Menetelmä SARS-CoV-2-koronaviruksen inaktivointiin ultraäänikäsittelyllä

Hielscher VialTweeter on ainutlaatuinen useiden näytteiden ultraäänikäsittelyyn tarkoitettu näytteenkäsittelylaite, jota käytetään SARS-COV-2-koronaviruksen inaktivointiin. VialTweeter mahdollistaa jopa 10 näytepullon samanaikaisen käsittelyn ja on siten ihanteellinen laite suurten näytemäärien käsittelyyn.

SARS-CoV-2-koronaviruksen inaktivointi VialTweeter-laitteella

Fiksatiivin poistamisen jälkeen solujen yksisolukerrokset pestiin kolme kertaa fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS). Tämän jälkeen solut kaavittiin 1 mL:aan MEM/5% FBS -liuosta ja käsiteltiin ultraäänellä (3 × 10 sekuntia päällä, 10 sekuntia pois päältä, teho ja amplitudi 100%) käyttäen Hielscherin ultraääniprosessoria UP200St with VialTweeter ja sen lisäosaa. Supernatantit kirkastettiin sentrifugoimalla voimalla 3 000 × g 10 minuutin ajan.

Lue alta Welch et al. (2020) -julkaisun täydellinen menetelmä SARS-CoV-2-koronaviruksen inaktivointiin:

Solut ja virus

Vero E6 -soluja (Vero C1008; ATCC CRL-1586) kasvatettiin modifioidussa Eaglen minimikasvatusalustassa (MEM), johon oli lisätty 10% (v/v) vasikan sikiön seerumia (FCS). Käytetty virus oli SARS-CoV-2-kanta hCOV-19/England/2/2020, jonka PHE eristi Yhdistyneen kuningaskunnan ensimmäisestä potilasryppäästä 29/01/2020. Virus saatiin siirrostuskerralta 1, ja sitä käytettiin inaktivointitutkimuksissa siirrostuskerralla 2 tai 3.
SARS-CoV-2-inaktivaatioon ja reagenssin sytotoksisuuden poistamiseen käytettävien reagenssien ja kemikaalien osalta katso tieteellinen raportti Welch et al. (2020).

Viruksen inaktivointi detergenteillä – Welch et al. 2020 -julkaisun menetelmä SARS-CoV-2-koronaviruksen inaktivointiin

