Protokolla SARS-CoV-2-koronaviruksen inaktivoinnille sonikaatiolla

Hielscher VialTweeter on ainutlaatuinen ultraääni-moninäytevalmistusyksikkö, jota käytetään koronaviruksen SARS-COV-2 inaktivointiin. VialTweeter mahdollistaa jopa 10 näytepullon valmistamisen samanaikaisesti ja on siten ihanteellinen yksikkö massanäytteiden käsittelyyn.

SARS-CoV-2-koronaviruksen inaktivointi VialTweeterillä

Kiinnitysaineen poistamisen jälkeen yksikerroksiset kerrokset pestiin kolme kertaa fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ennen solujen kaavinta 1 ml: ksi MEM / 5% FBS: ksi ja sonikoidaan (3 × 10 sekuntia päällä, 10 sekuntia pois päältä 100%: n teholla ja amplitudilla) Hielscherin ultraääniprosessorilla UP200St ja VialTweeter liite. Supernatantit kirkastettiin sentrifugoimalla 3000 × g:ssa 10 minuutin ajan. 

Lue koko protokolla SARS-CoV-2-koronaviruksen inaktivoinnista Welch et al. (2020) alla:

Solut ja virus

Vero E6 -solut (Vero C1008; ATCC CRL-1586) viljeltiin modifioidussa Eagle's minimum essential -väliaineessa (MEM), jota täydennettiin 10% (v/v) sikiön vasikan seerumilla (FCS). Käytetty virus oli SARS-CoV-2-kanta hCOV-19/England/2/2020, jonka PHE eristi Ison-Britannian ensimmäisestä potilasklusterista 29.1.2020. Tämä virus saatiin kohdasta 1 ja sitä käytettiin inaktivointitutkimuksiin kohdassa 2 tai 3.
SARS-CoV-2-inaktivaatioon ja reagenssin sytotoksisuuden poistamiseen käytettävien reagenssien ja kemikaalien osalta katso tieteellinen raportti Welch et al. (2020).

Pesuaineiden aiheuttama viruksen inaktivointi – SARS-CoV-2-koronaviruksen inaktivointiprotokolla, Welch et ai., 2020

