E. colin ultraäänilyysi
- E. coli -bakteerit ovat yleisimmin käytettyjä bakteereja mikrobiologiassa ja biotekniikassa.
- Ultraäänisolujen häiritsijät tuottavat luotettavia ja toistettavia tuloksia E. colin lyysistä.
- Voimakkaat mutta tarkasti hallittavat kavitaatio- ja leikkausvoimat johtavat täydelliseen hajoamiseen ja suuriin uuttotuottoihin (esim. proteiinit, DNA).
Miksi E. colin ultraäänisolujen häiriöt ovat suositeltava menetelmä?
Ultraäänihomogenisaattorit tai koetintyyppiset ultraäänilaitteet tarjoavat useita etuja E. coli -lyysille, koska voimakas ultraääni häiritsee tehokkaasti soluseinämiä ja kalvoja. Koetintyyppisiä ultraäänilaitteita käytetään laajalti E. coli -lyysissä seuraavista syistä:
Proteiinien uuttaminen E. coli -soluista suoritetaan tehokkaasti ultraäänianturi UP200St
Koetintyyppinen ultraäänilaite tarjoaa monia etuja E. coli -lyysille. Ultraääniprosessiparametrien luotettava ja tarkka hallinta mahdollistaa toimintaparametrien, kuten tehon, keston ja näytteen käsittelyn, optimoinnin haluttujen tulosten saavuttamiseksi.
E. coli EDL933: n genomi-DNA: n elektroforeettiset analyysit, joille tehdään 0-15 minuutin ultrasonication. L osoittaa DNA-tikkaat.
(tutkimus ja kuva: ©Basselet et al. 2008)
Solujen häiriöt ultraäänikavitaatiolla
Ultraäänianturityyppiset homogenisaattorit toimivat noin 20 000 sykliä sekunnissa (20 kHz: ssä) ja aiheuttavat kavitaatiota nesteissä tai suspensioissa. Akustinen kavitaatiomikroskooppiset tyhjiömäisten paineiden ja korkeiden lämpötilojen alueet, jotka repivät soluja erilleen. Vaikka lämpötilat voivat nousta useisiin tuhansiin celsiusasteisiin, kavitaatiomäärät ovat niin pieniä, että ne eivät lämmitä prosessia merkittävästi. Ultraäänellä tuotetut akustiset kavitaatio- ja leikkausvoimat rei'ittävät tai rikkovat bakteerisolujen, kuten E.colin, solukalvon. Hielscher-ultraäänilaitteet mahdollistavat prosessiparametrien, kuten ultraääni-intensiteetin, amplitudin, energian syötön ja lämpötilan, tarkan hallinnan. Siten ultraäänilyysiprosessi voidaan säätää optimaalisesti solutyypin, soluviljelmän ja prosessin tavoitteen mukaan.
- tarkka lyysin hallinta (intensiteetti, amplitudi, lämpötila)
- luotettavat, toistettavat tulokset
- optimaalinen mukautuminen tiettyihin näytteisiin
- Lämpötilan säätö
- hyvin pienille ja erittäin suurille näytteille (μl:stä litroihin)
- Puhtaasti mekaaninen käsittely
- käyttäjäystävällinen, turvallinen käyttö
- Lineaarinen skaalaus laboratoriosta tuotantoon
VialTweeter ultraäänilyysiin
Ultraäänihomogenisaattori vs muut lyysitekniikat
Vaikka kemiallinen ja entsymaattinen hajoaminen voi olla ongelmallista – Koska kemiallinen hajoaminen voi muuttaa proteiinirakenteita ja aiheuttaa puhdistusongelmia, ja entsymaattinen hajoaminen vaatii pitkiä inkubaatioaikoja eikä ole toistettavissa; – Ultraäänihäiriö on hienostunut, nopea solujen häiriömenetelmä.
