E. Colin ultraääni-lyysi

  • E. coli -bakteerit ovat mikrobiologian ja bioteknologian yleisimmin käytetyt bakteerit.
  • Ultraäänisolun haitta-aineet tuottavat luotettavia ja toistettavia tuloksia E. colin hajoamiseen.
  • Voimakas, mutta tarkasti hallittavissa oleva kavitaatio- ja leikkausvoimat aiheuttavat täydellisen häiriön ja suuret uuttotuotokset (esim. Proteiinit, DNA).

Miksi E. colin ultraäänisolujen häiriöt ovat suositeltava menetelmä?

Ultraäänihomogenisaattorit tai koetintyyppiset ultraääniastiat tarjoavat useita etuja E. coli -lyysille, koska voimakas ultraääni häiritsee tehokkaasti soluseinämiä ja kalvoja. Koetintyyppisiä ultraäänilaitteita käytetään laajalti E. coli -lyysissä seuraavista syistä:

  • Soluseinien tehokas häiriö: E. colilla on puolijäykkä soluseinä, joka koostuu peptidoglykaanista, jota voi olla vaikea murtaa perinteisillä lyysimenetelmillä. Koetintyyppinen ultraäänilaite tuottaa voimakkaita ultraääniaaltoja, jotka luovat kavitaatiokuplia soluja ympäröivään nesteeseen. Kun nämä kuplat romahtavat, ne tuottavat nopeita nestesuihkuja ja iskuaaltoja, jotka johtavat soluseinien mekaaniseen häiriöön ja vapauttavat tehokkaasti solujen sisältöä, kuten biomolekyylejä.
  • Parannettu tunkeutuminen: Koettimen / sonotrodin tuottamat ultraääniaallot voivat tunkeutua syvälle näytteeseen ja saavuttaa suuremman määrän E. coli -soluja ja käsitellä niitä tasaisesti. Tämä auttaa varmistamaan, että lyysi on tasaisempaa koko näytteessä, mikä parantaa solujen häiriöiden tehokkuutta.
  • Lyhentynyt käsittelyaika: Koetintyyppisen ultraäänilaitteen toimittama energia on erittäin keskittynyt ja paikallinen, mikä johtaa nopeaan ja tehokkaaseen solulyysiin. Verrattuna muihin menetelmiin, kuten helmien lyömiseen tai entsymaattiseen lyysiin, sonikaatio voi saavuttaa E. coli -lyysin muutamassa minuutissa tai jopa sekunnissa. Vaikka monet vaihtoehtoiset tekniikat, kuten jäädytyssulatus, vaativat useita hoitokierroksia, ultraäänilyysi avaa solut yhdessä prosessivaiheessa.
  • Lämpötilan säätö: Huippuluokan ultraäänilaitteet on varustettu lämpötila-antureilla ja älykkäällä ohjelmistolla, jonka avulla voidaan asettaa prosessin maksimilämpötila. Ultraäänilaite pysähtyy automaattisesti, kun lämpötilaraja saavutetaan, ja aloittaa sonikaatioprosessin, kun asetettu lämpötilapiste saavutetaan. Näytteiden jäähdyttäminen jäähauteessa on yksinkertainen menetelmä näytteen lämpötilan pitämiseksi alhaisena ja lämmön aiheuttaman näytteen hajoamisen estämiseksi.
  • Skaalautuvuus: Koetintyyppisiä ultraäänilaitteita on saatavana erikokoisina kädessä pidettävistä laitteista suuriin teollisiin malleihin. Tämä tekee niistä sopivia pienten määrien käsittelyyn laboratoriossa tai skaalaamiseen suurempiin bioprosessointisovelluksiin, kuten rokotteiden tuotantoon tai molekyylien biosynteesiin.
  • Monipuolisuus: Ultrasonicatoreita voidaan käyttää erilaisiin sovelluksiin solulyysin lisäksi, kuten DNA-leikkaus, proteiinien uuttaminen, kudosten homogenointi, nanohiukkasten dispersio ja emulgointi. Siksi sijoittaminen koetintyyppiseen ultraäänilaitteeseen tarjoaa monipuolisuutta tutkimus- tai teollisuusympäristöissä.
  • Koetintyyppiset ultraäänilaitteet, kuten UP200St, ovat luotettavia kudoshomogenisaattoreita ja solumurskaimia, joten niitä käytetään laajalti näytteen valmistukseen genetiikassa, esimerkiksi E.coli-lyysissä

    Proteiinien uuttaminen E. coli -soluista suoritetaan tehokkaasti ultraäänianturi UP200St

    Koetintyyppinen ultraäänilaite tarjoaa monia etuja E. coli -lyysille. Ultraääniprosessiparametrien luotettava ja tarkka hallinta mahdollistaa toimintaparametrien, kuten tehon, keston ja näytteen käsittelyn, optimoinnin haluttujen tulosten saavuttamiseksi.
     

