Hielscher Ultra ääni tekniikka

Ultraääninäytteen valmistelu ELISA-määrityksille

ELISAn kaltaisia määritteet ovat laajalti käytössä in vitro -diagnostiikassa, sairauteen liittyvässä proteiinien havaitsemisessa ja laadunvalvonnassa (esim. elintarvikeallergeenien seurannassa). Ultraääninäytteiden valmistus on nopea, luotettava ja toistettavissa oleva tekniikka solunsisäisten proteiinien, DNA:n, RNA:n ja organellejen eristämiseksi. Hielscher Ultrasonics tarjoaa erilaisia ultraääniratkaisuja yhden näytteen, useiden injektiopullojen sekä mikrotitterilevyjen ja 96-well-levyjen kätevään valmistukseen.

Elisa – Entsyymiin liittyvä immunosorbenttimääritys

ELISA tarkoittaa entsyymisidonnaista immunosorbenttimääritystä ja on laajalti käytetty biokemiallinen analyysitekniikka ligandeja sitovien määritysten luokassa. ELISA:ssa nestemäinen näyte lisätään kiinteään kiinteään faaviin, jolla on erityisiä sidontaominaisuuksia. Tavallisesti kiinteä faasi levitetään päällysteenä pohjalevylle tai ELISA-levylle. Sitten erilaisia nestemäisiä reagenssit lisätään, inkuboidaan ja pestään peräkkäin niin, että lopulta kukon lopullisessa nesteessä tapahtuu optinen muutos (esim. värin kehitys entsymaattisen reaktion tuotteella). Optisen muutoksen avulla voidaan mitata analyytin määrä niin sanotulla määrällisessä “lukeminen". Kvantitatiivista lukemaa varten käytetään spektrofotometriä, fluorometriä tai luminometriä välittyneen valon voimakkuuden havaitsemiseen ja mittaamiseen. Havaitsemisen herkkyyteen vaikuttaa signaalin vahvistuminen analyyttisten reaktioiden aikana. Koska entsyymireaktiot ovat hyvin tutkittuja ja luotettavia vahvistusprosesseja, signaalin luomiseen käytetään entsyymejä. Entsyymit ovat kiinteissä mittasuhteissa yhteydessä toteamisreagenssiin tarkan kvantifioimisen mahdollistamiseksi, mikä selittää myös nimen "entsyymisidentifioitu" immunosorbenttimääritys.
Koska ELISA-määritykset suoritetaan mikrotitterilevyissä / 96-well-levyissä, sitä kutsutaan levypohjaiseksi määritystekniikaksi ja sitä käytetään esimerkiksi kliinisessä in vitro -diagnostiikassa, tutkimuksessa, lääkekehityksessä jne.
ELISA-tekniikkaa käytetään usein diagnostiikkavälineenä lääketieteessä, biotekniikassa, kasvipatologiassa, ja se on myös tärkeä laadunvalvontamittaus useilla toimialoilla.

Täydellinen VialTweeterin asennus: VialTweeter sonotrode ultraääniprosessorilla UP200St

Ultraääninäytteen valmisteluyksikkö VialTweeter käytetään solulyysiin ja proteiinin uuttamiseen ennen ELISA-määritystä

Informaatio pyyntö




Huomaa, että Tietosuojakäytäntö.


Ultraääninäytteen valmistelu ennen ELISA:ta

Ennen elisa-määritystä näytteet edellyttävät valmisteluvaiheita, kuten solulyysiä ja solunsisäisten proteiinien, DNA:n, RNA:n jne. Ultraäänisolulyysin ja proteiinieristyksen etuna on sen korkea hyötysuhde, luotettavuus ja uusittavuus. Kaikki nämä tekijät ovat tärkeitä laadukkaan diagnostiikan ja tutkimustulosten saamiseksi