Ultraäänilyysi perustuu vain mekaanisiin voimiin. Kemikaaleja ei lisätä, sonikaatio rikkoo soluseinän leikkausvoimilla. Kemiallinen hajoaminen voi muuttaa proteiinin rakennetta ja aiheuttaa puhdistusongelmia. Entsymaattinen häiriö vaatii pitkiä inkubaatioaikoja eikä ole toistettavissa. E.coli-bakteerisolujen ultraäänisolujen häiriöt ovat nopeita, yksinkertaisia, luotettavia ja toistettavissa. Siksi Hielscher-ultraäänilaitteita käytetään biologisissa ja biokemiallisissa laboratorioissa ympäri maailmaa näytteen valmistukseen, pre-ananlytics, in vitro diagonstiikka ja jakotukimääritykset.
Yleiset suositukset ultraäänilyysille
Sonikaatio on suosituin tekniikka hyvin pienten, keskisuurten ja suurten solususpensioiden hajottamiseksi – piko-litroista jopa 100L / h (ultraäänivirtauskennolla). Solut liuotetaan nestemäisellä leikkauksella ja kavitaatiolla. DNA leikataan myös sonikoinnin aikana, joten DNaasia ei tarvitse lisätä solususpensioon.
Lämpötilan säätö ultraääni E.coli -analyysin aikana
Jäähdyttämällä näyte etukäteen ja pitämällä näyte sonikoinnin aikana jäällä, näytteen lämpöhajoaminen voidaan helposti estää.
Ihannetapauksessa näytteet tulisi pitää jääkylminä lyysin aikana, mutta useimmille näytteille riittää, että lämpötila ei nouse viljelmän tai kudoslähteen lämpötilaa korkeammaksi. Siksi on suositeltavaa pitää suspensio jäällä ja sonikoida useilla lyhyillä ultraäänipulsseilla 5-10 sekuntia ja taukoja 10-30 sekuntia. Taukojen aikana lämpö voi haihtua matalan lämpötilan palauttamiseksi. Suurempiin solunäytteisiin on saatavilla erilaisia virtauskennoreaktoreita, joissa on jäähdytysvaipat.
Lue täältä yksityiskohtaiset vinkit ja suositukset onnistuneeseen ultraäänilyysiin!
Protokollat E. coli -lysaattien ultraäänivalmistusta varten
Tutkijat käyttävät Hielscherin ultraäänihomogenisaattoreita E.coli-solujen häiriöihin. Alla on erilaisia testattuja ja todistettuja protokollia E.coli-lyysille käyttämällä Hielscherin ultraäänihomogenisaattoreita erilaisiin E. coliin liittyviin sovelluksiin.
Solujen kasvu, silloitus ja E. coli -soluuutteiden valmistus ultraäänellä
SeqA- ja RNA-polymeraasille ChIP-Chip E. coli MG1655 tai MG1655 ΔseqA kasvatettiin 37 °C:ssa OD:ksi600 noin 0,15 millilitrassa 50 ml:ssa LB:tä (+ 0,2 % glukoosia) ennen kuin lisättiin 27 μl formaldehydiä (37 %) millilitrassa elatusainetta kohti (lopullinen pitoisuus 1 %). Silloitus suoritettiin hitaasti ravistamalla (100 rpm) huoneenlämpötilassa 20 minuutin ajan, minkä jälkeen sammutettiin 10 ml: lla 2,5 M glysiiniä (lopullinen pitoisuus 0,5 M). Lämpösokkikokeita varten E. coli MG1655 kasvatettiin 65 ml:n LB-elatusaineessa 30 °C:ssa OD:ksi600 noin 0,3. Tämän jälkeen siirretään 30 ml viljelmää esilämmitettyyn pulloon 43 °C:ssa ja loput