    Informaatio pyyntö




    Huomaa, että Tietosuojakäytäntö.


     

    Tämä opetusohjelma selittää, minkä tyyppinen sonikaattori on paras näytteenvalmistustehtäviin, kuten lyysiin, solujen häiriöihin, proteiinien eristämiseen, DNA: n ja RNA: n pirstoutumiseen laboratorioissa, analyysiin ja tutkimukseen. Valitse ihanteellinen sonikaattorityyppi sovelluksellesi, näytteen määrälle, näytteen numerolle ja läpäisykyvylle. Hielscher Ultrasonicsilla on ihanteellinen ultraäänihomogenisaattori sinulle!

    Kuinka löytää täydellinen sonikaattori solujen häiriöihin ja proteiinien uuttamiseen tieteessä ja analyysissä

    Videon pikkukuva

    Ultraääni-DNA-fragmentaatiota käytetään usein näytteenvalmistusvaiheena seuraavan sukupolven sekvensoinnissa (NGS)

    E. coli EDL933: n genomi-DNA: n elektroforeettiset analyysit, joille tehdään 0-15 minuutin ultraääni. L osoittaa DNA-tikkaat.
    (tutkimus ja kuva: ©Basselet et al. 2008)

    Solujen häiriöt ultraäänikavitaatiolla

    Ultraäänianturityyppiset homogenisaattorit toimivat noin 20 000 sykliä sekunnissa (20 kHz: ssä) ja aiheuttavat kavitaatiota nesteissä tai suspensioissa. Akustinen kavitaatiomikroskooppiset tyhjiömäisten paineiden ja korkeiden lämpötilojen alueet, jotka repivät soluja erilleen. Vaikka lämpötilat voivat nousta useisiin tuhansiin celsiusasteisiin, kavitaatiomäärät ovat niin pieniä, että ne eivät lämmitä prosessia merkittävästi. Ultraäänellä tuotetut akustiset kavitaatio- ja leikkausvoimat rei'ittävät tai rikkovat bakteerisolujen, kuten E.colin, solukalvon. Hielscher-ultraäänilaitteet mahdollistavat prosessiparametrien, kuten ultraääni-intensiteetin, amplitudin, energian syötön ja lämpötilan, tarkan hallinnan. Siten ultraäänilyysiprosessi voidaan säätää optimaalisesti solutyypin, soluviljelmän ja prosessin tavoitteen mukaan.
     

    Edut Ultrasonic Lysis

    • täsmällinen lyysihallinta (intensiteetti, amplitudi, lämpötila)
    • luotettavat, toistettavat tulokset
    • optimaalinen mukautuminen tiettyihin näytteisiin
    • lämpötilan säätö
    • hyvin pienille tai erittäin suurille näytteille (μL - litra)
    • Puhtaasti mekaaninen käsittely
    • käyttäjäystävällinen, turvallinen käyttö
    • lineaarinen asteikko laboratorioista tuotantoon
    Ultraäänilaite VialTweeter mahdollistaa samanaikaisen näytteen valmistamisen jopa 10 injektiopulloon samassa prosessiohjelmassa. (Klikkaa suurentaaksesi!)

    VialTweeter ultraäänilaitoksen osalta

    Informaatio pyyntö




    Huomaa, että Tietosuojakäytäntö.


