Ultraääninäytteen valmistelu ELISA-määrityksille
ELISA:n kaltaisia määrityksiä käytetään laajalti in vitro -diagnostiikassa, sairauteen liittyvien proteiinien havaitsemisessa ja laadunvalvonnassa (esim. ruoka-allergeenien seurannassa). Ultraääninäytteen valmistus on nopea, luotettava ja toistettavissa oleva tekniikka solujen hajottamiseksi ja solunsisäisten proteiinien, DNA: n, RNA: n ja organellien eristämiseksi. Hielscher Ultrasonics tarjoaa erilaisia ultraääniratkaisuja yksittäisten näytteiden, useiden injektiopullojen sekä mikrotitterilevyjen ja 96-kuoppalevyjen kätevään valmistukseen.
ELISA – Entsyymivälitteinen immunosorbenttimääritys
ELISA tarkoittaa entsyymiin liittyvää immunosorbenttimääritystä ja on laajalti käytetty biokemiallinen analyysitekniikka ligandia sitovien määritysten luokassa. ELISA: ssa nestemäinen näyte lisätään kiinteään kiinteään faasiin, jolla on erityiset sitoutumisominaisuudet. Normaalisti kiinteä kiinteä faasi levitetään pinnoitteena kaivolevylle tai ELISA-levylle. Sitten erilaisia nestemäisiä reagensseja lisätään peräkkäin, inkuboidaan ja pestään siten, että lopulta optinen muutos (esim. värin kehittyminen entsymaattisen reaktion tuotteen avulla) tapahtuu kaivon lopullisessa nesteessä. Optinen muutos mahdollistaa analyytin määrän mittaamisen ns. “lukeminen". Kvantitatiivista lukemista varten käytetään spektrofotometriä, fluorometriä, tai luminometriä läpäisevän valon voimakkuuden havaitsemiseksi ja mittaamiseksi. Havaitsemisen herkkyyteen vaikuttaa signaalin vahvistuminen analyyttisten reaktioiden aikana. Koska entsyymireaktiot ovat hyvin tutkittuja ja luotettavia vahvistusprosesseja, entsyymejä käytetään signaalin luomiseen. Entsyymit on liitetty detektioreagensseihin kiinteissä suhteissa tarkan kvantifioinnin mahdollistamiseksi, mikä selittää myös nimen "entsyymivälitteinen" immunosorbenttimääritys.
Koska ELISA-määritykset suoritetaan mikrotiitterilevyillä / 96-kuoppalevyillä, sitä kutsutaan levypohjaiseksi määritystekniikaksi ja sitä käytetään mm. kliinisessä in vitro -diagnostiikassa, tutkimuksessa, lääkekehityksessä jne. vasta-aineiden, peptidien, proteiinien ja hormonien havaitsemiseksi ja kvantifioimiseksi.
ELISA-tekniikkaa käytetään usein diagnostisena työkaluna lääketieteessä, biotekniikassa, kasvipatologiassa, ja se on myös tärkeä laadunvalvontamittaus useilla toimialoilla.

Ultraääninäytteen valmisteluyksikkö VialTweeter käytetään solulyysiin ja proteiinien uuttamiseen ennen ELISA-määrityksiä
Ultraääninäytteen valmistelu ennen ELISA: ta
Ennen kuin ELISA-määritys voidaan suorittaa, näytteet vaativat valmistusvaiheita, kuten solulyysiä ja solunsisäisten proteiinien, DNA: n, RNA: n jne. Ultraäänisolulyysin ja proteiinieristyksen etuna on sen korkea hyötysuhde, luotettavuus ja toistettavuus. Kaikki nämä tekijät ovat tärkeitä laadukkaan diagnostiikan ja tutkimustulosten saamiseksi
- Homogeeninen näytteen käsittely
- Täydellinen hajoaminen
- Täydellinen proteiiniuutto (esim. vasta-aineet, DNA)
- Optimaalinen sopeutuminen solutyyppiin
- Mille tahansa otoskoolle
- Toistettavissa
- Lämpötilasäädelty
- Automaattinen dataprotokolla SD-kortilla
Pre-ELISA-ultraäänisolulyysin protokolla
- soluviljelmien osalta: Ennen ultraäänisolulyysiä sentrifugoidaan soluja 5 minuutin ajan 270 x g: ssa mikrosentrifugissa. Supernatantti poistetaan aspiroimalla ja solut suspendoidaan uudelleen 30–100 μl:aan RIPA-puskuria. Sitten solupellettiä inkuboidaan jäällä 30 minuutin ajan.