pidetään 30 °C:ssa. Silloitus ja sammutus tapahtui edellä kuvatulla tavalla, paitsi että soluja pidettiin 30 tai 43 °C:ssa 5 minuutin ajan, minkä jälkeen niitä ravisteltiin hitaasti huoneenlämmössä. Solut kerättiin sentrifugoimalla ja pestiin kahdesti kylmällä TBS: llä (pH 7,5). Uudelleensuspensio 1 ml: n lyysipuskurissa (10 mM Tris (pH 8,0), 20% sakkaroosi, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg / ml lysotsyymi) ja inkubointi 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan, jota seurasi 4 ml: n IP-puskurin lisääminen, solut sonikoitiin jäällä 12 kertaa 30 sekunnin ja 30 sekunnin taukoilla Hielscherin ultraääniprosessorilla UP400St 100%: n tehoasetuksella. Kun supernatanttia oli sentrifugoitu 10 minuuttia 9000 g:ssa, 800 μl määräosia supernatanttia säilytettiin -20 °C:ssa. (Waldminghaus 2010)
Entsyymien ylituotanto ja puhdistus ultraäänianturilla
Dekahistidiini (His10)-merkittyjen proteiinien ylituotantoa varten E. coli BL21(DE3) muunnettiin pET19b-rakenteilla. Yön yli esiviljelty kerättiin sentrifugoimalla, ja 1% käytettiin ilmentymisviljelmän siirrostamiseen. PET19mgtB:tä kantavia soluja kasvatettiin 22 °C:ssa, kunnes optinen tiheys 600 nm:ssä (OD600) oli 0,7. Viljelmä siirrettiin 17 °C:seen ja indusoitiin 100 μM IPTG:llä. 16 tunnin kuluttua viljelmä korjataan sentrifugoimalla 7 500 × g:ssa 4 °C:ssa. Solut suspendoitiin uudelleen 50 mM: n fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS) 0,3 M NaCl: lla pH: ssa 7,4 ja häirittiin ultraäänellä S2-mikrokärjen sonotrodilla Hielscherin ultraäänilaitteessa UP200St syklillä 0,5 ja amplitudilla 75%.
Dekahistidiinimerkityn GtfC:n ylituotanto indusoitiin 37 °C:ssa OD:ssa600 0,6 100 μM IPTG:llä. Tämän jälkeen soluja inkuboitiin 4 tunnin ajan, kerättiin ja lysoitettiin, kuten edellä todettiin MgtB:n osalta.
Raakasoluuutteet sentrifugoitiin 15 000 × g:ssa ja 4 °C:ssa solujätteiden sedimentoimiseksi. Kirkastetut uutteet ladattiin 1 ml:n HisTrap FF Crude -kolonneihin ÄKTAprime Plus -järjestelmällä. Entsyymit puhdistettiin valmistajan His-merkittyjen proteiinien gradienttieluutioprotokollan mukaisesti. Eluoituja proteiiniliuoksia dialysoitiin kahdesti 1 000 tilavuutta vastaan 50 mM PBS:ää, pH 7,4, 0,3 M NaCl:lla 4 °C:ssa. Puhdistus analysoitiin 12% SDS-PAGE: lla. Proteiinipitoisuus määritettiin Bradfordin menetelmällä käyttäen Roti-Quantia. (Rabausch ym. 2013)
Proteiinin ultraääniuutto E. coli -bakteereista
Kiinnostava syöttiproteiini (tässä tapauksessa Arabidopsis thaliana -lajin MTV1) fuusioidaan GST-tunnisteeseen ja ilmaistaan BL21 Escherichia coli (E. coli) -soluissa.
- Otetaan yksi pelletti GST-MTV1:tä ja GST:tä (vastaa 50 ml:aa bakteeriviljelmää) ja suspendoidaan kumpikin uudelleen 2,5 ml:aan jääkylmäuuttopuskuria.
