BL21-solujen solulyysi ultraäänellä
BL21-solut ovat E. coli -kanta, jota käytetään laajalti tutkimuslaboratorioissa, biotekniikassa ja teollisessa tuotannossa, koska ne kykenevät ilmentämään proteiineja erittäin tehokkaasti. Ultraäänisolujen häiriöt, lyysi ja proteiiniuutto on yleinen menetelmä kohdennettujen proteiinien eristämiseksi ja keräämiseksi BL21-solujen solun sisäpuolelta. Ultrasonication häiritsee solua kokonaan ja vapauttaa kaikki loukkuun jääneet proteiinit, jolloin 100% proteiinista on saatavilla.
BL21-solut proteiinien ilmentymiseen
BL21-solu on kemiallisesti pätevä E. coli -bakteerikanta, joka soveltuu transformaatioon ja korkean tason proteiinien ilmentymiseen käyttämällä T7-RNA-polymeraasi-IPTG-induktiojärjestelmää. BL21-solut mahdollistavat minkä tahansa geenin tehokkaan proteiinin ilmentymisen, joka on T7-promoottorin hallinnassa. E. coli -kanta BL21 (DE3) on T7-RNA-polymeraasipohjainen proteiinituotantokanta yhdistettynä T7-promoottoripohjaisiin ilmentymisvektoreihin, ja sitä käytetään laajalti laboratorioissa ja teollisuudessa rekombinanttiproteiinien tuottamiseksi. BL21(DE3):ssa rekombinanttiproteiinia koodaavan geenin ilmentyminen transkriptoidaan kromosomikoodatulla T7-RNA-polymeraasilla (T7 RNAP), joka transkriptoi kahdeksan kertaa nopeammin kuin tavanomainen E. coli RNAP. Tämä tekee kannasta BL21(DE3) erittäin tehokkaan ja muuttaa sen yhdeksi suosituimmista proteiiniekspressiosolujärjestelmistä.
Protokolla ultraäänilyysille ja proteiinien uuttamiselle BL21-soluista
BL21-solujen solulyysi suoritetaan enimmäkseen käyttämällä ultrasonicationia yhdessä natriumlauroyylisarkosinaatin (tunnetaan myös nimellä sarkosyyli) kanssa lyysipuskurina. Ultraäänisolujen häiriöiden ja proteiinien uuttamisen edut ovat ultraäänilaitteiden luotettavuus, toistettavuus sekä yksinkertainen, turvallinen ja nopea toiminta. Alla oleva protokolla antaa vaiheittaisen suunnan ultraääni BL21-solulyysille:
- Chaperoniproteiinien poistamiseksi BL21-bakteeripelletit suspendoitiin uudelleen 50 ml: aan jääkylmää natrium-Tris-EDTA (STE) -puskuria (koostuu 10 mM Tris-HCL: stä, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl täydennettynä 100 mM PMSF: llä).
- Lisätään 500 ul lysotsyymiä (10 mg/ml) ja soluja inkuboidaan jäällä 15 minuutin ajan.
- Tämän jälkeen lisätään 500 ul DTT:tä ja 7 ml sarkosyyliä (10 % (w/v) STE-puskurissa).
- On tärkeää pitää kaikki puhdistuspuskurit jääkylminä ja pitää näytteet jäällä koko ajan. Kaikki puhdistusvaiheet on suoritettava kylmässä huoneessa, jos mahdollista.
- Ultraäänilyysiä ja proteiinien uuttamista varten näytteet sonikoidaan VialTweeter MultiSample ultraäänilaite 4 x 30 sekuntia 100%: n amplitudilla 2 minuutin välein jokaisen sonikoinnin välillä. Vaihtoehtoisesti koetintyyppinen ultraäänihomogenisaattori, jossa on mikrokärki, esim. UP200Ht S26d2: lla (3 x 30 sekuntia, 2 minuutin tauko ultraäänisyklien välillä, 80% amplitudi) voidaan käyttää.