SARS-CoV-2:n inaktivointi


Kaupallisia tuotteita testattaessa virusvalmisteet (kudosviljelyneste, jonka tiitteri oli välillä 1 × 10⁶ ja 1 × 10⁸ PFU/ml) käsiteltiin kolmena rinnakkaisnäytteenä reagensseilla käyttäen valmistajan käyttöohjeissa suositeltuja pitoisuuksia ja kontaktiaikoja, mikäli ohjeet olivat saatavilla, tai testauslaboratorioiden erikseen pyytämiä pitoisuuksia ja aikoja. Jos valmistaja ilmoitti pitoisuusalueen, testattiin pienin tuotteen ja näytteen välinen suhde (eli testattavan tuotteen pienin suositeltu pitoisuus). Näytteensiirtoputkien reagenssit testattiin käyttämällä yhtä tilavuusosaa kudosviljelynesteestä ja kymmentä tilavuusosaa reagenssista, ellei valmistaja ollut määrittänyt näytenesteen ja reagenssin tilavuussuhdetta. Detergentit, fiksatiivit ja liuottimet testattiin ilmoitetuilla pitoisuuksilla ilmoitettujen aikojen ajan. Kaikki inaktivointivaiheet suoritettiin huoneenlämmössä (18–25°C). Vaihtoehtoisten näytetyyppien testausta varten virusta lisättiin ilmoitettuun näytematriisiin suhteessa 1:9, minkä jälkeen näytteet käsiteltiin testireagensseilla edellä kuvatulla tavalla. Kaikkiin kokeisiin sisältyi kolmena rinnakkaisnäytteenä kontrollinäytteitä, joille tehtiin vastaava käsittely käyttäen testireagenssin sijasta samaa tilavuutta PBS:ää. Välittömästi vaaditun kontaktiajan jälkeen 1mL käsiteltyä näytettä käsiteltiin asianmukaisesti valitulla suodatusmatriisilla. Reagenssien poisto inaktivointitestausta varten tehtiin suuremmilla sentrifugointipylväillä käyttäen Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns (Thermo Fisher) -pylväitä tai täyttämällä tyhjät, tilavuudeltaan 10mL:n Pierce-sentrifugointipylväät (Thermo Fisher) SM2 Bio-Beads-, Sephacryl S-400HR- tai Sephadex LH-20 -materiaalilla siten, että pakattujen helmien tai hartsin tilavuudeksi tuli 4mL. Amicon-suodattimilla tehtävää puhdistusta varten 2 × 500μl:n näytteet puhdistettiin kahdella sentrifugisuodattimella aiemmin kuvatulla menetelmällä ja yhdistettiin sitten. Formaldehydin sekä formaldehydin ja glutaraldehydin yhdistelmän poistamiseen käytettiin yhtä suodatinta ja 1× 500μl:n näytetilavuutta. Käsittelyn jälkeen näyte suspendoitiin uudelleen 500μl:aan PBS:ää ja lisättiin 400ul:aan MEM/5% FBS -kasvatusalustaa. Infektoituneiden inaktivointia varten monolayers, 12,5 cm² flasks of Vero E6 cells (2,5 × 10⁶ cells/flask in 2,5mL MEM/5% FBS) were infected at MOI 0,001 and incubated at 37°C/5% CO₂ 24 tunnin ajan. Supernatantti poistettiin, ja solut fiksoitiin käyttämällä 5mL formaldehydiä tai formaldehydin ja glutaraldehydin yhdistelmää huoneenlämmössä 15 tai 60 minuutin ajan. Fiksatiivi poistettiin, ja yksisolukerrokset pestiin kolme kertaa PBS:llä ennen kuin solut kaavittiin 1mL:aan MEM/5% FBS -kasvatusalustaa ja käsiteltiin ultraäänellä (3 × 10 sekunnin käsittely, 10 sekunnin tauko, teho ja amplitudi 100%) käyttäen VialTweeter-lisälaitteella varustettua UP200St-laitetta (Hielscher Ultrasound Technology). Supernatantit kirkastettiin sentrifugoimalla 3000 × g:n voimalla 10 minuutin ajan.


Tiedot reagenssista, jota käytettiin SARS-CoV-2-koronaviruksen inaktivointiin ultraäänellä toimivalla VialTweeter-laitteella Welch et al. 2020 -julkaisun menetelmän mukaisesti

Täydellinen menetelmä, joka sisältää Hielscher VialTweeter -laitteen käytön, löytyy täältä:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Edistykselliset ultraäänellä toimivat kudosten ja solujen hajotuslaitteet

Useiden näytteiden ultraäänikäsittelyyn tarkoitettu VialTweeter on vain yksi monista ultraääniratkaisuista näytteiden käsittelyyn biologisissa, biokemiallisissa ja kliinisissä laboratorioissa. Hielscher Ultrasonics tarjoaa käyttötarkoitukseesi ihanteellisen ultraäänellä toimivan hajotuslaitteen esimerkiksi solujen lyysiin, solujen uuttoon, kudosten homogenointiin, lysaatin liuotukseen, liuottamiseen, näytteiden kaasunpoistoon jne.
Kerro meille, kuinka monta näytettä sinun on käsiteltävä tunnissa ja päivässä, haluatko käyttää suoraa vai epäsuoraa ultraäänikäsittelyä ja mikä näytteiden ultraäänikäsittelyn tavoite on. Suosittelemme päivittäiseen työhösi parhaiten sopivaa ultraäänilaitetta!
Hielscher Ultrasonicsin digitaaliset ultraääniprosessorit on varustettu älykkäällä ohjelmistolla, automaattisella tietojen tallennuksella, helppokäyttöisillä esiasetuksilla lämpötilan säätöön, ultraäänikäsittelyn kestoon ja jakso-/pulssitilaan sekä näytteen valaistuksella ja selaimen kautta käytettävällä etäohjauksella. Pyrimme tekemään ultraäänilaitteistamme mahdollisimman älykkäitä, jotta tutkimuksesi ja päivittäinen työsi olisivat mahdollisimman sujuvia ja tuloksellisia.
Napsauta tästä ja tutustu muihin käyttökohteisiin sekä menetelmiin, joissa näytteitä käsitellään ultraäänellä VialTweeter-laitteella!