- Nyt solunäyte on valmis ultraäänilyysiin:
Käytä anturityyppistä ultraäänilaitetta (esim. UP200Ht S26d2-anturilla) tai ultraääni-moninäytelaite (esim. VialTweeter enintään 10 injektiopullon samanaikaiseen sonikaatioon tai UIP400MPT mikrotitterilevyille / 96-kuoppalevyille) riippuen valmistettavien näytteiden määrästä.
Yhden näytteen koetintyyppistä sonikaatiota varten solut asetetaan 1,5 ml: n mikrosentrifugiputkiin. - Esiaseta ultraäänikesto, kokonaisenergian syöttö, syklitila ja / tai lämpötilarajat ultraäänilaitteen digitaalisessa valikossa. Tämä takaa erittäin luotettavan sonikoinnin ja toistettavuuden.
- Aseta sonotrode ja kytke ultraäänilaite päälle. Siirrä ultraäänianturin mikrokärki varovasti näytteen läpi, jotta näyte sonikoidaan tasaisesti.
Useimmille soluille ultraäänilyysi valmistuu 2-4 syklin jälkeen 10 sekunnin sonikaatio. - Sonikoinnin jälkeen poista sonotrode näytteestä. Näytteitä inkuboidaan jäällä 5 minuutin ajan. Sitten sentrifugoidaan 10 000 x g: ssa 20 minuutin ajan roskien pelletoimiseksi. Supernatantit siirretään uuteen mikrosentrifugiputkeen. Merkitse analyytit ja säilytä -20 °C:ssa.
- Ultraäänisonotrode voidaan puhdistaa pyyhkimällä se kunnolla alkoholilla tai sonikoimalla alkoholilla, esimerkiksi 70% etanolilla, täytetyssä dekantterilasissa. Kaikki titaanista valmistetut ultraäänianturit ovat autoklaavissa.

Proteiinien uuttaminen E. coli -soluista ultraäänianturi UP200St
- Huuhtele kudos jääkylmällä PBS:llä (0,01M, pH = 7,4) ylimääräisen hemolyysiveren poistamiseksi perusteellisesti.
- Punnitse kudos (munuainen, sydän, keuhkot, perna jne.) ja maseroi se pieniksi paloiksi, jotka homogenoidaan PBS:ssä. Tarvittava PBS:n tilavuus on suhteessa kudoksen painoon. Nyrkkisääntönä 1 g kudosta vaatii noin 9 ml PBS:ää. On suositeltavaa lisätä proteaasi-inhibiittoria PBS: ään. (RIPA- tai hypotonista lyysipuskuria, joka sisältää proteaasia ja fosfataasi-inhibiittoricocktailia, voidaan käyttää vaihtoehtoisesti.)
- Kudoksen koosta riippuen lyhyt pyörrehoito (noin 1-2 minuuttia 15 sekunnissa) voi olla hyödyllinen kudoksen esikäsittelyssä.
- Asenna mikrokärki, esimerkiksi S26d2, ultraäänilaitteeseen. Näyteputki asetetaan kudoksen kanssa jäähauteeseen.
