E. coli -bakteerien ultraäänilyysi

E. coli -bakteerit ovat mikrobiologiassa ja bioteknologiassa yleisimmin käytettyjä bakteereja.
Ultraääneen perustuvat solunhajottimet tuottavat luotettavia ja toistettavia tuloksia E. coli -bakteerien lyysissä.
Voimakas mutta tarkasti hallittava kavitaatio ja leikkausvoimat saavat aikaan täydellisen hajotuksen ja suuren uuttosaannon (esim. proteiinit, DNA).

Miksi E. coli -solujen ultraäänihajotus on ensisijainen menetelmä?

Ultraäänihomogenisaattorit eli anturityyppiset ultraäänilaitteet tarjoavat useita etuja E. coli -bakteerien lyysissä, sillä voimakas ultraääni hajottaa tehokkaasti soluseinät ja solukalvot. Anturityyppisiä ultraäänilaitteita käytetään laajalti E. coli -bakteerien lyysiin seuraavista syistä:

Soluseinien tehokas hajotus: E. coli -bakteerilla on puolijäykkä, peptidoglykaanista koostuva soluseinä, jota voi olla vaikea hajottaa perinteisillä lyysimenetelmillä. Anturityyppinen ultraäänilaite tuottaa voimakkaita ultraääniaaltoja, jotka muodostavat kavitaatiokuplia soluja ympäröivään nesteeseen. Kun nämä kuplat luhistuvat, ne synnyttävät nopeita nestesuihkuja ja iskuaaltoja, jotka hajottavat soluseiniä mekaanisesti ja vapauttavat tehokkaasti solujen sisältöä, kuten biomolekyylejä.

Parempi tunkeutuminen: Anturin / sonotrodin tuottamat ultraääniaallot voivat tunkeutua syvälle näytteeseen, saavuttaa suuremman määrän E. coli -soluja ja käsitellä niitä tasaisesti. Tämä auttaa varmistamaan, että lyysi tapahtuu tasaisemmin koko näytteessä, jolloin solujen hajotuksen tehokkuus paranee.

Lyhyempi käsittelyaika: Anturityyppisen ultraäänilaitteen välittämä energia on hyvin keskittynyttä ja paikallista, mikä johtaa nopeaan ja tehokkaaseen solulyysiin. Verrattuna muihin menetelmiin, kuten kuulahajotukseen tai entsymaattiseen lyysiin, ultraäänikäsittelyllä voidaan saavuttaa E. coli -bakteerien lyysi minuuteissa tai jopa sekunneissa. Monet vaihtoehtoiset tekniikat, kuten jäädytys ja sulatus, vaativat useita käsittelykierroksia, kun taas ultraäänilyysi avaa solut yhdellä prosessivaiheella.

Lämpötilan hallinta: Uusinta tekniikkaa edustavissa ultraäänilaitteissa on lämpötila-anturit ja älykäs ohjelmisto, jolla voidaan asettaa prosessin enimmäislämpötila. Ultraäänilaite keskeyttää käsittelyn automaattisesti, kun lämpötilaraja saavutetaan, ja käynnistää ultraäänikäsittelyn, kun asetettu lämpötila saavutetaan. Näytteiden jäähdyttäminen jäähauteessa on yksinkertainen tapa pitää näytteen lämpötila alhaisena ja estää lämmön aiheuttama näytteen hajoaminen.

Skaalautuvuus: Anturityyppisiä ultraäänilaitteita on saatavana eri kokoisina käsikäyttöisistä laitteista suuren mittakaavan teollisuusmalleihin. Siksi ne soveltuvat pienten tilavuuksien käsittelyyn laboratoriossa tai mittakaavan kasvattamiseen suurempia bioprosessointisovelluksia, kuten rokotetuotantoa tai molekyylien biosynteesiä, varten.

Monipuolisuus: Ultraäänilaitteita voidaan käyttää solulyysin lisäksi moniin sovelluksiin, kuten DNA:n katkomiseen leikkausvoimilla, proteiinien uuttoon, kudosten homogenointiin, nanohiukkasten dispergointiin ja emulgointiin. Siksi investointi anturityyppiseen ultraäänilaitteeseen lisää tutkimus- tai teollisuusympäristön monipuolisuutta.

