Näytteiden valmistelu ultraäänellä ELISA-määrityksiä varten

ELISA-määritysten kaltaisia määrityksiä käytetään laajalti in vitro -diagnostiikassa, sairauksiin liittyvien proteiinien havaitsemisessa ja laadunvalvonnassa (esim. elintarvikeallergeenien seurannassa). Näytteiden valmistelu ultraäänellä on nopea, luotettava ja toistettava menetelmä solujen hajottamiseen ja solunsisäisten proteiinien, DNA:n, RNA:n ja soluelinten eristämiseen. Hielscher Ultrasonics tarjoaa erilaisia ultraääniratkaisuja yksittäisten näytteiden, useiden näytepullojen sekä mikrotiitterilevyjen ja 96-kuoppalevyjen vaivattomaan valmisteluun.

ELISA – entsyymivälitteinen immunosorbenttimääritys

ELISA on lyhenne englanninkielisestä ilmauksesta enzyme-linked immunosorbent assay eli entsyymivälitteinen immunosorbenttimääritys. Se on laajalti käytetty biokemiallinen analyysimenetelmä, joka kuuluu ligandien sitoutumiseen perustuviin määrityksiin. ELISA-määrityksessä nestemäinen näyte lisätään paikallaan pysyvän kiinteän faasin päälle, jolla on erityisiä sitoutumisominaisuuksia. Tavallisesti kiinteä faasi muodostaa kuoppalevyn tai ELISA-levyn pinnoitteen. Tämän jälkeen erilaisia nestemäisiä reagensseja lisätään peräkkäin, inkuboidaan ja pestään, jolloin kuoppaan lopuksi jäävässä nesteessä tapahtuu optinen muutos (esim. entsymaattisen reaktion tuotteen aiheuttama värin muodostuminen). Optisen muutoksen avulla analyytin määrä voidaan mitata niin sanotulla kvantitatiivisella ”lukemalla”. Kvantitatiivisen lukeman saamiseksi käytetään spektrofotometriä, fluorometriä tai luminometriä läpäisseen valon voimakkuuden havaitsemiseen ja mittaamiseen. Havaitsemisherkkyyteen vaikuttaa signaalin vahvistuminen analyysireaktioiden aikana. Koska entsyymireaktiot ovat hyvin tutkittuja ja luotettavia vahvistusprosesseja, signaalin tuottamiseen käytetään entsyymejä. Entsyymit liitetään havaitsemisreagensseihin kiinteissä suhteissa tarkan kvantifioinnin mahdollistamiseksi, mikä selittää myös immunosorbenttimäärityksen englanninkielisen nimen osan ”enzyme-linked” eli entsyymiin liitetty.
Koska ELISA-määritykset tehdään mikrotiitterilevyillä / 96-kuoppalevyillä, menetelmä tunnetaan levypohjaisena määritysmenetelmänä. Sitä käytetään esimerkiksi kliinisessä in vitro -diagnostiikassa, tutkimuksessa ja lääkekehityksessä vasta-aineiden, peptidien, proteiinien ja hormonien havaitsemiseen ja kvantifiointiin.
ELISA-menetelmää käytetään usein diagnostisena työkaluna lääketieteessä, biotekniikassa ja kasvipatologiassa, ja se on myös tärkeä laadunvalvonnan mittausmenetelmä useilla teollisuudenaloilla.

Näytteiden valmistelu ultraäänellä ennen ELISA-määritystä

Ennen kuin ELISA-määritys voidaan tehdä, näytteet on valmisteltava esimerkiksi hajottamalla solut ja uuttamalla solunsisäiset proteiinit, DNA, RNA jne. Ultraäänellä tehtävän solujen hajotuksen ja proteiinien eristämisen etuja ovat suuri tehokkuus, luotettavuus ja toistettavuus. Kaikki nämä tekijät ovat tärkeitä laadukkaiden diagnostisten tulosten ja tutkimustulosten saamiseksi