- Sonikoidaan näyte ultraäänilaitteellasi, esimerkiksi UP200St (80% amplitudi) 1 minuutin ajan pulssitilassa (15 sekuntia päällä, 15 sekunnin tauko). Pidä näyte jäähauteessa.
- Tämän jälkeen homogenaatit sentrifugoidaan spesifisten poolien (sytosoliset, ydin-, mitokondriot tai lysosomaaliset) saamiseksi analysoitavan proteiinin rikastamiseksi. Sentrifugoimalla näytettä 5 minuutin ajan 5000 ×g:ssa, supernatantti otetaan talteen.
Luotettava lämpötilan säätö sonikoinnin aikana
Lämpötila on ratkaiseva prosessiin vaikuttava tekijä, joka on erityisen tärkeä biologisten näytteiden käsittelyssä, esimerkiksi proteiinien lämpöhajoamisen estämisessä. Kuten kaikki mekaaniset näytteenvalmistustekniikat, sonikaatio luo lämpöä. Näytteiden lämpötilaa voidaan kuitenkin hallita hyvin Hielscher Ultrasonics -laitteita käytettäessä. Esittelemme sinulle erilaisia vaihtoehtoja näytteiden lämpötilan seuraamiseksi ja säätämiseksi valmistellessasi niitä anturityyppisellä ultraäänilaitteella tai VialTweeterillä esianalyyttisesti.
- Näytteen lämpötilan seuranta: Kaikki Hielscherin digitaaliset ultraääniprosessorit on varustettu älykkäällä ohjelmistolla ja kytkettävällä lämpötila-anturilla. Kytke lämpötila-anturi ultraäänilaitteeseen (esim. UP200Ht, UP200St, VialTweeter, Multi-well-levyn sonikaattori UIP400MTP) ja työnnä lämpötila-anturin kärki yhteen näyteputkista. Digitaalisen värillisen kosketusnäytön avulla voit asettaa ultraääniprosessorin valikossa tietyn lämpötila-alueen näytteen sonikaatiolle. Ultraäänilaite pysähtyy automaattisesti, kun maksimilämpötila saavutetaan, ja pysähtyy, kunnes näytteen lämpötila on laskenut asetetun lämpötilan ∆ alempaan arvoon. Sitten sonikaatio alkaa automaattisesti uudelleen. Tämä älykäs ominaisuus estää lämmön aiheuttaman hajoamisen.
- Ultraäänimoninäyteyksikön VialTweeter osalta titaanilohko, joka pitää näyteputket, voidaan esijäähdyttää. Laita VialTweeter-lohko (vain sonotrode ilman anturia!) jääkaappiin tai pakastimeen titaanilohkon esijäähdyttämiseksi, mikä auttaa lykkäämään näytteen lämpötilan nousua. Jos mahdollista, myös itse näyte voidaan esijäähdyttää.
- Käytä jäähaudetta tai kuivajäätä jäähtyäksesi sonikoinnin aikana. Aseta näyteputket sonikoinnin aikana jäähauteeseen. Käytä VialTweeterissä matalaa alustaa, joka on täytetty kuivajäällä, ja aseta VialTweeter kuivajäälle, jotta lämpö haihtuu nopeasti.
Asiakkaat ympäri maailmaa käyttävät Hielscher-koetintyyppisiä ultraäänilaitteita sekä moninäytteisiä sonikaatioyksiköitä VialTweeter ja UIP400MTP päivittäiseen näytteenvalmistustyöhönsä biologisissa, biokemiallisissa, lääketieteellisissä ja kliinisissä laboratorioissa. Hielscher-prosessorien älykäs ohjelmisto ja lämpötilan säätö, lämpötilaa ohjataan luotettavasti ja lämmön aiheuttamaa näytteen hajoamista vältetään. Ultraääninäytteiden valmistus Hielscherin ultraääniratkaisuilla tuottaa erittäin luotettavia ja toistettavia tuloksia!
Lue lisää korkean suorituskyvyn sonikaatiosta käyttämällä monikuoppalevyn sonikaattoria UIP400MTP määrityksiin!