- Lisäpuhdistusvaiheita varten näytteet on pidettävä jäällä tai vaihtoehtoisesti säilytettävä -80 °C:ssa jatkokäsittelyä varten.
Ultraäänisolujen häiritsijä UP200St mikrokärjellä S26d2 lyysiä ja proteiiniuuttoa varten
Ultraäänilyysi Prescise lämpötilan säädössä
Tarkka ja luotettava lämpötilan säätö on ratkaisevan tärkeää biologisia näytteitä käsiteltäessä. Korkeat lämpötilat käynnistävät termisesti indusoidun proteiinin hajoamisen näytteissä.
Kuten kaikki mekaaniset näytteenvalmistustekniikat, sonikaatio luo lämpöä. Näytteiden lämpötilaa voidaan kuitenkin hallita hyvin VialTweeteriä käytettäessä. Esittelemme sinulle erilaisia vaihtoehtoja näytteiden lämpötilan seuraamiseksi ja säätämiseksi valmistellessasi niitä VialTweeterillä ja VialPressillä analysointia varten.
- Näytteen lämpötilan seuranta: VialTweeteriä ohjaava ultraääniprosessori UP200St on varustettu älykkäällä ohjelmistolla ja kytkettävällä lämpötila-anturilla. Kytke lämpötila-anturi UP200St-laitteeseen ja aseta lämpötila-anturin kärki yhteen näyteputkista. Digitaalisen värillisen kosketusnäytön avulla voit asettaa UP200St: n valikossa tietyn lämpötila-alueen näytteen sonikaatiolle. Ultraäänilaite pysähtyy automaattisesti, kun maksimilämpötila saavutetaan, ja pysähtyy, kunnes näytteen lämpötila on laskenut asetetun lämpötilan ∆ alempaan arvoon. Sitten sonikaatio alkaa automaattisesti uudelleen. Tämä älykäs ominaisuus estää lämmön aiheuttaman hajoamisen.
- VialTweeter-lohko voidaan esijäähdyttää. Laita VialTweeter-lohko (vain sonotrode ilman anturia!) jääkaappiin tai pakastimeen titaanilohkon esijäähdyttämiseksi, mikä auttaa lykkäämään näytteen lämpötilan nousua. Jos mahdollista, myös itse näyte voidaan esijäähdyttää.
- Käytä kuivajäätä jäähtymään sonikoinnin aikana. Käytä matalaa tarjotinta, joka on täytetty kuivajäällä, ja aseta VialTweeter jäälle, jotta lämpö haihtuu nopeasti.
Asiakkaat ympäri maailmaa käyttävät VialTweeteriä ja VialPressiä päivittäiseen näytteenvalmistustyöhönsä biologisissa, biokemiallisissa, lääketieteellisissä ja kliinisissä laboratorioissa. UP200St-prosessorin älykäs ohjelmisto ja lämpötilan säätö, lämpötilaa ohjataan luotettavasti ja lämmön aiheuttamaa näytteen hajoamista vältetään. Ultraääninäytteen valmistus VialTweeterillä ja VialPressillä tuottaa erittäin luotettavia ja toistettavia tuloksia!
Löydä optimaalinen ultraäänihäiritsijä lyysisovelluksellesi
Hielscher Ultrasonics on pitkäaikainen kokenut korkean suorituskyvyn ultraäänisolujen häiritsijöiden ja homogenisaattoreiden valmistaja laboratorioihin, penkki- ja teollisen mittakaavan järjestelmiin. Bakteerisoluviljelmän koko, tutkimus- tai tuotantotavoitteesi ja prosessoitavan solun määrä tunnissa tai päivässä ovat olennaisia tekijöitä oikean ultraäänisolujen häiritsijän löytämiseksi sovellukseesi.
