Ultraääninäytteen valmistelu ELISA-määrityksille

Elisa – Entsyymiin liittyvä immunosorbenttimääritys

ELISA tarkoittaa entsyymisidonnaista immunosorbenttimääritystä ja on laajalti käytetty biokemiallinen analyysitekniikka ligandeja sitovien määritysten luokassa. ELISA:ssa nestemäinen näyte lisätään kiinteään kiinteään faaviin, jolla on erityisiä sidontaominaisuuksia. Tavallisesti kiinteä faasi levitetään päällysteenä pohjalevylle tai ELISA-levylle. Sitten erilaisia nestemäisiä reagenssit lisätään, inkuboidaan ja pestään peräkkäin niin, että lopulta kukon lopullisessa nesteessä tapahtuu optinen muutos (esim. värin kehitys entsymaattisen reaktion tuotteella). Optisen muutoksen avulla voidaan mitata analyytin määrä niin sanotulla määrällisessä “lukeminen". Kvantitatiivista lukemaa varten käytetään spektrofotometriä, fluorometriä tai luminometriä välittyneen valon voimakkuuden havaitsemiseen ja mittaamiseen. Havaitsemisen herkkyyteen vaikuttaa signaalin vahvistuminen analyyttisten reaktioiden aikana. Koska entsyymireaktiot ovat hyvin tutkittuja ja luotettavia vahvistusprosesseja, signaalin luomiseen käytetään entsyymejä. Entsyymit ovat kiinteissä mittasuhteissa yhteydessä toteamisreagenssiin tarkan kvantifioimisen mahdollistamiseksi, mikä selittää myös nimen "entsyymisidentifioitu" immunosorbenttimääritys.
Koska ELISA-määritykset suoritetaan mikrotitterilevyissä / 96-well-levyissä, sitä kutsutaan levypohjaiseksi määritystekniikaksi ja sitä käytetään esimerkiksi kliinisessä in vitro -diagnostiikassa, tutkimuksessa, lääkekehityksessä jne.
ELISA-tekniikkaa käytetään usein diagnostiikkavälineenä lääketieteessä, biotekniikassa, kasvipatologiassa, ja se on myös tärkeä laadunvalvontamittaus useilla toimialoilla.

Ultraääninäytteen valmistelu ennen ELISA:ta

Ennen elisa-määritystä näytteet edellyttävät valmisteluvaiheita, kuten solulyysiä ja solunsisäisten proteiinien, DNA:n, RNA:n jne. Ultraäänisolulyysin ja proteiinieristyksen etuna on sen korkea hyötysuhde, luotettavuus ja uusittavuus. Kaikki nämä tekijät ovat tärkeitä laadukkaan diagnostiikan ja tutkimustulosten saamiseksi

Pre-ELISA-ultraäänisolulyysiprotokolla

• Soluviljelmissä: Ennen ultraäänisolulyysiä sentrifugoi soluja 5 minuuttia 270 x g mikrokeskimetrissä. Poista supernatantti aspiraatiolla ja sekoitetaan solut uudelleen 30–100 μl:ssa RIPA-puskuria. Inkuboi sitten solupellettiä jäällä 30 minuuttia.
• Solunäyte on valmis ultraäänilyysiin.
  Käytä anturityyppistä ultraäänilaitetta (esim. Uf200 ः t S26d2-anturilla) tai ultraääni moninäytelaitteella (esim. VialTweeter enintään 10 injektiopullon samanaikaiseen sonikaatioon tai UIP400MPT mikrotiter-levyille / 96-well-levyille) riippuen siitä, kuinka paljon näytteitä sinun on valmisteltava.
  Yksittäisen näytteen anturityyppistä sonikaatiota varten solut on sijoiteta 1,5 ml:n mikrosentrifugeputkiin.
• Aseta ultraääniaika, kokonaisenergiansyöttö, pyöräilytila ja/tai lämpötilarajat ultraäänilaitteen digitaaliseen valikkoon. Tämä takaa erittäin luotettavan sonikoinnin ja toistettavuuden.
• Käynnistä sonotrode ja kytke ultraäänilaite päälle. Siirrä ultraäänianturin mikrokärki varovasti näytteen läpi, jotta näyte sonitsaan tasaisesti.
  Useimmissa soluissa ultraäänilyysi suoritetaan 2 -4 syklin kuluttua 10 sekunnin sonikaatiosta.
• Sonikoinnin jälkeen poista sonotrode näytteestä. Näytteet on inkuboitu jäällä 5 min. Sentrifugoi sitten 10 000 x g:ssa 20 minuutin jätteitä. Siirrä supernatantit uuteen mikrosentrifugeputkeen. Merkitse analyytit ja säilytä -20 °C:ssa.
• Ultraäänisonotrodi voidaan puhdistaa pyyhkimällä se kunnolla alkoholilla tai sonikaatti alkoholilla täytetyssä sekoitin, esimerkiksi 70% etanolilla. Kaikki titaanista tehdyt ultraäänianturit ovat autoklaavable.

