BL21-solujen lyysi ultraäänikäsittelyllä

BL21-solut ovat E. coli -kanta, jota käytetään laajalti tutkimuslaboratorioissa, bioteknologiassa ja teollisessa tuotannossa, koska ne pystyvät ilmentämään proteiineja erittäin tehokkaasti. Ultraäänellä tehtävä solujen hajotus, lyysi ja proteiinien uutto on yleinen menetelmä kohdeproteiinien eristämiseen ja talteenottoon BL21-solujen sisältä. Ultraäänikäsittely hajottaa solun kokonaan ja vapauttaa kaikki sen sisään jääneet proteiinit, jolloin 100% proteiinista saadaan käyttöön.

BL21-solut proteiinien ilmentämisessä

BL21 on kemiallisesti kompetentti E. coli -bakteerikanta, joka soveltuu transformaatioon ja voimakkaaseen proteiinien ilmentämiseen T7-RNA-polymeraasi–IPTG-induktiojärjestelmällä. BL21-solut mahdollistavat minkä tahansa T7-promoottorin ohjaaman geenin erittäin tehokkaan proteiini-ilmentymisen. E. coli -kanta BL21(DE3) on T7-RNA-polymeraasiin perustuva proteiinintuotantokanta, jota käytetään yhdessä T7-promoottoriin perustuvien ilmentämisvektorien kanssa. Sitä käytetään laajalti laboratorioissa ja teollisuudessa rekombinanttiproteiinien tuotantoon. BL21(DE3)-kannassa rekombinanttiproteiinia koodaavan geenin ilmentymisen transkriboi kromosomissa koodattu T7-RNA-polymeraasi (T7 RNAP), joka transkriboi kahdeksan kertaa nopeammin kuin tavanomainen E. coli -bakteerin RNAP. Tämä tekee BL21(DE3)-kannasta erittäin tehokkaan ja yhden suosituimmista proteiinien ilmentämiseen käytettävistä solujärjestelmistä.

BL21-solujen ultraäänilyysin ja proteiinien uuton protokolla

BL21-solujen lyysi suoritetaan useimmiten ultraäänikäsittelyllä käyttäen samalla lyysipuskurina natriumlauroyylisarkosinaattia (tunnetaan myös nimellä sarkosyyli). Ultraäänellä tehtävän solujen hajotuksen ja proteiinien uuton etuja ovat luotettavuus, toistettavuus sekä ultraäänilaitteiden yksinkertainen, turvallinen ja nopea käyttö. Alla oleva protokolla antaa vaiheittaiset ohjeet BL21-solujen ultraäänilyysiin:

• Kaperoniproteiinien poistamiseksi BL21-bakteeripelletit suspendoitiin uudelleen 50 ml:aan jääkylmää natrium-Tris-EDTA-puskuria (STE), jonka koostumus oli 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA ja 150 mM NaCl sekä lisättynä 100 mM PMSF.
• Sitten lisätään 500 ul lysotsyymiä (10 mg/ ml) ja soluja inkuboidaan jäällä 15 min.
• Tämän jälkeen lisätään 500 ul DTT:tä ja 7 ml sarkosyyliä (10% (w/v), valmistettu STE-puskuriin).
• Kaikki puhdistuspuskurit on ehdottomasti pidettävä jääkylminä ja näytteet koko ajan jäällä. Kaikki puhdistusvaiheet tulisi suorittaa kylmähuoneessa, jos mahdollista.



• Ultraäänilyysiä ja proteiinien uuttoa varten näytteet käsitellään ultraäänellä laitteella VialTweeter MultiSample Ultrasonicator 4 x 30 sekunnin ajan 100%:n amplitudilla ja 2 min:n tauolla jokaisen ultraäänikäsittelyn välillä. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää mikrotaivutuskärjellä varustettua anturityyppistä ultraäänihomogenisaattoria, esimerkiksi UP200Ht varustettuna S26d2-kärjellä (3 x 30 sekuntia, 2 min:n tauko ultraäänijaksojen välillä, 80%:n amplitudi).
• Seuraavia puhdistusvaiheita varten näytteet on pidettävä jäällä tai vaihtoehtoisesti säilytettävä -80°C:ssa jatkokäsittelyyn asti.

Ultraäänilyysi tarkassa lämpötilan hallinnassa

Tarkka ja luotettava lämpötilan hallinta on ratkaisevan tärkeää biologisia näytteitä käsiteltäessä. Korkeat lämpötilat käynnistävät näytteissä lämmön aiheuttaman proteiinien hajoamisen.
Kaikkien mekaanisten näytteiden valmistelumenetelmien tavoin ultraäänikäsittely tuottaa lämpöä. Näytteiden lämpötilaa voidaan kuitenkin hallita hyvin käyttämällä laitetta VialTweeter. Esittelemme erilaisia vaihtoehtoja näytteiden lämpötilan seurantaan ja hallintaan, kun valmistelet niitä analyysiä varten laitteilla VialTweeter ja VialPress.