Ota yhteyttä! / Kysy meiltä!
Kirjallisuus / Viitteet
- Brandy Verhalen , Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed. Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
Faktoja, jotka kannattaa tietää
Millaisia ELISA-tyyppejä on olemassa?
ELISA-tyyppejä on useita, jotka erottuvat toimintaperiaatteestaan. Ne tunnetaan nimellä suora ELISA, epäsuora ELISA, sandwich ELISA, kilpailukykyinen ELISA ja käänteinen ELISA. Alla esitämme sinulle yleiskatsauksen eri ELISA-tyypeistä ja niiden pääominaisuuksista ja eroista.
ELISA voidaan suorittaa laadullisessa tai kvantitatiivisessa muodossa. Kvalitatiivisilla tuloksilla saadaan yksinkertainen positiivinen tai negatiivinen tulos, kun taas kvantitatiivisessa ELISA:ssa näytteen optista tiheyttä (OD) verrataan standardikäyrään, joka on tyypillisesti kohdemolekyylin tunnetun konsentraation liuoksen sarjalaimennus.
Suora ELISA
Suora ELISA on Elisan yksinkertaisin määritysmuoto, jossa käytetään vain entsyymileimattua primaarivasta-ainetta eikä sekundaarisia vasta-aineita tarvita. Entsyymillä leimattu primaarinen vasta-aine sitoutuu suoraan kohteeseen eli antigeeniin. Puskuroitu antigeeniliuos lisätään mikrotiitterilevyn jokaiseen kuoppaan (yleensä 96-kuoppalevyt, ELISA-levyt), jossa se tarttuu muovipintaan varausvuorovaikutusten kautta. Kun primaariseen vasta-aineeseen liittyvä entsyymi reagoi substraattinsa kanssa, se tuottaa näkyvän signaalin, joka voidaan mitata spektrofotometrillä, fluorometrillä tai luminometrillä.
Epäsuora ELISA
Epäsuoraa ELISA-testiä varten tarvitaan sekä primaarinen vasta-aine että sekundaarinen vasta-aine. Toisin kuin suora ELISA, ei kuitenkaan ensisijainen vasta-aine, vaan sekundaarinen vasta-aine on merkitty entsyymillä. Antigeeni immobilisoidaan kuoppalevyyn ja sitoutuu primaariseen vasta-aineeseen. Tämän jälkeen entsyymileimattu sekundaarinen vasta-aine sitoutuu primaariseen vasta-aineeseen. Lopuksi sekundaariseen vasta-aineeseen liittyvä entsyymi reagoi substraattinsa kanssa tuottaakseen näkyvän signaalin, joka voidaan havaita.
Voileipä ELISA
Vaikka suorissa ja epäsuorissa ELISA-testeissä antigeeni immobilisoidaan ja päällystetään kaivolevyn pinnalle, sandwich-ELISA: ssa vasta-aine immobilisoidaan ELISA-levyn muovipinnalle. Voileipä-ELISA: n immobilisoituja vasta-aineita kutsutaan sieppausvasta-aineiksi. Sieppausvasta-aineiden lisäksi sandwich-ELISA: ssa tarvitaan myös niin sanottuja toteamisvasta-aineita. Detektiovasta-aineet sisältävät merkitsemättömän primaarisen toteamisvasta-aineen ja entsyymileimatun sekundaarisen toteamisvasta-aineen.
Vaiheittain kiinnostava antigeeni sitoutuu levylle immobilisoituun sieppausvasta-aineeseen. Sitten ensisijainen havaitsemisvasta-aine sitoutuu antigeeniin. Tämän jälkeen sekundaarinen toteamisvasta-aine sitoutuu primaariseen toteamisvasta-aineeseen. Viimeisessä reaktiovaiheessa entsyymi reagoi substraattinsa kanssa tuottaen näkyvän signaalin, joka voidaan havaita optisesti.