- Käytä ultraäänilaitetta UP100H (varustettu MS3-mikrokärki-sonotrodilla pienille määrille noin 2-5 ml) bakteerisolujen häiritsemiseksi, kunnes ne hajoavat, mikä näkyy vähentyneellä opasiteettilla ja lisääntyneellä viskositeetilla. Tämä on suoritettava jäällä, ja on suositeltavaa sonikoida välein (esim. 10 sekunnin sonikointi, jota seuraa 10 sekunnin tauko jäällä ja niin edelleen). On huolehdittava siitä, ettei sonikoida liian suurella intensiteetillä. Jos havaitaan vaahtoamista tai valkoisen sakan muodostumista, voimakkuutta on alennettava.
- Siirretään liuotettu bakteeriliuos 1,5 ml:aan mikrosentrifugiputkia ja sentrifugoidaan 4 °C:ssa, 16 000 x g:ssa 20 minuutin ajan.
Koetintyyppiset ultraäänilaitteet, kuten UP400St käytä akustisen kavitaation toimintaperiaatetta E. colin tehokkaaseen hajoamiseen.
Rekombinanttiproteiinin ilmentymisanalyysi ja puhdistus sonikaatiolla
E. coli -pelletti sonikoitiin Hielscher-ultraäänilaitteella UP100H. Tätä tarkoitusta varten solupelletti suspendoitiin uudelleen jäähdytettyyn lyysipuskuriin (50 mM Tris-HCl pH = 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) ja jäähdytettiin jäällä 10 minuutin ajan. Sitten solususpensio sonikoitiin 10 lyhyellä 10 sekunnin purskeella, jota seurasi 30 sekunnin välein jäähdytystä varten. Lopuksi solujätteet poistettiin ultrasentrifugoimalla 4 °C:ssa 15 minuutin ajan nopeudella 14000 rpm. rPR:n ilmentymisen vahvistamiseksi supernatanttia ajettiin 12-prosenttisella polyakryyliamidigeelillä ja analysoitiin SDS-PAGE:lla ja Western blottingilla. rPR:n puhdistus tehtiin Ni2+-NTA-hartsilla (Invitrogen, USA) valmistajan oppaan mukaisesti. Tässä vaiheessa käytettiin natiivia puhdistusmenetelmää. Puhdistetun proteiinin puhtaus arvioitiin käyttämällä 12-prosenttisen polyakryyliamidigeelin elektroforeesia ja sitä seuraavaa Coomassien sinistä värjäystä. Puhdistetun proteiinin pitoisuus mitattiin Micro BCA -proteiinimäärityssarjalla (PIERCE, USA). (Azarnezhad ym. 2016)
Ultraäänihomogenisaattorit E. coli -lyysille
Hielscher Ultrasonics suunnittelee, valmistaa ja toimittaa korkean suorituskyvyn ultraäänihomogenisaattoreita E. coli -bakteerien ja muiden solutyyppien, kudosten ja soluviljelmien luotettavaan ja tehokkaaseen lyysiin.
Laaja valikoima ultraäänikoettimia sekä epäsuoria sonikaatiojärjestelmiä antaa meille mahdollisuuden tarjota sinulle ihanteellinen ultraäänikudoshomogenisaattori solujen häiriöihin ja uuttamiseen.
Suunnittelu, valmistus ja konsultointi – Laatu valmistettu Saksassa
Hielscher-ultraääniastiat ovat tunnettuja korkeimmista laatu- ja suunnittelustandardeistaan. Älykäs ohjelmisto, intuitiivinen valikko, ohjelmoitavat asetukset ja automaattinen dataprotokolla ovat vain muutamia Hielscher-ultraäänilaitteiden ominaisuuksia. Kestävyys ja helppo käyttö mahdollistavat ultraäänilaitteidemme sujuvan integroinnin tutkimus- ja biotekniikkalaitoksiin. Jopa vaikeat olosuhteet ja vaativat ympäristöt käsitellään helposti Hielscher-ultraäänilaitteilla.