1. Näytteen lämpötilan seuranta: Ultraääniprosessori UP200St, joka käyttää laitetta VialTweeter, on varustettu älykkäällä ohjelmistolla ja liitettävällä lämpötila-anturilla. Liitä lämpötila-anturi laitteeseen UP200St ja aseta lämpötila-anturin kärki yhteen näyteputkista. Digitaalisen värikosketusnäytön avulla voit asettaa laitteen UP200St valikossa tietyn lämpötila-alueen näytteesi ultraäänikäsittelyä varten. Ultraäänilaite pysähtyy automaattisesti, kun enimmäislämpötila saavutetaan, ja pitää tauon, kunnes näytteen lämpötila on laskenut asetetun lämpötilan ∆ alempaan arvoon. Tämän jälkeen ultraäänikäsittely käynnistyy jälleen automaattisesti. Tämä älykäs toiminto estää lämmön aiheuttaman hajoamisen.
2. Laitteen VialTweeter lohko voidaan esijäähdyttää. Aseta laitteen VialTweeter lohko (vain sonotrodi ilman muunninta!) jääkaappiin tai pakastimeen titaanilohkon esijäähdyttämiseksi, mikä auttaa viivästyttämään näytteen lämpötilan nousua. Jos mahdollista, myös itse näyte voidaan esijäähdyttää.
3. Käytä kuivajäätä jäähdytykseen ultraäänikäsittelyn aikana. Käytä matalaa, kuivajäällä täytettyä astiaa ja aseta VialTweeter jäälle, jotta lämpö pääsee poistumaan nopeasti.

Asiakkaat ympäri maailmaa käyttävät laitteita VialTweeter ja VialPress päivittäisessä näytteiden valmistelussa biologisissa, biokemiallisissa, lääketieteellisissä ja kliinisissä laboratorioissa. Prosessorin UP200St älykkään ohjelmiston ja lämpötilan hallinnan avulla lämpötilaa hallitaan luotettavasti ja lämmön aiheuttama näytteiden hajoaminen vältetään. Näytteiden valmistelu ultraäänellä käyttäen laitteita VialTweeter ja VialPress tuottaa erittäin luotettavia ja toistettavia tuloksia!
 

Löydä optimaalinen ultraäänellä toimiva solujen hajotuslaite lyysisovellukseesi

Hielscher Ultrasonics on pitkään alalla toiminut valmistaja, joka valmistaa tehokkaita ultraäänellä toimivia solujen hajotuslaitteita ja homogenisaattoreita laboratorioihin sekä pöytämittakaavan ja teollisen mittakaavan järjestelmiin. Bakteerisoluviljelmäsi koko, tutkimus- tai tuotantotavoitteesi sekä tunnissa tai päivässä käsiteltävien solujen tilavuus ovat olennaisia tekijöitä sopivan ultraäänellä toimivan solujen hajotuslaitteen löytämisessä sovellukseesi.
Hielscher Ultrasonics tarjoaa erilaisia ratkaisuja useiden näytteiden samanaikaiseen ultraäänikäsittelyyn (jopa 10 näytepulloa laitteella VialTweeter) ja suurten näytemäärien käsittelyyn (eli mikrotiitterilevyt / ELISA-levyt laitteella UIP400MTP). Valikoima ulottuu perinteisistä sondityyppisistä laboratorion ultraäänilaitteista, joiden tehot ovat 50–400 wattia, täysin teollisiin ultraääniprosessoreihin, joiden teho on jopa 16 000 wattia laitetta kohti ja jotka soveltuvat kaupalliseen solujen hajotukseen ja proteiinien uuttoon suurtuotannossa. Kaikki valmistajan Hielscher ultraäänilaitteet on rakennettu toimimaan 24/7/365 täydellä kuormalla. Kestävyys ja luotettavuus ovat ultraäänilaitteidemme keskeisiä ominaisuuksia.
Kaikki digitaaliset ultraäänihomogenisaattorit on varustettu älykkäällä ohjelmistolla, värikosketusnäytöllä ja automaattisella tietojen tallennuksella, jotka tekevät ultraäänilaitteesta kätevän työvälineen laboratorioissa ja tuotantolaitoksissa.
Kerro meille, minkä tyyppisiä soluja ja minkä tilavuuden biologisia näytteitä sinun on käsiteltävä, kuinka usein ja mihin tarkoitukseen. Suosittelemme prosessivaatimuksiisi parhaiten soveltuvaa ultraäänellä toimivaa solujen hajotuslaitetta.

Alla oleva taulukko antaa viitteitä ultraäänijärjestelmiemme likimääräisestä käsittelykapasiteetista kompakteista käsikäyttöisistä homogenisaattoreista ja usean näytteen ultraäänilaitteista kaupallisiin sovelluksiin tarkoitettuihin teollisiin ultraääniprosessoreihin:

Kirjallisuus / Lähteet

• Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
• LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
• Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
• Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.