Ultraäänilyysin edut ennen ELISA:ta

  • Homogeeninen näytekäsittely
  • Täydellinen lyysi
  • Täydellinen proteiiniuutto (esim. vasta-aineet, DNA)
  • Optimaalinen mukautuminen solutyyppiin
  • Minkä tahansa näytteen koon osalta
  • toistettavissa
  • Lämpötilan mukaan
  • Automaattinen tietojen protokolla SD-kortilla

Pre-ELISA-ultraäänisolulyysiprotokolla

Probe-tyyppinen insonifioija UP200St lyysiä varten

  • Soluviljelmissä: Ennen ultraäänisolulyysiä sentrifugoi soluja 5 minuuttia 270 x g mikrokeskimetrissä. Poista supernatantti aspiraatiolla ja sekoitetaan solut uudelleen 30–100 μl:ssa RIPA-puskuria. Inkuboi sitten solupellettiä jäällä 30 minuuttia.
  • Solunäyte on valmis ultraäänilyysiin.
    Käytä anturityyppistä ultraäänilaitetta (esim. Uf200 ः t S26d2-anturilla) tai ultraääni moninäytelaitteella (esim. VialTweeter enintään 10 injektiopullon samanaikaiseen sonikaatioon tai UIP400MPT mikrotiter-levyille / 96-well-levyille) riippuen siitä, kuinka paljon näytteitä sinun on valmisteltava.
    Yksittäisen näytteen anturityyppistä sonikaatiota varten solut on sijoiteta 1,5 ml:n mikrosentrifugeputkiin.
  • Aseta ultraääniaika, kokonaisenergiansyöttö, pyöräilytila ja/tai lämpötilarajat ultraäänilaitteen digitaaliseen valikkoon. Tämä takaa erittäin luotettavan sonikoinnin ja toistettavuuden.
  • Käynnistä sonotrode ja kytke ultraäänilaite päälle. Siirrä ultraäänianturin mikrokärki varovasti näytteen läpi, jotta näyte sonitsaan tasaisesti.
    Useimmissa soluissa ultraäänilyysi suoritetaan 2 -4 syklin kuluttua 10 sekunnin sonikaatiosta.
  • Sonikoinnin jälkeen poista sonotrode näytteestä. Näytteet on inkuboitu jäällä 5 min. Sentrifugoi sitten 10 000 x g:ssa 20 minuutin jätteitä. Siirrä supernatantit uuteen mikrosentrifugeputkeen. Merkitse analyytit ja säilytä -20 °C:ssa.
  • Ultraäänisonotrodi voidaan puhdistaa pyyhkimällä se kunnolla alkoholilla tai sonikaatti alkoholilla täytetyssä sekoitin, esimerkiksi 70% etanolilla. Kaikki titaanista tehdyt ultraäänianturit ovat autoklaavable.

Kudosten homogenaatit:

  • Huuhtele kudos jääkylmällä PBS: llä (0, 01M, pH=7, 4) ylimääräisen hemolyysiveren poistamiseksi perusteellisesti.
  • Punnitse kudos (munuainen, sydän, keuhko, perna jne.) ja maseroi se pieniksi paloiksi, jotka homogenoidaan PBS: llä. Tarvittava pbs-tilavuus liittyy kudoksen painoon. Nyrkkisääntönä on, että 1 g kudosta vaatii n. 9mL PBS. On suositeltavaa lisätä joitakin proteaasinestäjiä PBS: ään. (Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää proteaasia ja fosfataasin estäjäcocktailia sisältävää ripa- tai hypotonista lyysipuskuria.)
  • Kudoksen koosta riippuen lyhyt pyörrehoito (n. 1-2 min. 15 sekunnissa) voi auttaa kudoksen esikäsittelyssä.
  • Asenna mikrokärki, esimerkiksi S26d2, ultraääniaineeesi. Aseta näyteputki kudoksen kanssa jääkylpyyn.
  • Sonikaa näyte ultraääniaineella, esimerkiksi UP200St (80% amplitudi) 1 minuutin ajan pulssitilassa (15 sekuntia päällä, 15 sekunnin tauko). Pidä näyte jääkylvyssä.
  • Tämän jälkeen homogenaatit sentrifugoidaan tiettyjen poolien (sytosoli-, ydin-, mitokondrioiden tai lysosomaalien) saamiseksi proteiinin rikastamiseksi analyysia varten. Sentrifugoimalla näytettä 5 minuutin ajan 5000×g:ssä, supernatantti noudetaan.
Sonotrode MTP-24-8-96:ssa on kahdeksan ultraäänianturia mikrotitterilevyjen kaivojen sonikaatioon.