Hielscher Ultrasonics on ISO-sertifioitu yritys ja painottaa erityisesti korkean suorituskyvyn ultraäänilaitteita, joissa on huipputeknologia ja käyttäjäystävällisyys. Tietenkin, Hielscher-ultraäänilaitteet ovat CE-yhteensopivia ja täyttävät UL: n, CSA: n ja RoHs: n vaatimukset.
Alla oleva taulukko antaa sinulle viitteitä ultraäänilaitteidemme likimääräisestä käsittelykapasiteetista:
| Erän tilavuus | Virtausnopeus | Suositellut laitteet |
|---|---|---|
| monikuoppa- / mikrotiitterilevyt | n.a. | UIP400MTP |
| CupHorn injektiopulloille tai dekantterilasille | n.a. | Ultraääni CupHorn |
| ultraääni mikrovirtausreaktori | n.a. | GDmini2 |
| enintään 10 injektiopulloa, joissa 0,5–1,5 ml | n.a. | VialTweeter |
| 0.5 - 1.5 ml | n.a. | VialTweeter |
| 1 - 500 ml | 10 - 200 ml / min | UP100H |
| 10 - 2000ml | 20–400 ml/min | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 - 20L | 0.2–4 l/min | UIP2000hdT |
| 10-100L | 2 - 10L / min | UIP4000 |
| n.a. | 10-100L / min | UIP16000 |
| n.a. | suurempi | klusteri UIP16000 |
Ota yhteyttä! / Kysy meiltä!
Lisäprotokollat ultraääni E. coli -lyysille
Allisiinimodifioidut proteiinit E. colissa käyttämällä ultraäänipullodiskanttikaiutinta
Sulfhydryylipitoisuuden määrittäminen 5,5′-ditiobis(2-nitrobentsoehappo) (DTNB) -määrityksellä
E. coli MG1655 yön yli -viljelmää käytettiin MOPS-minimaalisen elatusaineen (1:100) siirrostamiseen. Viljelmää kasvatettiin aerobisesti, kunnes saavutettiin A600 0,4. Viljelmä jaettiin kolmeen 15 ml:n viljelmään stressin hoitoa varten. Käsittelemätön viljelmä toimi negatiivisena kontrollina. 0,79 mM allisiinia (128 μg ml-1) tai 1 mM diamidia lisättiin kumpaankin jäljellä olevista kahdesta viljelmästä. Viljelmiä inkuboitiin 15 minuuttia. 5 ml kutakin viljelmää kerättiin sentrifugoimalla (8,525 × g, 4 °C, 10 min). Solut pestiin kahdesti 1 ml:lla PBS:ää (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, varastoitiin anaerobisesti ennen käyttöä) ja sentrifugoitiin (13 000 × g, 4 °C, 10 min). Solut suspendoitiin uudelleen lyysipuskuriin (PBS, jossa oli 6 mM guanidinium HCl, pH 7,4) ennen häiriöitä 4 ° C: ssa ultraäänellä (VialTweeter ultraäänilaite, Hielscher GmbH, Saksa) (3 × 1 min). Solujätteet pelletoitiin sentrifugoimalla (13 000 × g, 4 °C, 15 min). Supernatantti siirretään 3,5 ml:n QS-makrokyvettiin (10 mm) magneettisella sekoitustangolla ja sekoitetaan 1 ml:aan lyysipuskuria. Näytteiden sukupuuttoa seurattiin 412 nm:ssä Jasco V-650 -spektrofotometrillä, joka oli varustettu lämpötilasäädellyllä PSC-718-kennopidikkeellä huoneenlämmössä. Lisättiin 100 μl 3 mM ditiobis(2-nitrobentsoehappo)liuosta. Sukupuuttoa seurattiin, kunnes se saavutti kylläisyyden. Tiolipitoisuus laskettiin käyttämällä ekstinktiokerrointa ε412 = 13 700 metriä-1 Cm-1 tio-2-nitrobentsoehapon (TNB) osalta. Solujen tiolipitoisuudet laskettiin E. coli -solujen tilavuuden perusteella 6,7 × 10-15 litra ja solutiheys A600 = 0,5 (vastaa 1 × 108 solut ml-1 kulttuuri). (Müller ym. 2016)