    Ultraäänihomogenisaattori vs muut lyysitekniikat

    Vaikka kemiallinen ja entsymaattinen hajoaminen voi olla ongelmallista – koska kemiallinen hajotus voi muuttaa proteiinirakenteita ja ottaa käyttöön puhdistusongelmia ja entsymaattinen hajotus vaatii pitkiä inkubointiaikoja eikä se ole toistettavissa – ultraäänihäiriö on hienostunut, nopea solujen hajotusmenetelmä.
    Ultraäänilyysi perustuu vain mekaanisiin voimiin. Kemikaaleja ei lisätä, sonikaatio rikkoo soluseinän leikkausvoimilla. Kemiallinen hajoaminen voi muuttaa proteiinin rakennetta ja aiheuttaa puhdistusongelmia. Entsymaattinen häiriö vaatii pitkiä inkubaatioaikoja eikä ole toistettavissa. E.coli-bakteerisolujen ultraäänisolujen häiriöt ovat nopeita, yksinkertaisia, luotettavia ja toistettavissa. Siksi Hielscher-ultraäänilaitteita käytetään biologisissa ja biokemiallisissa laboratorioissa ympäri maailmaa näytteen valmistukseen, pre-ananlytics, in vitro diagonstiikka ja jakotukimääritykset.

    Yleiset suositukset ultraäänilyysille

    Sonication on suosituin tekniikka lysing hyvin pieniä, keskisuuria ja suuria määriä solujen suspensioita – pico-litrasta aina 100 litraan / tunti (käyttämällä ultraäänivirta-solua). Solut hajotetaan nestemäisellä leikkauksella ja kavitaatiolla. DNA myös leikataan sonikaation aikana, joten ei ole tarpeen lisätä DNaasia solususpensioon.
     

    Lämpötilan säätö ultraääni E.coli -lyysin aikana
    Ultraäänisolujen häiritsijä UP100H (100W) solujen häiriöihin ja kasviyhdisteiden uuttamiseen.Esijäähdyttämällä näytettä ja pitämällä näytettä sonikaation aikana jäällä näytteen lämpötilan hajoaminen voidaan helposti estää.
    Ihannetapauksessa näytteet tulisi pitää jääkylminä lyysin aikana, mutta useimmille näytteille riittää, että lämpötila ei nouse viljelmän tai kudoslähteen lämpötilaa korkeammaksi. Siksi on suositeltavaa pitää suspensio jäällä ja sonikoida useilla lyhyillä ultraäänipulsseilla 5-10 sekuntia ja taukoja 10-30 sekuntia. Taukojen aikana lämpö voi haihtua matalan lämpötilan palauttamiseksi. Suuremmille solunäytteille on saatavilla erilaisia virtauskennoreaktoreita, joissa on jäähdytysvaipat.
    Lue täältä yksityiskohtaiset vinkit ja suositukset onnistuneeseen ultraäänilyysiin!

    Protokollat E. coli -lysaattien ultraäänivalmistukseen

    Tutkijat käyttävät Hielscherin ultraäänihomogenisaattoreita E.coli-solujen häiriöihin. Alla on erilaisia testattuja ja todistettuja protokollia E.coli-lyysille käyttämällä Hielscherin ultraäänihomogenisaattoreita erilaisiin E. coliin liittyviin sovelluksiin.
     

    Tämä videoleike näyttää Hielscherin ultraäänihomogenisaattorin UP100H, ultraäänilaitteen, jota käytetään laajalti näytteiden valmistukseen laboratorioissa.

    Ultraääni homogenisaattori UP100H

    Videon pikkukuva

    Solujen kasvu, silloitus ja E. coli -soluuutteiden valmistus ultraäänellä

    SeqA: n ja RNA-polymeraasin ChIP-sirulle E. coli MG1655 tai MG1655 ΔseqA kasvatettiin 37 ° C: ssa OD: ksi600 noin 0,15 50 ml: ssa LB: tä (+ 0,2% glukoosia) ennen kuin lisättiin 27 pl formaldehydiä (37%) / ml elatusainetta (loppupitoisuus 1%). Silloittuminen suoritettiin hitaasti ravistellen (100 rpm) huoneenlämpötilassa 20 min, mitä seurasi sammutus 10 ml: lla 2,5 M glysiiniä (lopullinen pitoisuus 0,5 M). Lämpösokkakokeissa E. coli MG1655 kasvatettiin 65 ml: n LB-väliaineessa 30 ° C: ssa OD: ksi600 noin 0,3. Tämän jälkeen siirretään 30 ml viljelmää esilämmitettyyn pulloon 43 °C:ssa ja loput pidetään 30 °C:ssa. Silloitus ja sammutus tapahtui edellä kuvatulla tavalla, paitsi että soluja pidettiin 30 tai 43 °C:ssa 5 minuutin ajan, minkä jälkeen niitä ravisteltiin hitaasti huoneenlämmössä. Solut kerättiin sentrifugoimalla ja pestiin kahdesti kylmällä TBS: llä (pH 7,5). Kun solut oli suspendoitu uudelleen 1 ml: n lyysipuskuriin (10 mM Tris (pH 8,0), 20% sakkaroosi, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg / ml lysotsyymi) ja inkuboitu 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan, jota seurasi 4 ml: n IP-puskurin lisääminen, solut sonikoitiin jäällä 12 kertaa 30 sekunnin ja 30 sekunnin taukoilla Hielscherin ultraääniprosessorilla UP400St 100%: n tehoasetuksella. Kun supernatanttia oli sentrifugoitu 10 minuuttia 9000 g:ssa, 800 μl määräosia supernatanttia säilytettiin -20 °C:ssa. (Waldminghaus 2010)
     