Menettelyohje solujen hajottamiseen ultraäänellä ennen ELISA-määritystä

• Soluviljelmille: Ennen solujen hajottamista ultraäänellä sentrifugoi soluja 5 min ajan voimalla 270 x g mikrosentrifugissa. Poista supernatantti imemällä ja suspendoi solut uudelleen 30–100 μL:aan RIPA-puskuria. Inkuboi sitten solupellettiä jäillä 30 min ajan.
• Solunäyte on nyt valmis hajotettavaksi ultraäänellä:
  Käytä sondityyppistä ultraäänilaitetta (esim. UP200Ht S26d2-sondilla) tai usean näytteen ultraäänilaitetta (esim. VialTweeter enintään 10 näytepullon samanaikaiseen ultraäänikäsittelyyn tai UIP400MPT mikrotiitterilevyille / 96-kuoppalevyille) valmisteltavien näytteiden määrästä riippuen.
  Kun käsittelet yksittäistä näytettä sondityyppisellä ultraäänilaitteella, sijoita solut 1,5 mL:n mikrosentrifugiputkiin.
• Aseta etukäteen ultraäänikäsittelyn kesto, kokonaisenergiasyöttö, jaksotustila ja/tai lämpötilarajat ultraäänilaitteen digitaalisessa valikossa. Tämä varmistaa erittäin luotettavan ja toistettavan ultraäänikäsittelyn.
• Aseta sonotrodi näytteeseen ja käynnistä ultraäänilaite. Liikuta ultraäänisondin mikrokärkeä varovasti näytteen läpi, jotta ultraäänikäsittely kohdistuu näytteeseen tasaisesti.
  Useimpien solujen hajotus ultraäänellä on valmis 2–4 käsittelyjakson jälkeen, kun kukin ultraäänikäsittelyjakso kestää 10 s.
• Poista sonotrodi näytteestä ultraäänikäsittelyn jälkeen. Näytteitä tulee inkuboida jäillä 5 min ajan. Sentrifugoi sitten voimalla 10 000 x g 20 min ajan, jotta solujäte muodostaa pelletin. Siirrä supernatantit uuteen mikrosentrifugiputkeen. Merkitse analyytit ja säilytä lämpötilassa -20°C.
• Ultraäänisonotrodi voidaan puhdistaa pyyhkimällä se huolellisesti alkoholilla tai käsittelemällä sitä ultraäänellä alkoholia, esim. 70% etanolia, sisältävässä dekantterilasissa. Kaikki titaanista valmistetut ultraäänisondit voidaan autoklavoida.

• Huuhtele kudos jääkylmällä PBS:llä (0,01M, pH=7,4), jotta ylimääräinen hemolysoitunut veri poistuu huolellisesti.
• Punnitse kudos (munuainen, sydän, keuhko, perna jne.) ja hienonna se pieniksi paloiksi, jotka homogenoidaan PBS:ssä. Tarvittava PBS:n tilavuus riippuu kudoksen massasta. Nyrkkisääntönä 1g kudosta tarvitsee noin 9mL PBS:ää. PBS:ään on suositeltavaa lisätä jonkin verran proteaasi-inhibiittoria. (Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää RIPA-puskuria tai hypotonista hajotuspuskuria, joka sisältää proteaasi- ja fosfataasi-inhibiittorien seoksen.)
• Kudoksen koosta riippuen lyhyt vorteksikäsittely (noin 1–2 min 15 s pulsseina) voi olla hyödyllinen kudoksen esikäsittelyssä.
• Asenna ultraäänilaitteeseen mikrokärki, esim. S26d2. Aseta kudosta sisältävä näyteputki jäähauteeseen.
• Käsittele näytettä ultraäänilaitteella, esim. UP200St (80% amplitudi), 1 min ajan pulssitilassa (15s päällä, 15s tauko). Pidä näyte jäähauteessa.
• Homogenaatit sentrifugoidaan tämän jälkeen tiettyjen fraktioiden (sytosolisen, tuma-, mitokondrio- tai lysosomifraktion) saamiseksi ja proteiinin rikastamiseksi analyysiä varten. Supernatantti saadaan sentrifugoimalla näytettä 5 minuutin ajan voimalla 5 000×g.