Hielscher Ultrasonics tarjoaa erilaisia ratkaisuja useiden näytteiden (enintään 10 injektiopulloa VialTweeter) ja massanäytteiden (eli mikrotitterilevyjen / ELISA-levyjen UIP400MTP) samanaikaiseen sonikointiin sekä klassiseen koetintyyppiseen laboratorioultraäänilaitteeseen, jolla on erilaiset tehotasot 50 - 400 wattia täysin teollisiin ultraääniprosessoreihin, joissa on jopa 16 000 wattia yksikköä kohti kaupallisten solujen häiriöihin ja proteiinien uuttamiseen suuressa tuotannossa. Kaikki Hielscher-ultraäänilaitteet on rakennettu 24/7/365 toimintaan täydellä kuormituksella. Kestävyys ja luotettavuus ovat ultraäänilaitteidemme keskeisiä ominaisuuksia.
Kaikki digitaaliset ultraäänihomogenisaattorit on varustettu älykkäällä ohjelmistolla, värillisellä kosketusnäytöllä ja automaattisella dataprotokollalla, mikä tekee ultraäänilaitteesta kätevän työvälineen laboratorio- ja tuotantolaitoksissa.
Kerro meille, millaisia soluja, mitä tilavuutta, millä taajuudella ja millä kohteella sinun on käsiteltävä biologisia näytteitäsi. Suosittelemme sinulle sopivinta ultraäänisolujen häiritsijää prosessivaatimuksiisi.
Alla oleva taulukko antaa sinulle viitteitä ultraäänijärjestelmiemme likimääräisestä käsittelykapasiteetista kompakteista kädessä pidettävistä homogenisaattoreista ja MultiSample Ultrasonicators teollisiin ultraääniprosessoreihin kaupallisiin sovelluksiin:
| Erän tilavuus | Virtausnopeus | Suositellut laitteet |
|---|---|---|
| 96-kuoppaiset / mikrotiitterilevyt | n.a. | UIP400MTP |
| 10 injektiopulloa à 0,5 - 1,5 ml | n.a. | VialTweeter UP200St: ssä |
| 0.01 - 250ml | 5 - 100 ml / min | UP50H |
| 0.01 - 500ml | 10 - 200 ml / min | UP100H |
| 10 - 2000ml | 20–400 ml/min | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 - 20L | 0.2–4 l/min | UIP2000hdT |
| 10-100L | 2 - 10L / min | UIP4000hdT |
| n.a. | 10-100L / min | UIP16000 |
| n.a. | suurempi | klusteri UIP16000 |
Ota yhteyttä! / Kysy meiltä!
UIP400MTP Plate Sonicator korkean suorituskyvyn kennohäiriöihin 96-kuoppalevyissä
ultraäänilaite UP200Ht 2 mm: n mikrokärjellä S26d2 pienten näytteiden sonikointiin
Lue lisää siitä, miten voit käyttää ultraäänikudoshomogenisaattoria puskuriliuosten tehokkaaseen ja luotettavaan valmistukseen!
Faktoja, jotka kannattaa tietää
Escherichia coli -bakteerit
Escherichia coli on bakteerityyppi, joka ei muodosta itiöitä, gramnegatiivinen ja jolle on tunnusomaista suoran sauvan muoto. E.coli-bakteereja esiintyy ihmisten ja eläinten ympäristössä, elintarvikkeissa ja suolistossa. E. coli on yleensä liikkuva käyttämällä peritrichous flagellaa, mutta on myös ei-liikkuvia tyyppejä. E. coli -bakteerit ovat niin sanottuja fakultatiivisesti anaerobisia kemoorganotrofisia organismeja, mikä tarkoittaa, että ne kykenevät sekä hengitysteiden että fermentatiiviseen aineenvaihduntaan. Useimmat E. coli -tyypit ovat hyvänlaatuisia ja niillä on hyödyllisiä tehtäviä kehossa, esim. haitallisten bakteerilajien kasvun tukahduttaminen, vitamiinien synteesi jne.