    Entsyymien ylituotanto ja puhdistus ultraäänianturilla

    Ultrasonicator UP100H on laboratorion homogenisaattori, jota käytetään usein soluviljelylevyjen näytteen valmistukseen.Dekahistidiini (His10)-merkittyjen proteiinien ylituotantoa varten E. coli BL21(DE3) muunnettiin pET19b-rakenteilla. Yön yli esiviljelty kerättiin sentrifugoimalla, ja 1% käytettiin ilmentymisviljelmän siirrostamiseen. PET19mgtB:tä kantavia soluja kasvatettiin 22 °C:ssa, kunnes optinen tiheys 600 nm:ssä (OD600) oli 0,7. Viljelmä siirrettiin 17 °C:seen ja indusoitiin 100 μM IPTG:llä. 16 tunnin kuluttua viljelmä kerätään sentrifugoimalla 7 500 × g:ssa 4 °C:ssa. Solut suspendoitiin uudelleen 50 mM: n fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS) 0,3 M NaCl: lla pH: ssa 7,4 ja häirittiin ultraäänellä S2-mikrokärjen sonotrodilla Hielscherin ultraäänilaitteessa UP200St syklillä 0,5 ja amplitudilla 75%.
    Dekekistidiinilla merkityn GtfC: n ylituotanto indusoitui 37 ° C: ssa OD: ssa600 0,6, 100 uM IPTG: llä. Sitten soluja inkuboitiin 4 h, kerättiin ja hajotettiin MgtB: n mukaisesti.
    Raakasoluuutteet sentrifugoitiin 15 000 × g:ssa ja 4 °C:ssa solujätteiden sedimentoimiseksi. Kirkastetut uutteet ladattiin 1 ml:n HisTrap FF Crude -kolonneihin ÄKTAprime Plus -järjestelmällä. Entsyymit puhdistettiin valmistajan His-merkittyjen proteiinien gradienttieluutioprotokollan mukaisesti. Eluoituja proteiiniliuoksia dialysoitiin kahdesti 1 000 tilavuutta vastaan 50 mM PBS:ää, pH 7,4, 0,3 M NaCl:lla 4 °C:ssa. Puhdistus analysoitiin 12% SDS-PAGE: lla. Proteiinipitoisuus määritettiin Bradfordin menetelmällä käyttäen Roti-Quantia. (Rabausch ym. 2013)
     

    Proteiinin ultraääniuutto E. coli -bakteereista
    Kiinnostuksen kohteena oleva syötti-proteiini (tässä tapauksessa Arabidopsis thalianan MTV1) fuusioidaan GST-tagille ja ekspressoidaan BL21 Escherichia coli (E. coli) -soluissa.

    1. Otetaan yksi pelletti GST-MTV1:tä ja GST:tä (vastaa 50 ml:aa bakteeriviljelmää) ja suspendoidaan kumpikin uudelleen 2,5 ml:aan jääkylmäuuttopuskuria.
    2. Käytä ultraäänilaitetta UP100H (varustettu MS3-mikrokärki-sonotrodilla pienille määrille noin 2-5 ml) bakteerisolujen häiritsemiseksi, kunnes ne hajoavat, mikä näkyy vähentyneellä opasiteettilla ja lisääntyneellä viskositeetilla. Tämä on suoritettava jäällä, ja on suositeltavaa sonikoida välein (esim. 10 sekunnin sonikointi, jota seuraa 10 sekunnin tauko jäällä ja niin edelleen). On huolehdittava siitä, ettei sonikoida liian suurella intensiteetillä. Jos havaitaan vaahtoamista tai valkoisen sakan muodostumista, voimakkuutta on alennettava.
    3. Siirretään liuotettu bakteeriliuos 1,5 ml:aan mikrosentrifugiputkia ja sentrifugoidaan 4 °C:ssa, 16 000 x g:ssa 20 minuutin ajan.

