SARS-CoV-2-koronaviruksen inaktivoinnin protokolla sonikaatiolla

SARS-CoV-2-koronaviruksen inaktivointi injektiopullon kanssa

Kun kiinnitysaine oli poistettu, monokerrokset pestiin kolme kertaa fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ennen kennojen kaavinta 1mL MEM / 5% FBS: ään ja sonicated (3 × 10 sekuntia päälle, 10 sekuntia pois 100% teholla ja amplitudilla) Hielscherin ultraääniprosessorilla UP200St vialtweeterillä Liite. Supernatants selvitettiin sentrifugoimalla 3000 × g 10 minuuttia. 

Lue koko protokolla täältä SARS-CoV-2-koronaviruksen inaktivoinnista Welch et al. (2020) alla:

Solut ja virus

Vero E6 -kennot (Vero C1008; ATCC CRL-1586) viljeltiin modifioituna Eaglen välttämättömänä vähimmäisaatelina (MEM), jota täydennettiin 10% (v/v) sikiön vasikan seerumilla (FCS). Virusta käytettiin SARS-CoV-2-kanta hCOV-19/England/2/2020, jonka PHE eristi Yhdistyneen kuningaskunnan ensimmäisestä potilasklusterista 29.1.2020. Tämä virus saatiin kohdasta 1 ja sitä käytettiin inaktivointitutkimuksiin kohdassa 2 tai 3.
SARS-CoV-2-inaktivoinnissa käytettävien reagenssien ja kemikaalien sekä reagenssin sytotoksisuutta poistamisen osalta ks.

Viruksen inaktivointi pesuaineilla – SARS-CoV-2 Koronaviruksen inaktivointiprotokolla Welch ym.

SARS-CoV-2 Inaktivointi

Kaupallisille tuotteille virusvalmisteet (kudosviljelmän neste, titterit 1.10×10⁶ –1 × 10⁸ PFU/ml) on käsitelty kolmesti reagenssien kanssa pitoisuuksina ja valmistajan käyttöohjeissa suositeltuina kosketusaikoina, jos niitä on saatavilla, tai testauslaboratorioiden nimenomaisesti pyytämien pitoisuuksien ja aikojen osalta. Jos valmistaja on antanut useita pitoisuuksia, testattiin pienin tuotteen suhde näytteeseen (eli pienin suositeltu testituotteen pitoisuus). Näytekuljetusputken reagenssit testattiin käyttäen yhden tilavuuden kudosviljelmänesteen suhdetta kymmeneen reagenssitilavuuteen, ellei valmistaja ole määrittänyt näytenesteen tilavuussuhdetta reagenssiin. Pesuaineet, kiinnitysaineet ja liuottimista testattiin ilmoitetuilla pitoisuuksilla ilmoitettujen aikojen ajan. Kaikki inaktivointivaiheet suoritettiin huoneenlämmössä (18 – 25 °C). Vaihtoehtoisten näytetyyppien testaamiseksi virus piikitettiin ilmoitettuun näytematriisiin suhteessa 1:9 ja hoidettiin sitten testireagenssilla edellä kuvatulla tavalla. Kaikki kokeet sisälsivät kolmilisiittisia kontrolli mock-käsiteltyjä näytteitä, joissa oli vastaava määrä PBS:ää testireagenssin sijaan. Välittömästi vaaditun kosketusajan jälkeen 1 ml käsiteltyä näytettä jalostettiin asianmukaisesti valitulla suodatusmatriisissa. Reagenssin poisto inaktivointitestausta varten suoritettiin suuremmassa spin column -muodossa Pierce 4mL -pesuaineen poistopyörityspylväillä (Thermo Fisher) tai täyttämällä tyhjät Pierce 10mL -kapasiteettisentrifugipylväät (Thermo Fisher) SM2 Bio-Beads-, Sephacryl S-400HR- tai Sephadex LH-20 -pylväillä, jotta 4mL pakatut beads/resin. Puhdistusta varten Amicon-suodattimilla 2 × 500 μl:n näytteitä puhdistettiin kahdella keskipakosuodattimella aiemmin kuvatulla menetelmällä ja koottiin yhteen. Formaldehydissä ja formaldehydissä, joissa on glutaraldehydin poisto, käytettiin yhtä suodatinta, jonka näytemäärä oli 1× 500 μl, joka sekoitettiin käsittelyn jälkeen 500 μl:n PBS: ssä ja lisättiin 400ul MEM/ 5% FBS: ään. Tartunnan saaneiden inaktivointiin yksikerroksinen, 12,5 cm² Vero E6 -kennojen pullot (2,5 × 10⁶ 2,5 ml:n MEM/5%:n FBS-tartunnat) infektoituivat MOI 0,001:ssä ja inkuboituivat 37°C/5% CO:ssa₂ 24 tunnin ajan. Supernatantti poistettiin ja solut kiinnitettiin käyttämällä 5 ml formaldehydiä tai formaldehydiä ja glutraldehydiä huoneenlämmössä 15 tai 60 minuutin lämmössä. Kiinnitysaine poistettiin, ja monokerrokset pestiin kolme kertaa PBS: llä ennen kennojen raaputtamista 1mL MEM / 5% FBS: ään ja äänitettiin (3 × 10 sekuntia päälle, 10 sekuntia pois 100% teholla ja amplitudilla) KÄYTTÄMÄLLÄ UP200St VialTweeter-lisälaitetta (Hielscher Ultrasound Technology). Supernatants selvitettiin sentrifugoimalla 3000 × g 10 minuuttia.

Yksityiskohtaiset tiedot REAGENssista, jota käytetään SARS-CoV-2-koronaviruksen inaktivointiin ultraääni-VialTweeterillä Welch ym.

Koko protokolla, mukaan lukien Hielscher VialTweeter - protokolla, löytyy täältä:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Hienostuneet ultraääni dismembrataattorit ja solun hajottajat

Moninäyteinen ultraäänilaite VialTweeter on vain yksi monista ultraääniratkaisuista näytteiden valmistamiseksi biologisissa, biokemiallisissa ja kliinisissä laboratorioissa. Hielscher Ultrasonics tarjoaa ihanteellisen ultraääni dismemebraattorin sovellukseesi, esimerkiksi solulyysi, solujen uuttaminen, kudosten homogenisointi, lysaattiliukoisuus, liuotus, näytteen kaasunpoisto jne.
Kerro meille, kuinka monta näytettä sinun on käsiteltävä tunnissa ja päivässä, jos haluat suoran tai epäsuoran sonikoinnin ja mikä on ultraääninäytehoidon kohde. Suosittelemme sinulle sopivinta ultraääniyksikköä päivittäiseen työrutiiniisi!
Hielscher Ultrasonicsin digitaaliset ultraääniprosessorit on varustettu älykkäällä ohjelmistolla, automaattisella tietojen tallennuksen avulla, helpoilla esiasetusvaihtoehdoilla lämpötilan säätöön, sonikoinnin kestoon, syklin / pulssin tilaan sekä näytteen valaistukseen ja selaimen kaukosäätimeen. Pyrimme tekemään ultraäänilaitteistamme mahdollisimman älykkäitä, jotta tutkimus- ja työrutiinistasi tulee mahdollisimman kätevää ja menestyksekästä.
Klikkaa tästä, löytääksesi lisää sovelluksia, mukaan lukien ultraääninäytteiden valmisteluprotokollat VialTweeterillä!