In vivo -glutationin määritys ultraäänisolumurskaimella
E.coli MG1655:tä kasvatettiin MOPS-minimaalisessa elatusaineessa 200 ml:n kokonaistilavuudessa, kunnes A600 oli 0,5. Viljelmä jaettiin 50 ml:n viljelmiin stressin hoitoa varten. 15 minuutin inkuboinnin jälkeen 0,79 mM allisiinilla, 1 mM diamidilla tai dimetyylisulfoksidilla (kontrolli) soluja kerättiin 4 000 g:ssa 4 °C:ssa 10 minuutin ajan. Kennot pestiin kahdesti KPE-puskurilla ennen pellettien uudelleensuspensiota 700 μl:ssa KPE-puskuria. Proteiininpoistoa varten lisättiin 300 l 10% (w / v) sulfosalisyylihappoa ennen solujen häiriöitä ultraäänellä (3 x 1 min; VialTweeter ultraäänilaite). Supernatantit kerättiin sentrifugoinnin jälkeen (30 min, 13 000 g, 4 °C). Sulfosalisyylihappopitoisuudet pienennettiin 1%: iin lisäämällä 3 tilavuutta KPE-puskuria. Kokonaisglutationin ja GSSG:n mittaukset suoritettiin edellä kuvatulla tavalla. Solujen glutationipitoisuudet laskettiin E. coli -solujen tilavuuden 6,7 perusteella×10-15 litra ja solutiheys A600 0,5 (vastaa 1×108 solut ml-1 kulttuuri). GSH-pitoisuudet laskettiin vähentämällä 2[GSSG] glutationin kokonaismäärästä. (Müller ym. 2016)
Ihmisen mAspAT: n ilmentyminen E. colissa käyttämällä ultraäänihomogenisaattoria
Ainoa E. coli BL21 (DE3) -pesäke, jossa on ilmentymisvektori 30 ml:ssa Luria-Bertani (LB) -elatusainetta, joka sisältää 100 μg/ml ampisilliinia, ja jota viljellään sitten 37 °C:ssa optiseen tiheyteen (OD asti) asti600) oli 0,6. Solut kerättiin sentrifugoimalla 4 000 × g:ssa 10 minuutin ajan ja suspendoitiin uudelleen 3 litraan tuoretta LB-elatusainetta, joka sisälsi ampisilliinia 100 μg/ml.
Tämän jälkeen proteiinien ilmentyminen indusoitiin 1 mM isopropyyli-β-ᴅ-1-tiogalaktopyranosidilla (IPTG) 20 tunnin ajan 16 ºC:ssa. Solut kerätään sentrifugoimalla 8 000 × g:ssa 15 minuutin ajan ja pestään puskurilla A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Likimääräiset 45 g:n (märkäpainoiset) solut saatiin 3 litran viljelmästä. Sentrifugoinnin jälkeen solupelletit suspendoitiin uudelleen 40 ml: aan (1 litran viljelmälle) jääkylmäuuttopuskuriin A ja lysoidaan ultraäänellä jääkylmässä lämpötilassa Hielscherin ultraäänisolumurskaimella UP400St. Solulyysiä sentrifugoitiin nopeudella 12 000 kierrosta minuutissa 15 minuutin ajan liukoisten (supernatanttien) ja saostuneiden (pelletti) fraktioiden erottamiseksi. (Jiang ym. 2015)
Faktoja, jotka kannattaa tietää
E.coli
Escherichia coli (E. coli) on Escherichia-suvun gramnegatiivinen, fakultatiivisesti anaerobinen, sauvamainen, koliforminen bakteeri, jota esiintyy yleisesti lämminveristen organismien (endotermien) alasuolessa. On olemassa suuri määrä E. coli -kantoja (tai alatyyppejä), joilla on erilaisia ominaisuuksia. Useimmat E. coli -kannat ovat vaarattomia ihmisille, esimerkiksi B- ja K-12-kannat, joita käytetään yleisesti laboratorioiden tutkimussovelluksissa. Jotkut kannat ovat kuitenkin haitallisia ja voivat aiheuttaa vakavia sairauksia.