     

    Ultraäänianturit käyttävät akustisen kavitaation voimia häiritsemään soluja ja uuttamaan molekyylejä ja DNA: ta E.colista.

    Koetintyyppiset ultraäänilaitteet, kuten UP400St käytä akustisen kavitaation toimintaperiaatetta E. colin tehokkaaseen hajoamiseen.

    Rekombinanttiproteiinin ilmentymisanalyysi ja puhdistus sonikaatiolla

    E. coli -pelletti sonikoitiin Hielscher-ultraäänilaitteella UP100H. Tätä tarkoitusta varten solupelletti suspendoitiin uudelleen jäähdytettyyn lyysipuskuriin (50 mM Tris-HCl pH = 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) ja jäähdytettiin jäällä 10 minuutin ajan. Sitten solususpensio sonikoitiin 10 lyhyellä 10 sekunnin purskeella, jota seurasi 30 sekunnin välein jäähdytystä varten. Lopuksi solujätteet poistettiin ultrasentrifugoimalla 4 °C:ssa 15 minuutin ajan nopeudella 14000 rpm. RPR:n ilmentymisen vahvistamiseksi supernatanttia ajettiin 12-prosenttisella polyakryyliamidigeelillä ja analysoitiin SDS-PAGE:lla ja Western blottingilla. rPR:n puhdistus tehtiin Ni2+-NTA-hartsilla (Invitrogen, USA) valmistajan oppaan mukaisesti. Tässä vaiheessa käytettiin natiivia puhdistusmenetelmää. Puhdistetun proteiinin puhtaus arvioitiin käyttämällä elektroforeesia 12-prosenttisella polyakryyliamidigeelillä ja sitä seuranneella Coomassien sinisellä värjäyksellä. Puhdistetun proteiinin pitoisuus mitattiin Micro BCA -proteiinimäärityssarjalla (PIERCE, USA). (Azarnezhad ym. 2016)
     

    Tämä video näyttää 200 watin ultraäänikupornin laboratorionäytteiden dispergointiin, homogenointiin, uuttamiseen tai kaasunpoistoon.

    Ultraääni Cuphorn (200 wattia)

    Videon pikkukuva

    Ultraäänihomogenisaattorit E. coli -lyysille

    Hielscher Ultrasonics suunnittelee, valmistaa ja toimittaa korkean suorituskyvyn ultraäänihomogenisaattoreita E. coli -bakteerien ja muiden solutyyppien, kudosten ja soluviljelmien luotettavaan ja tehokkaaseen lyysiin.
    Laaja valikoima ultraäänikoettimia sekä epäsuoria sonikaatiojärjestelmiä antaa meille mahdollisuuden tarjota sinulle ihanteellinen ultraäänikudoshomogenisaattori solujen häiriöihin ja uuttamiseen.

    Suunnittelu, valmistus ja konsultointi – Laatu valmistettu Saksassa

    Hielscherin ultraäänilaitteita voidaan ohjata etänä selaimen ohjauksen avulla. Sonikaatioparametreja voidaan seurata ja säätää tarkasti prosessivaatimusten mukaan.Hielscher-ultraääniastiat ovat tunnettuja korkeimmista laatu- ja suunnittelustandardeistaan. Älykäs ohjelmisto, intuitiivinen valikko, ohjelmoitavat asetukset ja automaattinen dataprotokolla ovat vain muutamia Hielscher-ultraäänilaitteiden ominaisuuksia. Kestävyys ja helppo käyttö mahdollistavat ultraäänilaitteidemme sujuvan integroinnin tutkimus- ja biotekniikkalaitoksiin. Jopa vaikeat olosuhteet ja vaativat ympäristöt käsitellään helposti Hielscher-ultraäänilaitteilla.