Sonotrode MTP-24-8-96:ssa on kahdeksan ultraäänianturia mikrotitterilevyjen kaivojen sonikaatioon.

Luotettava lämpötilan säätö sonikoinnin aikana

Lämpötila on ratkaiseva prosessiin vaikuttava tekijä, joka on erityisen tärkeä biologisten näytteiden hoidossa, esimerkiksi proteiinien lämpöhajoamisen estämisessä. Kuten kaikki mekaaniset näytteenvalmistustekniikat, sonikaatio luo lämpöä. Näytteiden lämpötilaa voidaan kuitenkin hallita hyvin Hielscher Ultrasonics -laitteita käytettäessä. Esittelemme sinulle erilaisia vaihtoehtoja näytteiden lämpötilan seuraamiseksi ja ohjaamiseksi samalla, kun valmistelet niitä anturityyppisellä ultraääniaattorilla tai VialTweeter-esianalysaattorilla.

  1. Näytteen lämpötilan seuranta: Kaikki Hielscherin digitaaliset ultraääniprosessorit on varustettu älykkäällä ohjelmistolla ja kytkettävällä lämpötila-anturilla. Liitä lämpötila-anturi ultraäänilaitteeseen (esim. Uf200 ः t, UP200St, VialTweeter, UIP400MTP) ja aseta lämpötila-anturin kärki yhteen näyteputkista. Digitaalisen värillisen kosketusnäytön avulla voit asettaa ultraääniprosessorin valikkoon tietyn lämpötila-alueen näytteen sonikaatiota varten. Ultraäänilaite pysähtyy automaattisesti, kun enimmäislämpötila on saavutettu, ja pysähtyy, kunnes näytteen lämpötila laskee asetettuun lämpötilaan ∆. Sitten sonikaatio alkaa automaattisesti uudelleen. Tämä älykäs ominaisuus estää lämmön aiheuttaman hajoamisen.
  2. Ultraääni moninäyteyksikön VialTweeterin osalta näyteputkia pitelevä titaanilohko voidaan esijäähdytettyä. Laita VialTweeter-lohko (vain sonotrode ilman anturia!) jääkaappiin tai pakastimeen esijäähdyttääkseen titaanilohkon, mikä auttaa lykkäämään näytteen lämpötilan nousua. Jos mahdollista, myös itse näyte voidaan esijäähdytyä.
  3. Jäähdytä sonikoinnin aikana jääkylvyllä tai kuivajäällä. Aseta näyteputket sonikoinnin aikana jääkylpyyn. Käytä VialTweeter- pullossa matalaa lokeroa, joka on täytetty kuivalla jäällä, ja aseta VialTweeter kuivalle jäälle, jotta lämpö haihtuu nopeasti.

Asiakkaat ympäri maailmaa käyttävät Hielscher-anturi-ultraääniainteja sekä moninäyteisiä sonikaatioyksiköitä VialTweeter ja UIP400MTP päivittäiseen näytteenvalmistustyöhönsä biologisissa, biokemiallisissa, lääketieteellisissä ja kliinisissä laboratorioissa. Hielscher-prosessoritivien älykäs ohjelmisto ja lämpötilan säätö, lämpötila on luotettavasti ohjattu ja lämmön aiheuttama näytteen hajoaminen vältetään. Ultraääninäytteiden valmistelu Hielscher-ultraääniratkaisuilla tuottaa erittäin luotettavia ja toistettavissa olevia tuloksia!

Ota meihin yhteyttä! / Kysy meiltä!