E. colilla on tärkeä rooli nykyaikaisessa biologisessa tekniikassa ja teollisessa mikrobiologiassa, koska bakteereja on helppo manipuloida. Yleiset laboratoriosovellukset, joissa käytetään usein E. coli -bakteeria, esimerkiksi rekombinantin deoksiribonukleiinihapon (DNA) tuottamiseen tai malliorganismina toimimiseen.
E. coli on erittäin monipuolinen isäntä heterologisten proteiinien tuotannossa, ja E. colissa on käytettävissä moninaisia proteiinien ilmentymisjärjestelmiä rekombinanttiproteiinien tuottamiseksi. Käyttämällä plasmideja, jotka mahdollistavat proteiinin korkean tason ilmentymisen, geenejä voidaan viedä bakteereihin, mikä mahdollistaa tällaisten proteiinien tuottamisen suurina määrinä teollisissa käymisprosesseissa.
E. colia käytetään solutehtaina insuliinin tuottamiseksi. Muita sovelluksia ovat muunnettujen E. coli -solujen käyttö rokotteiden ja immobilisoitujen entsyymien kehittämisessä ja tuotannossa, biopolttoaineiden tuotannossa sekä bioremediaatiossa.
Kanta K-12 on E. colin mutanttimuoto, joka yli-ilmentää alkalisen fosfataasin (ALP) entsyymiä. Tämä mutaatio johtuu geenin virheestä, joka jatkuvasti koodaa entsyymiä. Jos geeni tuottaa tuotteen ilman estoja, tätä kutsutaan konstitutiiviseksi aktiivisuudeksi. Tätä spesifistä mutanttimuotoa käytetään ALP-entsyymin eristämiseen ja puhdistamiseen.
E. coli -bakteereja käytetään myös laajalti solutehtaina. Muokattuja mikrobeja (esim. bakteereja) ja kasvisoluja voidaan käyttää ns. solutehtaina. Nämä geneettisesti muunnetut solut tuottavat molekyylejä, kemikaaleja, polymeerejä, proteiineja ja muita aineita, joita käytetään esimerkiksi lääke-, elintarvike- ja kemianteollisuudessa. Tällaisten biomuokattujen solujen sisätiloissa tuotettujen molekyylien vapauttamiseksi ultraäänilyysi on yleinen menetelmä soluseinien häiritsemiseksi ja kohdeaineiden siirtämiseksi ympäröivään nesteeseen. Lue lisää biomuokattujen solujen lyysistä!
Ultraääni-DNA-leikkaus
Ultraäänileikkausvoimat ovat yleisesti käytetty menetelmä molekyylien, organellien ja proteiinien vapauttamiseksi solun sisäpuolelta sekä DNA-säikeiden hajottamiseksi paloiksi. Akustinen kavitaatio rikkoo soluseinät ja kalvot DNA: n uuttamiseksi soluista ja noin 600: n fragmenttien tuottamiseksi – 800 bp pitkä, mikä on ihanteellinen analyysiin.
Klikkaa tästä saadaksesi lisätietoja ultraäänihomogenisaattoreista DNA: n pirstoutumiseen!
Kirjallisuus / Viitteet
- Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
- Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
- Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
- Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
- Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
- Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.
Hielscher Ultrasonics valmistaa korkean suorituskyvyn ultraäänihomogenisaattoreita laboratorio jotta Teollisuuden koko.