Anturityyppiset ultraäänilaitteet, kuten UP200St, ovat luotettavia kudoshomogenisaattoreita ja solunhajottimia, ja siksi niitä käytetään laajalti näytteiden valmisteluun genetiikassa, esimerkiksi E. coli -bakteerien lyysiin

Proteiinien uutto E. coli -soluista toteutetaan tehokkaasti käyttäen ultraäänianturia UP200St

Anturityyppinen ultraäänilaite tarjoaa monia etuja E. coli -bakteerien lyysissä. Ultraääniprosessin parametrien luotettava ja tarkka hallinta mahdollistaa toimintaparametrien, kuten tehon, keston ja näytteenkäsittelyn, optimoinnin haluttujen tulosten saavuttamiseksi.

Tässä opastusvideossa kerrotaan, millainen ultraäänilaite soveltuu parhaiten näytteenkäsittelytehtäviin, kuten lyysiin, solujen hajottamiseen, proteiinien eristämiseen sekä DNA:n ja RNA:n fragmentointiin laboratorioissa, analytiikassa ja tutkimuksessa. Valitse laitetyyppi käyttökohteen, näytetilavuuden, näytemäärän ja käsittelykapasiteetin mukaan. Hielscher Ultrasonics tarjoaa tarpeisiinne ihanteellisen ultraäänihomogenisaattorin!

DNA:n ultraäänifragmentointia käytetään usein näytteiden valmisteluvaiheena seuraavan sukupolven sekvensoinnissa (NGS)

E. coli EDL933 -bakteerin genomisen DNA:n elektroforeettiset analyysit 0–15 min kestäneen ultraäänikäsittelyn jälkeen. L tarkoittaa DNA-kokostandardia.
(tutkimus ja kuva: ©Basselet et al. 2008)

Solujen hajotus ultraäänikavitaatiolla

Anturityyppiset ultraäänihomogenisaattorit toimivat noin 20 000 värähdyksen sekuntitaajuudella (20 kHz) ja aiheuttavat kavitaatiota nesteissä tai suspensioissa. Akustinen kavitaatio synnyttää mikroskooppisia alueita, joissa vallitsee tyhjiötä muistuttava paine ja korkea lämpötila ja jotka repivät soluja hajalle. Vaikka lämpötilat voivat nousta useisiin tuhansiin celsiusasteisiin, kavitaatioalueiden tilavuudet ovat niin pieniä, etteivät ne lämmitä prosessia merkittävästi. Ultraäänen synnyttämä akustinen kavitaatio ja leikkausvoimat puhkaisevat tai rikkovat bakteerisolujen, kuten E.coli -solujen, solukalvon. Hielscher mahdollistaa ultraäänilaitteillaan prosessiparametrien, kuten ultraäänen intensiteetin, amplitudin, syötetyn energian ja lämpötilan, tarkan hallinnan. Näin ultraäänilyysiprosessi voidaan sovittaa optimaalisesti solutyyppiin, soluviljelmään ja prosessin tavoitteeseen.

Ultraäänilyysin edut

lyysin tarkka hallinta (intensiteetti, amplitudi, lämpötila)
luotettavat, toistettavat tulokset
optimaalinen sovitus tiettyihin näytteisiin
lämpötilan hallinta
hyvin pienille ja hyvin suurille näytteille (µL:sta litroihin)
puhtaasti mekaaninen käsittely
käyttäjäystävällinen, turvallinen käyttö
lineaarinen mittakaavan kasvattaminen laboratoriosta tuotantoon

Ultraäänilaite VialTweeter mahdollistaa jopa 10 näytepullon näytteiden samanaikaisen valmistelun samoissa prosessiolosuhteissa. (Suurenna napsauttamalla!)

VialTweeter ultraäänilyysiin

Ultraäänihomogenisaattori verrattuna muihin lyysitekniikoihin

Kemiallinen ja entsymaattinen lyysi voivat olla ongelmallisia – kemiallinen lyysi voi muuttaa proteiinirakenteita ja aiheuttaa puhdistusongelmia, ja entsymaattinen lyysi vaatii pitkiä inkubointiaikoja eikä ole toistettava – mutta ultraäänihajotus on kehittynyt ja nopea solujen hajotusmenetelmä.
Ultraäänilyysi perustuu ainoastaan mekaanisiin voimiin. Kemikaaleja ei lisätä, vaan ultraäänikäsittely rikkoo soluseinän leikkausvoimien avulla. Kemiallinen lyysi voi muuttaa proteiinirakennetta ja aiheuttaa puhdistusongelmia. Entsymaattinen hajotus vaatii pitkiä inkubointiaikoja eikä ole toistettava. E.coli -bakteerisolujen ultraäänihajotus on nopeaa, yksinkertaista, luotettavaa ja toistettavaa. Siksi Hielscher tarjoaa ultraäänilaitteita, joita käytetään biologisissa ja biokemiallisissa laboratorioissa ympäri maailmaa näytteiden valmisteluun, preanalytiikkaan, in vitro -diagnostiikkaan ja monenlaisiin määrityksiin.