Kysy lisä tietoja

Käytä alla olevaa lomaketta pyytääksesi lisätietoja ultraääniprosessoreista, sovelluksista ja hinnasta. Olemme iloisia voidessamme keskustella prosessista kanssasi ja tarjota sinulle ultraäänijärjestelmä, joka täyttää vaatimuksesi!









Huomaathan, että Tietosuojakäytäntö.


Ultrasonic high-shear homogenizers are used in lab, bench-top, pilot and industrial processing.

Hielscher Ultrasonics valmistaa korkean suorituskyvyn ultraäänihomygenisoijia sovellusten sekoittamiseen, dispersiointiin, emulgointiin ja uuttamiseen laboratoriossa, pilotissa ja teollisessa mittakaavassa.

Kirjallisuus / Referenssit



Tosiasiat, jotka kannattaa tietää

ELISA-tyypit

ELISA-tyyppejä on useita, jotka erottuvat toimivasta periaatteestaan. Ne tunnetaan nimellä suora ELISA, epäsuora ELISA, sandwich ELISA, kilpailukykyinen ELISA ja käänteinen ELISA. Alla esittelemme sinulle yleiskatsauksen eri ELISA-tyypeistä ja niiden pääominaisuuksista ja eroista.
ELISA voidaan suorittaa laadullisissa tai määrällisissä muodoissa. Laadulliset tulokset antavat yksinkertaisen positiivisen tai negatiivisen tuloksen, kun taas määrällisessä ELISA:ssa näytteen optista tiheyttä (OD) verrataan standardikäyrään, joka on tyypillisesti kohdemolekyylin tunnetun pitoisuusliuoksen sarjalaimennus.

Suora ELISA

Suora ELISA on Elisan yksinkertaisin määritysmuoto, jossa käytetään vain entsyymillä merkittyä primaarista vasta- ainetta eikä sekundaarisia vasta- aineita tarvita. Entsyymillä merkitty ensisijainen vasta-aine sitoutuu suoraan kohteeseen eli antigeeniin. Puskuroitu antigeeniliuos lisätään mikrotitterilevyn jokaiseen kuttiin (yleensä 96-metrilevyt, ELISA-levyt), jossa se tarttuu muovipintaan latausvuorovaikutuksilla. Kun primaariseen vasta-aineeseen liittyvä entsyymi reagoi substraattinsa kanssa, se tuottaa näkyvän signaalin, joka voidaan mitata spektrofotometrin, fluorometrin tai luminometrin avulla.

Epäsuora ELISA

Epäsuorassa ELISA-testissä tarvitaan sekä primaarista vasta-ainetta että sekundaarista vasta-ainetta. Toisin kuin suorassa ELISA: ssa, ei primaarivasta- aine, vaan sekundaarinen vasta- aine on merkitty entsyymillä. Antigeeni on immobilisoitu well plateen ja sidottu ensisijaiseen vasta-aineella. Tämän jälkeen entsyymillä merkitty sekundaarinen vasta- aine sitoutuu ensisijaiseen vasta- aineeseen. Sekundaarivasta-ainettan liittyvä entsyymi reagoi substraatillaan tuottamaan näkyvän signaalin, joka voidaan havaita.

Voileipä ELISA

Suorissa ja epäsuorissa ELISA-testeissä antigeeni on immobilisoitu ja päällystetty well platen pintaan, elisa-voileivässä vasta-aine on immobilisoitu ELISA-levyn muovipinnalle. Elisa-voileivän immobilisoituja vasta-aineita kutsutaan talteenottovasta-aineilla. Talteenottovasta-aineiden lisäksi elisa-voileivässä tarvitaan myös niin sanottuja toteamisvasta-aineita. Detection-vasta-aineita ovat merkitsemätön primaarinen toteamisvasta-aine ja entsyymillä merkitty sekundaarinen toteamisvasta-aine.
Vaiheittain kiinnostava antigeeni sitoutuu levyyn immobilisoituun talteenottovasta-aineeseen. Sitten ensisijainen toteamisvasta-aine sitoutuu antigeeniin. Sen jälkeen toissijainen toteamisvasta-aine sitoutuu ensisijaiseen toteamisvasta-ainettan. Viimeisessä reaktiovaiheessa entsyymi reagoi substraattinsa kanssa tuottamaan näkyvän signaalin, joka voidaan havaita optisesti.