Kilpailukykyinen ELISA
Kilpailukykyinen ELISA, joka tunnetaan myös nimellä inhibitio ELISA, on monimutkaisin ELISA-tyyppi, koska siihen liittyy inhibiittoriantigeenin käyttö. Jokainen kolmesta muodosta, suora, epäsuora ja sandwich-ELISA, voidaan mukauttaa kilpailukykyiseen ELISA-muotoon. Kilpailevassa ELISA:ssa inhibiittoriantigeeni ja kiinnostava antigeeni kilpailevat sitoutumisesta primaariseen vasta-aineeseen.
Kilpailevaa ELISA: ta varten merkitsemätöntä vasta-ainetta inkuboidaan sen antigeenin eli näytteen läsnä ollessa. Nämä sitoutuneet vasta-aine/antigeenikompleksit lisätään sitten antigeenipinnoitettuun kuoppaan.
Levy pestään siten, että sitoutumattomat vasta-aineet poistetaan. Kilpailukykyisellä ELISA: lla on nimensä johtuen siitä, että mitä enemmän antigeeniä näytteessä on, sitä enemmän muodostuu antigeeni-vasta-ainekomplekseja. Tämä tarkoittaa, että kaivossa on vähemmän sitoutumattomia vasta-aineita, jotka sitoutuvat antigeeniin, ja antigeenien on kilpailtava käytettävissä olevasta vasta-aineesta. Lisätään sekundaarinen vasta-aine, joka vastaa primaarista vasta-ainetta. Tämä toinen vasta-aine liittyy entsyymiin. Kun substraatti lisätään, jäljellä olevat entsyymit tuottavat kromogeenisen tai fluoresoivan signaalin.
Tässä vaiheessa reaktio pysäytetään signaalin mahdollisen kyllästymisen välttämiseksi.
Jotkut kilpailevat ELISA-sarjat sisältävät entsyymiin liittyvän antigeenin entsyymiin liittyvän vasta-aineen sijaan. Leimattu antigeeni kilpailee primaarisista vasta-aineiden sitoutumiskohdista näyteantigeenin kanssa (merkitsemätön). Mitä vähemmän antigeeniä näytteessä on, sitä enemmän leimattu antigeeni säilyy kaivossa ja sitä vahvempi signaali.
Käänteinen ELISA
Käänteinen ELISA ei käytä kaivolevyjä, vaan jättää antigeenit suspendoitumaan testinesteeseen. Käänteinen ELISA-testi mittaa sitoutuneen vasta-aineen määrän antigeenin kautta. Se kehitettiin erityisesti Länsi-Niilin viruksen vaippaproteiinin havaitsemiseksi ja tutkimiseksi ja miten se pystyy löytämään virusspesifisiä vasta-aineita.
Mitä entsymaattisia markkereita käytetään ELISA: han?
Alla olevassa luettelossa esitetään yleisimmät ELISA-määrityksissä käytetyt entsymaattiset markkerit, joiden avulla testin tulokset voidaan mitata sen päätyttyä.
- OPD (o-fenyleenidiamiinidihydrokloridi) muuttuu keltaiseksi HRP: n (piparjuuriperoksidaasi) havaitsemiseksi, jota käytetään usein konjugoituna proteiinina.
- TMB (3,3′,5,5′-tetrametyylibentsidiini) muuttuu siniseksi HRP: n havaitsemisen jälkeen ja muuttuu keltaiseksi rikkihapon tai fosforihapon lisäämisen jälkeen.
- ABTS (2,2′-Azinobis [3-etyylibentsotiatsoliini-6-sulfonihappo]-diammoniumsuola) muuttuu vihreäksi HRP:tä havaitessaan.
- PNPP (p-nitrofenyylifosfaatti, dinatriumsuola) muuttuu keltaiseksi havaitessaan alkalisen fosfataasin.