Luotettava lämpötilan säätö ultraäänikäsittelyn aikana

Lämpötila on keskeinen prosessiin vaikuttava tekijä, joka on erityisen tärkeä biologisten näytteiden käsittelyssä esimerkiksi proteiinien lämpöhajoamisen estämiseksi. Kaikkien mekaanisten näytteenvalmistelumenetelmien tavoin ultraäänikäsittely tuottaa lämpöä. Näytteiden lämpötilaa voidaan kuitenkin säädellä hyvin Hielscher Ultrasonics -laitteilla. Esittelemme erilaisia vaihtoehtoja näytteiden lämpötilan seurantaan ja säätöön, kun näytteitä valmistellaan ennen analyysiä sondityyppisellä ultraäänilaitteella tai ultraäänilaitteella VialTweeter.

1. Näytteen lämpötilan seuranta: Kaikissa Hielscherin digitaalisissa ultraääniprosessoreissa on älykäs ohjelmisto ja liitettävä lämpötila-anturi. Liitä lämpötila-anturi ultraäänilaitteeseen (esim. UP200Ht, UP200St, VialTweeter, monikuoppalevyjen ultraäänikäsittelylaite UIP400MTP) ja aseta lämpötila-anturin kärki yhteen näyteputkista. Digitaalisen värikosketusnäytön avulla voit asettaa ultraääniprosessorin valikossa tietyn lämpötila-alueen näytteen ultraäänikäsittelylle. Ultraäänilaite pysähtyy automaattisesti, kun enimmäislämpötila saavutetaan, ja pysyy tauolla, kunnes näytteen lämpötila on laskenut asetetun lämpötila-alueen ∆ alempaan arvoon. Tämän jälkeen ultraäänikäsittely käynnistyy automaattisesti uudelleen. Tämä älykäs toiminto estää lämmön aiheuttaman hajoamisen.
2. Usean näytteen ultraäänikäsittelylaitteen VialTweeter titaanilohko, joka pitää näyteputket paikallaan, voidaan esijäähdyttää. Aseta laitteen VialTweeter lohko (vain sonotrodi ilman ultraäänimuunninta!) jääkaappiin tai pakastimeen. Titaanilohkon esijäähdytys auttaa viivästyttämään näytteen lämpötilan nousua. Jos mahdollista, myös itse näyte voidaan esijäähdyttää.
3. Käytä jäähaudetta tai kuivajäätä jäähdytykseen ultraäänikäsittelyn aikana. Aseta näyteputki tai näyteputket jäähauteeseen ultraäänikäsittelyn ajaksi. Käytä laitteelle VialTweeter matalaa kuivajäällä täytettyä astiaa ja aseta VialTweeter kuivajään päälle, jotta lämpö pääsee poistumaan nopeasti.

Asiakkaat eri puolilla maailmaa käyttävät Hielscherin sondityyppisiä ultraäänilaitteita sekä usean näytteen ultraäänikäsittelylaitteita VialTweeter ja UIP400MTP päivittäisessä näytteenvalmistelussa biologisissa, biokemiallisissa, lääketieteellisissä ja kliinisissä laboratorioissa. Hielscherin prosessorien älykkään ohjelmiston ja lämpötilan säädön ansiosta lämpötilaa hallitaan luotettavasti ja lämmön aiheuttama näytteiden hajoaminen vältetään. Näytteiden valmistelu Hielscherin ultraääniratkaisuilla tuottaa erittäin luotettavia ja toistettavia tuloksia!
Lue lisää suuren näytteiden käsittelykapasiteetin ultraäänikäsittelystä määrityksiä varten monikuoppalevyjen ultraäänikäsittelylaitteella UIP400MTP!