Niin sanotut B-tyypin Escherichia coli -bakteerisolut ovat erityinen E.coli-kantojen luokka, joita käytetään laajalti tutkimuksessa sellaisten mekanismien tutkimiseksi, kuten bakteriofagin herkkyys tai rajoitusmodifikaatiojärjestelmät. Lisäksi E. coli -bakteereja arvostetaan luotettavana työhevosena proteiinien ilmentymisessä biotekniikan ja biotieteiden laboratorioissa. Esimerkiksi E.colia käytetään yhdisteiden, kuten proteiinien ja oligosakkaridien, syntetisoimiseen teollisessa mittakaavassa. Erityisominaisuuksien, kuten proteaasipuutoksen, alhaisen asetaatin tuotannon korkealla glukoositasolla ja parantuneen läpäisevyyden vuoksi E. coli B -solut ovat hän yleisimmin käytetty isäntäsolut geneettisesti muokattujen proteiinien tuottamiseen.
Rekombinantti proteiini
Rekombinanttiproteiinit (rProt) ovat saamassa merkittävää merkitystä monilla aloilla, mukaan lukien kemian tuotanto, lääke-, kosmetiikka-, ihmis- ja eläinlääketiede, maatalous, elintarvike- ja jätteenkäsittelyteollisuus.
Rekombinanttiproteiinin tuotanto edellyttää ilmentymisjärjestelmän käyttöä. Solujärjestelmien ilmentymisenä rekombinantti-DNA: n tuottamiseksi voidaan käyttää sekä prokaryoottisia että eukaryoottisia soluja. Vaikka bakteerisoluja käytetään yleisimmin proteiinien ilmentymiseen sellaisten tekijöiden vuoksi kuin alhaiset kustannukset, helppo skaalautuvuus ja yksinkertaiset väliaineolosuhteet, nisäkkäät, hiiva, levät, hyönteiset ja soluttomat järjestelmät ovat vakiintuneita vaihtoehtoja. Proteiinityyppi, toiminnallinen aktiivisuus sekä ilmentyneen proteiinin vaadittu saanto vaikuttavat proteiinin ilmentymiseen käytetyn solujärjestelmän valintaan.
Rekombinanttiproteiinin ilmentämiseksi tietty solu on transfektoitava DNA-vektorilla, joka sisältää yhdistelmä-DNA: n mallin. Tämän jälkeen templaatilla transfektoidut solut viljellään. Solumekanismin seurauksena solut transkriptoivat ja kääntävät kiinnostavan proteiinin ja tuottavat siten kohdeproteiinin.
Koska ilmentyneet proteiinit ovat loukussa solumatriisissa, solu on lysoitava (hajotettava ja rikottava) proteiinien vapauttamiseksi. Seuraavassa puhdistusvaiheessa proteiini erotetaan ja puhdistetaan.
Ensimmäinen hoidossa käytetty rekombinanttiproteiini oli rekombinantti ihmisinsuliini vuonna 1982. Nykyään maailmanlaajuisesti tuotetaan yli 170 erilaista rekombinanttiproteiinia lääketieteellisiin hoitoihin. Lääketieteessä yleisesti käytettyjä rekombinanttiproteiineja ovat esimerkiksi rekombinanttihormonit, interferonit, interleukiinit, kasvutekijät, tuumorinekroositekijät, veren hyytymistekijät, trombolyyttiset lääkkeet ja entsyymit suurten sairauksien, kuten diabeteksen, kääpiöhoidon, sydäninfarktin, kongestiivisen sydämen vajaatoiminnan, aivoapopleksian, multippeliskleroosin, neutropenian, trombosytopenian, anemian, hepatiitin, nivelreuman, astman, Crohnin taudin ja syöpien hoidossa. (vrt. Phuc V. Pham, julkaisussa Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)
Kirjallisuus / Viitteet
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
VialTweeter Sonicator 10 näytteen samanaikaiseen sonikaatioon, esimerkiksi BL21-solujen häiritsemiseen
Korkean suorituskyvyn ultraääni! Hielscherin tuotevalikoima kattaa koko spektrin kompaktista laboratorion ultraäänilaitteesta penkkiyksiköiden yli täysteollisiin ultraäänijärjestelmiin.