:ään liuotetut PLGA-liuokset (44,48 mg/ml) ja THF:ään liuotetut TIPS-pentaseeniliuokset (0,667 mg/ml) valmistettiin erikseen. PLGA jätettiin rauhallisesti märäksi DMF: ssä 30 minuutiksi ennen kuin se sonikoitiin 30 minuutiksi (koko protokollaa varten katso Jo et ai., 2020)

Plasmidien DNA-suojaus sonikoinnin aikana

DNA, mukaan lukien plasmidit ja ylikypsät plasmidit, ovat erittäin herkkiä hajoamisia. Kaikki käytettävissä olevat pirstoutumismenetelmät tunnetaan tietyistä haitoista. Ultraääni-DNA: n pirstoutuminen on yksi suosituimmista menetelmistä, koska hallittu sonikaatio yhdessä suojatoimenpiteiden kanssa mahdollistaa DNA-säikeiden leikkaamisen ja lämmön aiheuttaman vaurion vähentämisen.
Matalien amplitudiasetusten, pulsaatiotilan ja lämpötilan hallinnan lisäksi ultraääni-DNA-leikkauksen aikana tiettyjen aineiden käyttö osoitti merkittävää suojaavaa vaikutusta DNA: n hajoamista vastaan. Esimerkiksi erilaiset polymeerit, peptidit ja lipidit suojaavat plasmidi-DNA: ta ultrasonicationin aikana.

Plasmidisen DNA: n ja plasmidi-DNA/IL-nanokompleksien stabiilisuutta ultraäänileikkausstressiä vastaan tutkittiin käyttämällä agaroosigeelielektroforeesimääritystä. Sekä plasmidi-DNA- että plasmid-DNA/IL-nanokompleksit altistettiin ultraäänileikkausstressille eri aikapisteissä. Plasmidi-DNA altistui ultraäänileikkausstressille 0, 10, 20, 30 ja 40 minuutin ajan. Plasmidi-DNA/IL-nanokompleksit altistettiin kuitenkin ultraäänileikkausstressille 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ja 120 minuutin ajan.
(tutkimus ja kuva: ©Sarker et al., 2019)

(2019) osoitti, että kun plasmidi-DNA / ionisen nesteen (pDNA/IL) nanorakenteet altistuivat ultraäänileikkausstressille 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ja 120 min ja kompleksoituivat kaupallisesti saatavilla olevan kationisen geenin toimitusaineen lipofektamiinin kanssa, fluoresoivien positiivisten solujen prosenttiosuus oli 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65 % ja 50 % (ks. alla oleva kaavio). Fluoresoivien positiivisten solujen prosenttiosuus kasvoi, kun nanorakenteet altistettiin ultraäänileikkausrasitukselle 10 ja 20 minuutin ajan, ja sen jälkeen laskivat hitaasti.

Ionisen nesteen [Bmim][PF6] vaikutus plasmidi-DNA: n toimittamiseen COS7-soluihin. Plasmid DNA/IL (ioninen neste) -nanokompleksit altistettiin ultraäänileikkausstressille jopa 120 minuutin ajan ja kompleksoitiin LA: n kanssa ennen kuin ne toimitettiin COS7-soluihin. Tiedot osoittavat GFP-positiivisten HeLa-solujen keskimääräisen määrän (%) laskettuna 10 eri mikroskooppiseen kenttään ja koe suoritettiin useita kertoja kolmena eri päivänä. (Tutkimus ja kaavio: ©Sarker et al., 2019)

Ultraääni lysaattivalmiste

Ultraäänisolun Lyysiprotokolla
Aloita rikastetulla solunäytteellä, joka on valmistettu solujen erotusmenetelmällä (esim. immunomagneettinen solujen erottaminen, fluoresenssiaktivoitu solujen lajittelu (FACS), tiheysgradienttisentrifugointi, immunotiheyssolujen eristäminen).
Solunäytteissä on oltava tilavuus lyysipuskuria, joka sopii kokeelliseen tavoitteeseen ja koetintyyppiseen ultraäänilaitteeseen.
Hypotoniset puskurit ovat edullisia, koska ne parantavat ultraäänisolujen hajoamista. On tärkeää, että lisäaineita ja suolapitoisuutta käytetään asianmukaisella tavalla.
Valitse ultraäänilyysilaite: Injektiopullojen epäsuoraan sonikaatioon suositellaan VialTweeter- tai CupHorn-laitetta. Multiwell-levyille UIP400MTP on ihanteellinen ultraäänilaite. Ja klassinen koetintyyppinen sonikaatio, ultraäänihomogenisaattori, kuten UP100H tai UP200Ht, jossa on mikrokärki, ovat sopivimpia.
Protokolla koetintyyppiseen sonikaatioon: Aseta ultraäänianturi näytetilavuuteen mikrosentrifugiputkessa ja sonikea noin 10 sekunnin ajan. DNA-näytteestä riippuen sonikaatio voidaan toistaa vielä yhden tai kaksi kertaa. Vaadittu ultraäänienergian syöttö (Ws / ml) riippuu näytteen viskositeetista ja DNA-tyypistä. Jäähdytys jääkylvyn ja ultraäänilaitteen pulssitilan kautta auttaa estämään näytteen lämpöhajoamisen.
Ultraäänilyysin jälkeen näyte sentrifugoidaan pellettijätteiden erottamiseksi (sisältää liukenemattomia soluja, ytimiä ja liukenemattomia organelleja)
Jos näytettä ei käsitellä välittömästi, sitä voidaan säilyttää sopivassa lämpötilassa sen elinkelpoisuuden säilyttämiseksi.

Ultraäänilaitteet DNA: n pirstoutumiseen

Hielscher Ultrasonics tarjoaa erilaisia ultraäänipohjaisia alustoja DNA:lle, RNA:lle ja kromatiinin pirstoutumiseen. Näihin eri alustoihin kuuluvat ultraäänianturit (sonotradat), epäsuorat sonikaatioratkaisut useiden putkien tai monikuokkilevyjen (esim. 96-well-levyt, mikrotitterilevyt), sonoreaktorien ja ultraäänikuppiloiden samanaikaiseen näytteen valmistukseen. Kaikki DNA-vaa'an alustat ovat taajuussäädettyjä, suorituskykyisiä ultraääni prosessoritiimia, jotka ovat tarkasti säätökelpoisia ja tuottavat toistettavia tuloksia.

Ultraääniprosessorit näytteelle ja koolle

Hielscherin moninäytteen ultraäänilaitteilla VialTweeter (jopa 10 koeputkelle) ja UIP400MTP: llä (mikrolevyille / monikylpylevyille) on helppo lyhentää näytteen käsittelyaikaa intensiivisen ja tarkasti hallittavan ultrasonicationin ansiosta samalla kun saadaan haluttu DNA-fragmentin kokojakauma ja saanto. Ultraääni-DNA:n pirstoutuminen tekee plasmidien valmistusvaiheista tehokkaita, luotettavia ja skaalautuvia. Protokollat voidaan skaalata lineaarisesti yhdestä lukuisiin näytteisiin soveltamalla jatkuvia ultraääniparametreja.
Koettimen ultraäänilaitteet, joilla on yhdestä viiteen sormea, ovat ihanteellisia pienempien näytenumeroiden valmistukseen. Hielscherin laboratorion ultraäänilaitteet ovat saatavilla eri tehotasoilla, jotta voit valita ihanteellisen ultraäänihäiritsimen DNA-sovellukseen.