    Hielscher Ultrasonics on ISO-sertifioitu yritys, joka painottaa erityisesti korkean suorituskyvyn ultraäänilaitteita, joissa on uusinta tekniikkaa ja käyttäjäystävällisyyttä. Tietenkin Hielscherin ultraäänilaitteet ovat CE-yhteensopivia ja täyttävät UL: n, CSA: n ja RoHs: n vaatimukset.

    Seuraavassa taulukossa on merkintä ultrasonicatorien likimääräisestä käsittelykapasiteetista:

    erätilavuus Virtausnopeus Suositeltavat laitteet
    monikaivo- / mikrotitterilevyt n.a UIP400MTP-työkalu
    CupHorn injektiopulloille tai dekantterilasille n.a ultraääni CupHorn
    ultraääni mikrovirtausreaktori n.a GDmini2
    enintään 10 injektiopulloa, joissa 0,5–1,5 ml n.a VialTweeter
    0.5 - 1,5 ml n.a VialTweeter
    1 - 500 ml 10 - 200 ml / min UP100H
    10 - 2000 ml 20 - 400 ml / min Uf200 ः t, UP400St
    0.1 - 20L 0.2 - 4 l / min UIP2000hdT
    10 - 100 litraa 2 - 10 l / min UIP4000
    n.a 10 - 100 l / min UIP16000
    n.a suuremmat klusterin UIP16000

    Ota meihin yhteyttä! / Kysy meiltä!

    Kysy lisä tietoja

    Käytä alla olevaa lomaketta pyytääksesi lisätietoja ultraäänikudoshomogenisaattoreista ja solumurskaimista, lyysisovelluksista ja hinnoista. Olemme iloisia voidessamme keskustella prosessistasi kanssasi ja tarjota sinulle ultraäänihomogenisaattorin, joka täyttää vaatimukset!









    Huomaathan, että Tietosuojakäytäntö.


    Video näyttää ultraääninäytteen valmistusjärjestelmän UIP400MTP, joka mahdollistaa minkä tahansa tavallisen monikaivolevyn luotettavan näytteen valmistuksen korkean intensiteetin ultraäänellä. UIP400MTP: n tyypillisiä sovelluksia ovat solulyysi, DNA, RNA ja kromatiini leikkaus sekä proteiinin uuttaminen.

    Ultraääni UIP400MTP monitasoiseen levyn sonikaatioon

    Videon pikkukuva

    Lisäprotokollat ultraääni E. coli -lyysille

    Allisiinimodifioidut proteiinit E. colissa käyttämällä ultraäänipullodiskanttikaiutinta

    VialTweeter ultraääniprosessori up200STSulfhydryylisisällön määritys 5,5'-dithiobis (2-nitrobentsoehappo) (DTNB) -määrityksellä
    E. coli MG1655 yön yli -viljelmää käytettiin MOPS-minimaalisen elatusaineen (1:100) siirrostamiseen. Viljelmää kasvatettiin aerobisesti, kunnes saavutettiin A600 0,4. Viljelmä jaettiin kolmeen 15 ml:n viljelmään stressin hoitoa varten. Käsittelemätön viljelmä toimi negatiivisena kontrollina. 0,79 mM allisiinia (128 μg ml-1) tai 1 mM diamidia lisättiin kumpaankin jäljellä olevista kahdesta viljelmästä. Viljelmiä inkuboitiin 15 minuuttia. 5 ml kutakin viljelmää kerättiin sentrifugoimalla (8,525 × g, 4 °C, 10 min). Solut pestiin kahdesti 1 ml:lla PBS:ää (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, varastoitiin anaerobisesti ennen käyttöä) ja sentrifugoitiin (13 000 × g, 4 °C, 10 min). Solut suspendoitiin uudelleen lyysipuskuriin (PBS, jossa oli 6 mM guanidinium HCl, pH 7,4) ennen häiriöitä 4 ° C: ssa ultraäänellä (VialTweeter ultraäänilaite, Hielscher GmbH, Saksa) (3 × 1 min). Solujätteet pelletoitiin sentrifugoimalla (13 000 × g, 4 °C, 15 min). Supernatantti siirretään magneettisella sekoitustangolla varustettuun 3,5 ml:n QS-makrokyvettiin (10 mm) ja sekoitetaan 1 ml:aan lyysipuskuria. Näytteiden sukupuuttoa seurattiin 412 nm:ssä Jasco V-650 -spektrofotometrillä, joka oli varustettu lämpötilasäädellyllä PSC-718-kennopidikkeellä huoneenlämmössä. Lisättiin 100 μl 3 mM ditiobis(2-nitrobentsoehappo)liuosta. Sukupuuttoa seurattiin, kunnes se saavutti kylläisyyden. Tiolipitoisuus laskettiin käyttämällä ekstinktiokerrointa ε412 = 13 700 M-1 Cm-1 tio-2-nitrobentsoehapolle (TNB). Cellulitioli pitoisuudet laskettiin perustuen 6,7 × 10 E. coli-solujen tilavuuteen-15 litra ja solutiheys A600 = 0,5 (vastaa 1 × 108 solut ml-1 kulttuuri). (Müller et ai., 2016)
     