SARS-CoV-2-inaktivointi

Kaupallisten tuotteiden osalta virusvalmisteet (kudosviljelyneste, tiitterit vaihtelevat välillä 1 × 10⁶ arvoon 1 × 10⁸ PFU/ml) käsiteltiin kolmena kappaleena reagensseilla pitoisuuksina ja kosketusaikoina, joita suositellaan valmistajan käyttöohjeissa, jos sellaisia on saatavilla, tai testauslaboratorioiden erityisesti pyytäminä pitoisuuksina ja aikoina. Jos valmistaja ilmoitti pitoisuusalueen, testattiin alhaisin valmisteen ja näytteen suhde (eli pienin suositeltu testituotteen pitoisuus). Näytteenkuljetusputken reagenssit testattiin käyttämällä yhden kudosviljelynestetilavuuden suhdetta kymmeneen tilavuuteen reagenssia, ellei valmistaja ole määritellyt näytenesteen ja reagenssin tilavuussuhdetta. Pesuaineet, kiinnitysaineet ja liuottimet testattiin ilmoitetuilla pitoisuuksilla ilmoitettuina aikoina. Kaikki inaktivointivaiheet suoritettiin huoneenlämmössä (18–25 °C). Vaihtoehtoisten näytetyyppien testaamista varten virus lisättiin osoitettuun näytematriisiin suhteessa 1:9, minkä jälkeen sitä käsiteltiin testireagensseilla edellä kuvatulla tavalla. Kaikki kokeet sisälsivät kolminkertaisia kontrollinäytteitä, joissa oli vastaava määrä PBS:ää testireagenssin sijasta. Välittömästi vaaditun kosketusajan jälkeen käsiteltiin 1 ml käsiteltyä näytettä käyttäen asianmukaisesti valittua suodatusmatriisia. Reagenssin poisto inaktivointitestausta varten suoritettiin suuremmassa linkouskolonnimuodossa käyttämällä Pierce 4 ml: n pesuaineenpoistolinkokolonnia (Thermo Fisher) tai täyttämällä tyhjät Pierce 10 ml: n sentrifugipylväät (Thermo Fisher) SM2 Bio-helmillä, Sephacryl S-400HR: llä tai Sephadex LH-20: lla, jolloin saatiin 4 ml pakattuja helmiä / hartsia. Amicon-suodattimilla puhdistamista varten 2 × 500 μl:n näytteet puhdistettiin kahdella keskipakosuodattimella edellä kuvatulla menetelmällä ja yhdistettiin sitten yhteen. Formaldehydille ja formaldehydille glutaraldehydin poistolla käytettiin yhtä suodatinta, jonka näytetilavuus oli 1× 500μl, suspendoitiin uudelleen käsittelyn jälkeen 500 μl: ssa PBS: ssä ja lisättiin 400 ul MEM / 5% FBS: ään. Tartunnan saaneiden inaktivointiin yksikerroksiset, 12,5 cm² Vero E6 -solujen pullot (2.5 × 10⁶ solut/pullo 2,5 ml:ssa MEM/5 % FBS) infektoitiin MOI 0,001:ssä ja inkuboitiin 37 °C:ssa/5 % CO:ssa₂ 24 tunnin ajan. Supernatantti poistettiin ja solut kiinnitettiin käyttämällä 5 ml formaldehydiä tai formaldehydiä ja glutaraldehydiä huoneenlämmössä 15 tai 60 minuutin ajan. Fiksatiivi poistettiin ja yksikerroksiset pestiin kolme kertaa PBS: llä ennen solujen kaavinta 1 ml: ksi MEM / 5% FBS ja sonikoitu (3 × 10 sekuntia päällä, 10 sekuntia pois päältä 100%: n teholla ja amplitudilla) käyttämällä UP200St: tä, jossa on VialTweeter-kiinnitys (Hielscherin ultraäänitekniikka). Supernatantit kirkastettiin sentrifugoimalla 3000 × g:ssa 10 minuutin ajan.

Yksityiskohdat reagenssista, jota käytetään SARS-CoV-2-koronaviruksen inaktivointiin ultraääni VialTweeterin kanssa protokollan mukaisesti Welch et ai. 2020

Koko protokolla, mukaan lukien Hielscher VialTweeterin käyttö, löytyy täältä:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Hienostuneet ultraäänidismembraattorit ja solujen häiritsijät

Moninäytteinen ultraäänilaite VialTweeter on vain yksi monista ultraääniratkaisuista näytteen valmistukseen biologisissa, biokemiallisissa ja kliinisissä laboratorioissa. Hielscher Ultrasonics tarjoaa ihanteellisen ultraääni dismembrator sovelluksellesi, esim. solulyysi, solujen uuttaminen, kudosten homogenisointi, lysaatin liuottaminen, liuottaminen, näytteen kaasunpoisto jne.
Kerro meille, kuinka monta näytettä sinun on käsiteltävä tunnissa ja päivässä, jos haluat suoran tai epäsuoran sonikoinnin ja mikä on ultraääninäytteen käsittelyn kohde. Suosittelemme sinulle sopivinta ultraääniyksikköä päivittäiseen työrutiiniisi!
Hielscher Ultrasonics' digitaaliset ultraääniprosessorit on varustettu älykkäällä ohjelmistolla, automaattisella tietojen tallennuksella, helpoilla esiasetusvaihtoehdoilla lämpötilan säätöön, sonikoinnin kestoon, syklin / pulssitilaan sekä näytteen valaistukseen ja selaimen kaukosäätimeen. Pyrimme tekemään ultraäänilaitteistamme mahdollisimman älykkäitä, jotta tutkimus- ja työrutiinistasi tulee mahdollisimman kätevä ja onnistunut.
Klikkaa tästä löytääksesi lisää sovelluksia, mukaan lukien ultraääninäytteiden valmistuksen protokollat VialTweeterin kanssa!