Kudosten homogenaatit:

• Huuhtele kudos jääkylmällä PBS: llä (0, 01M, pH=7, 4) ylimääräisen hemolyysiveren poistamiseksi perusteellisesti.
• Punnitse kudos (munuainen, sydän, keuhko, perna jne.) ja maseroi se pieniksi paloiksi, jotka homogenoidaan PBS: llä. Tarvittava pbs-tilavuus liittyy kudoksen painoon. Nyrkkisääntönä on, että 1 g kudosta vaatii n. 9mL PBS. On suositeltavaa lisätä joitakin proteaasinestäjiä PBS: ään. (Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää proteaasia ja fosfataasin estäjäcocktailia sisältävää ripa- tai hypotonista lyysipuskuria.)
• Kudoksen koosta riippuen lyhyt pyörrehoito (n. 1-2 min. 15 sekunnissa) voi auttaa kudoksen esikäsittelyssä.
• Asenna mikrokärki, esimerkiksi S26d2, ultraääniaineeesi. Aseta näyteputki kudoksen kanssa jääkylpyyn.
• Sonikaa näyte ultraääniaineella, esimerkiksi UP200St (80% amplitudi) 1 minuutin ajan pulssitilassa (15 sekuntia päällä, 15 sekunnin tauko). Pidä näyte jääkylvyssä.
• Tämän jälkeen homogenaatit sentrifugoidaan tiettyjen poolien (sytosoli-, ydin-, mitokondrioiden tai lysosomaalien) saamiseksi proteiinin rikastamiseksi analyysia varten. Sentrifugoimalla näytettä 5 minuutin ajan 5000×g:ssä, supernatantti noudetaan.

Luotettava lämpötilan säätö sonikoinnin aikana

Lämpötila on ratkaiseva prosessiin vaikuttava tekijä, joka on erityisen tärkeä biologisten näytteiden hoidossa, esimerkiksi proteiinien lämpöhajoamisen estämisessä. Kuten kaikki mekaaniset näytteenvalmistustekniikat, sonikaatio luo lämpöä. Näytteiden lämpötilaa voidaan kuitenkin hallita hyvin Hielscher Ultrasonics -laitteita käytettäessä. Esittelemme sinulle erilaisia vaihtoehtoja näytteiden lämpötilan seuraamiseksi ja ohjaamiseksi samalla, kun valmistelet niitä anturityyppisellä ultraääniaattorilla tai VialTweeter-esianalysaattorilla.

1. Näytteen lämpötilan seuranta: Kaikki Hielscherin digitaaliset ultraääniprosessorit on varustettu älykkäällä ohjelmistolla ja kytkettävällä lämpötila-anturilla. Liitä lämpötila-anturi ultraäänilaitteeseen (esim. Uf200 ः t, UP200St, VialTweeter, UIP400MTP) ja aseta lämpötila-anturin kärki yhteen näyteputkista. Digitaalisen värillisen kosketusnäytön avulla voit asettaa ultraääniprosessorin valikkoon tietyn lämpötila-alueen näytteen sonikaatiota varten. Ultraäänilaite pysähtyy automaattisesti, kun enimmäislämpötila on saavutettu, ja pysähtyy, kunnes näytteen lämpötila laskee asetettuun lämpötilaan ∆. Sitten sonikaatio alkaa automaattisesti uudelleen. Tämä älykäs ominaisuus estää lämmön aiheuttaman hajoamisen.
2. Ultraääni moninäyteyksikön VialTweeterin osalta näyteputkia pitelevä titaanilohko voidaan esijäähdytettyä. Laita VialTweeter-lohko (vain sonotrode ilman anturia!) jääkaappiin tai pakastimeen esijäähdyttääkseen titaanilohkon, mikä auttaa lykkäämään näytteen lämpötilan nousua. Jos mahdollista, myös itse näyte voidaan esijäähdytyä.
3. Jäähdytä sonikoinnin aikana jääkylvyllä tai kuivajäällä. Aseta näyteputket sonikoinnin aikana jääkylpyyn. Käytä VialTweeter- pullossa matalaa lokeroa, joka on täytetty kuivalla jäällä, ja aseta VialTweeter kuivalle jäälle, jotta lämpö haihtuu nopeasti.

Asiakkaat ympäri maailmaa käyttävät Hielscher-anturi-ultraääniainteja sekä moninäyteisiä sonikaatioyksiköitä VialTweeter ja UIP400MTP päivittäiseen näytteenvalmistustyöhönsä biologisissa, biokemiallisissa, lääketieteellisissä ja kliinisissä laboratorioissa. Hielscher-prosessoritivien älykäs ohjelmisto ja lämpötilan säätö, lämpötila on luotettavasti ohjattu ja lämmön aiheuttama näytteen hajoaminen vältetään. Ultraääninäytteiden valmistelu Hielscher-ultraääniratkaisuilla tuottaa erittäin luotettavia ja toistettavissa olevia tuloksia!