    In vivo -glutationin määritys ultraäänisolumurskaimella

    E.coli MG1655:tä kasvatettiin MOPS-minimaalisessa elatusaineessa 200 ml:n kokonaistilavuudessa, kunnes A600 oli 0,5. Viljelmä jaettiin 50 ml:n viljelmiin stressin hoitoa varten. 15 minuutin inkuboinnin jälkeen 0,79 mM allisiinilla, 1 mM diamidilla tai dimetyylisulfoksidilla (kontrolli) soluja kerättiin 4 000 g:ssa 4 °C:ssa 10 minuutin ajan. Kennot pestiin kahdesti KPE-puskurilla ennen pellettien sekoittamista 700 μl:aan KPE-puskuria. Proteiininpoistoa varten lisättiin 300 l 10% (w / v) sulfosalisyylihappoa ennen solujen häiriöitä ultraäänellä (3 x 1 min; VialTweeter ultraäänilaitteen). Supernatantit kerättiin sentrifugoinnin jälkeen (30 min, 13 000 g, 4 ° C). Sulfosalisyylihappopitoisuudet vähenivät 1 prosenttiin lisäämällä 3 tilavuusosaa KPE-puskuria. Glutationin ja GSSG: n mittaukset suoritettiin edellä kuvatulla tavalla. Solu-glutationi-pitoisuudet laskettiin perustuen 6,7: n E. coli-solujen tilavuuteen×10-15 litra ja solutiheys A600 0,5 (vastaa 1×108 solut ml-1 kulttuuri). GSH-pitoisuudet laskettiin vähentämällä 2 [GSSG] kokonaisglutatsonista. (Müller et ai., 2016)

    Ihmisen mAspAT: n ilmentyminen E. colissa käyttämällä ultraäänihomogenisaattoria

    Ultrasuurisolun häiriö UP400St (400 W) intrasellulaaristen aineiden uuttamiseen (esim. Proteiinit, organelit, DNA, RNA jne.)E. coli BL21: n (DE3) yksittäinen siirtomaa, joka sisälsi ekspressiovektoria 30 ml: ssa Luria-Bertani (LB) -alustaa, joka sisälsi 100 ug / ml ampisilliinia, ja viljeltiin sitten 37 ° C: ssa, kunnes optinen tiheys (OD600) saavutti 0,6. Solut kerättiin sentrifugoimalla 4 000 x g: llä 10 minuutin ajan ja suspendoitiin uudelleen 3 litraan tuoreeseen LB-alustaan, joka sisälsi 100 ug / ml ampisilliinia.
    Tämän jälkeen proteiinien ilmentyminen indusoitiin 1 mM isopropyyli-β-ᴅ-1-tiogalaktopyranosidilla (IPTG) 20 tunnin ajan 16 ºC:ssa. Solut kerätään sentrifugoimalla 8 000 × g:ssa 15 minuutin ajan ja pestään puskurilla A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Likimääräiset 45 g:n (märkäpainoiset) solut saatiin 3 litran viljelmästä. Sentrifugoinnin jälkeen solupelletit suspendoitiin uudelleen 40 ml: aan (1 L: n viljelmälle) jääkylmäuuttopuskuriin A ja lysoidaan ultraäänellä jääkylmässä lämpötilassa Hielscherin ultraäänisolumurskaimella UP400St. Solulyysiä sentrifugoitiin nopeudella 12 000 kierrosta minuutissa 15 minuutin ajan liukoisten (supernatanttien) ja saostuneiden (pelletti) fraktioiden erottamiseksi. (Jiang ym. 2015)
     