Kilpailukykyinen ELISA

Kilpailukykyinen ELISA, joka tunnetaan myös nimellä inhibitio ELISA, on monimutkaisin ELISA- tyyppi, koska siihen liittyy inhibiittoriantigeenin käyttö. Jokainen kolmesta muodosta, suora, epäsuora ja voileipä ELISA, voidaan mukauttaa kilpailukykyiseen ELISA-muotoon. Kilpaillussa ELISA: ssa inhibiittori- antigeeni ja kiinnostava antigeeni kilpailevat sitoutumista ensisijaiseen vasta- ainettan.
Kilpailukykyisen ELISAn osalta ei-merkittyä vasta-ainetta inkuboidaan sen antigeenin eli näytteen läsnäollessa. Nämä sidotut vasta-aine-/antigeenikompleksit lisätään sitten antigeenipäällysteisiin hyvin.
Levy pestään niin, että sidotut vasta-aineet poistetaan. Kilpailukykyisellä ELISA:lla on nimensä, koska mitä enemmän antigeenia on näytteessä, sitä enemmän muodostuu antigeeni-vasta-ainekonsenteuksia. Tämä tarkoittaa, että wellissä on vähemmän sitoutumattomia vasta-aineita, jotka sitoutuvat antigeeniin, ja antigeenien on kilpailtava saatavilla olevasta vasta-aineista. Lisätään sekundaarinen vasta-aine, joka vastaa ensisijaista vasta-ainetta. Tämä toinen vasta- aine on yhteydessä entsyymiin. Kun substraatti lisätään, jäljellä olevat entsyymit tuottavat kromogeenisen tai fluoresoivan signaalin.
Tässä vaiheessa reaktio pysäytetään signaalin kyllästymisen välttämiseksi.
Jotkin kilpailukykyiset ELISA- sarjat sisältävät entsyymisidisen antigeenin entsyymiin liittyvän vasta- aineen sijaan. Merkitty antigeeni kilpailee primaarivasta-aineiden sitoutumiskohteista näyteanageenin (merkitsemätön) kanssa. Mitä vähemmän antigeeniä näytteessä, sitä enemmän merkittyä antigeenia säilyy 100 000 näytteessä ja sitä vahvempi signaali on.

Käänteinen ELISA

Käänteinen ELISA ei käytä hyvin levyjä, vaan jättää antigeenit ripustettuna testinesteeseen. Käänteinen ELISA-testi mittaa antigeenin kautta sidotun vasta- aineen määrän. Se kehitettiin erityisesti Länsi-Niilin viruksen kirjekuoriproteiinin havaitsemiseksi ja tutkimiseksi ja sen löytämiseksi viruskohtaisia vasta-aineita.

ENTsymaattinen merkki, jota käytetään ELISA:ssa

Alla olevassa luettelossa annetaan yleisimmät ELISA-määrityksissä käytetyt entsymaattiset markit, joiden avulla määrityksen tulokset voidaan mitata valmistuttuaan.

  • OPD (o-fenyleenidiamiinidihydrokloridi) muuttuu meripihkaksi havaitsemaan HRP:n (Piparjuuri peroksidaasi), jota käytetään usein konjugaattiproteiinina.
  • TMB (3,3′,5,5′-tetrametyylibentsidiini) muuttuu siniseksi hrp:tä havaitessaan ja muuttuu keltaiseksi rikki- tai fosforihapon lisäyksen jälkeen.
  • ABTS (2,2′-Azinobis [3-ethylbentsotatsoli-6-sulfonihappo]-diammoniumsuola) muuttuu vihreäksi hrp:tä havaitessaan.
  • PNPP (p-nitrofenyylifosfaatti, disodiumsuola) muuttuu keltaiseksi havaitessaan emäksistä fosfataasia.