    Tosiasiat, jotka kannattaa tietää

    E. coli

    Escherichia coli (E. coli) on Gram-negatiivinen, puolueettomasti anaerobinen, sauvanmuotoinen, coliform-bakteeri, Escherichia-suvun, joka tavallisesti esiintyy lämpöveristen eliöiden alemmassa suolessa (endotermit). On olemassa runsaasti E. coli -kantoja (tai alatyyppejä), joilla on erilaisia ​​ominaisuuksia. Useimmat E. coli -kannat ovat vaarattomia ihmisille, esim. B- ja K-12-kannoille, joita käytetään yleensä tutkimustarkoituksiin laboratoriossa. Jotkut kannat ovat kuitenkin haitallisia ja voivat aiheuttaa vakavia sairauksia.
    E. colilla on tärkeä rooli nykyaikaisessa biologisessa suunnittelussa ja teollisessa mikrobiologiassa, koska bakteereja on helppo käsitellä. Yhteiset laboratoriosovellukset, joihin liittyy usein E. colin käyttö, esimerkiksi rekombinanttisen deoksiribonukleiinihapon (DNA) luomiseksi tai mallin organismin toimimiseksi.
    E. coli on hyvin monipuolinen isäntä heterologisten proteiinien tuottamiseksi ja moninaiset proteiinin ilmentämisjärjestelmät ovat käytettävissä rekombinanttiproteiinien tuottamisessa E. colissa. Plasmideja, jotka mahdollistavat proteiinin korkean tason ekspression, geenit voidaan tuoda bakteereihin, mikä mahdollistaa sellaisten proteiinien tuottamisen suurina määrinä teollisissa käymisprosesseissa.
    E. colia käytetään solutehtaina insuliinin tuottamiseksi. Muita sovelluksia ovat muunnettujen E. coli -solujen käyttö rokotteiden ja immobilisoitujen entsyymien kehittämisessä ja tuotannossa, biopolttoaineiden tuotannossa sekä bioremediaatiossa.
    Kanta K-12 on E. colin mutanttimuoto, joka yli-ilmentää alkaliinifosfataasin (ALP) entsyymiä. Tämä mutaatio tapahtuu johtuen geenin vioista, joka jatkuvasti koodaa entsyymiä. Jos geeni tuottaa tuotetta ilman mitään inhibitiota, sitä kutsutaan konstitutiiviseksi aktiivisuudeksi. Tätä spesifistä mutanttimuotoa käytetään eristämään ja puhdistamaan ALP-entsyymi.
    E. coli -bakteereja käytetään myös laajalti solutehtaina. Suunniteltuja mikrobeja (esim. bakteereja) ja kasvisoluja voidaan käyttää niin sanottuina solutehtaina. Nämä geneettisesti muunnetut solut tuottavat molekyylejä, kemikaaleja, polymeerejä, proteiineja ja muita aineita, joita käytetään esimerkiksi lääke-, elintarvike- ja kemianteollisuudessa. Tällaisten bioengineeroitujen solujen sisätiloissa tuotettujen molekyylien vapauttamiseksi ultraäänilyysi on yleinen menetelmä soluseinien häiritsemiseksi ja kohdeaineiden siirtämiseksi ympäröivään nesteeseen. Lue lisää biotekniikan solujen lyysistä!

    Ultraääni-DNA leikkaus

    Ultraäänileikkausvoimat ovat yleisesti käytetty menetelmä molekyylien, organellien ja proteiinien vapauttamiseksi solun sisäpuolelta sekä DNA-säikeiden hajottamiseksi paloiksi. Akustinen kavitaatio rikkoo soluseinät ja kalvot DNA: n uuttamiseksi soluista ja tuottaa noin 600: n fragmentteja – 800 bp pituus, joka on ihanteellinen analyysiin.
    Klikkaa tästä saadaksesi lisätietoja ultraäänen homogenisaattoreista DNA-pirstoutumiseen!

    Kirjallisuus / Referenssit


    Korkean suorituskyvyn ultraääni! Hielscherin tuotevalikoima kattaa koko spektrin kompaktista laboratorion ultraäänilaitteesta penkki-top-yksiköihin täysteollisiin ultraäänijärjestelmiin.

    Hielscher Ultrasonics valmistaa korkealaatuisia ultraäänihomygenisoijia laboratorio että teollisen koon mukaan.


    Keskustelemme mielellämme prosessistanne.

    Otetaan yhteyttä.