Yleisiä suosituksia ultraäänilyysiin

Ultraäänikäsittely on suosituin tekniikka hyvin pienten, keskisuurten ja suurten solususpensiomäärien lyysiin – pikolitroista jopa 100L/hr asti (käyttäen ultraäänivirtauskennoa). Solut hajotetaan nesteen leikkausvoimien ja kavitaation avulla. Myös DNA katkeaa leikkausvoimien vaikutuksesta ultraäänikäsittelyn aikana, joten solususpensioon ei tarvitse lisätä DNaasia.

Lämpötilan hallinta E. coli -bakteerien ultraäänilyysin aikana
Näytteen lämmön aiheuttama hajoaminen voidaan helposti estää esijäähdyttämällä näyte ja pitämällä sitä jäällä ultraäänikäsittelyn aikana.
Ihannetapauksessa näytteet tulisi pitää jääkylminä lyysin aikana, mutta useimmille näytteille riittää, ettei lämpötila nouse viljelmän tai lähtökudoksen lämpötilaa korkeammaksi. Siksi suositellaan suspension pitämistä jäällä ja käsittelyä useilla lyhyillä, 5–10 sec kestävillä ultraäänipulsseilla, joiden välissä pidetään 10–30 sec tauot. Taukojen aikana lämpö pääsee poistumaan, jolloin alhainen lämpötila palautuu. Suurempia solunäytteitä varten on saatavana erilaisia jäähdytysvaipalla varustettuja virtauskennoreaktoreita.
Lue täältä yksityiskohtaisia vinkkejä ja suosituksia onnistuneeseen ultraäänilyysiin!

Menetelmäohjeita E. coli -lysaattien valmistukseen ultraäänellä

Tutkijat käyttävät Hielscher Ultrasonics -yrityksen ultraäänihomogenisaattoreita E.coli -solujen hajotukseen. Alta löydät erilaisia testattuja ja toimiviksi osoitettuja menetelmäohjeita E.coli -bakteerien lyysiin Hielscher Ultrasonics -yrityksen ultraäänihomogenisaattoreilla erilaisissa E. coli -bakteeriin liittyvissä sovelluksissa.

Solujen kasvatus, ristisilloitus ja E. coli -solu-uutteiden valmistus ultraäänellä

SeqA:n ja RNA-polymeraasin ChIP-Chip-analyysiä varten E. coli MG1655- tai MG1655 ΔseqA -bakteereja kasvatettiin 37°C:ssa, kunnes OD₆₀₀ -arvo oli noin 0,15, 50 ml:ssa LB-elatusainetta (+ 0,2% glukoosia), minkä jälkeen lisättiin 27 μl formaldehydiä (37%) kutakin elatusaineen ml:aa kohti (loppupitoisuus 1%). Ristisilloitus tehtiin hitaasti ravistellen (100 rpm) huoneenlämmössä 20 min ajan, minkä jälkeen reaktio pysäytettiin lisäämällä 10 ml 2,5 M glysiiniä (loppupitoisuus 0,5 M). Lämpösokkikokeita varten E. coli MG1655 -bakteereja kasvatettiin 65 ml:ssa LB-elatusainetta 30°C:ssa, kunnes OD₆₀₀ -arvo oli noin 0,3. Tämän jälkeen 30 ml viljelmää siirrettiin 43 °C:seen esilämmitettyyn pulloon ja loppuosa pidettiin 30 °C:ssa. Ristisilloitus ja reaktion pysäytys tehtiin edellä kuvatulla tavalla, paitsi että soluja pidettiin 30 tai 43 °C:ssa 5 min ajan ennen hidasta ravistelua huoneenlämmössä. Solut kerättiin sentrifugoimalla ja pestiin kahdesti kylmällä TBS:llä (pH 7,5). Solut suspendoitiin uudelleen 1 ml:aan lyysipuskuria (10 mM Tris (pH 8,0), 20% sakkaroosia, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lysotsyymiä) ja inkuboitiin 37 °C:ssa 30 min ajan, minkä jälkeen lisättiin 4 ml IP-puskuria. Sen jälkeen soluja käsiteltiin jäällä ultraäänellä 12 kertaa 30 sec ajan pitäen 30 sec tauot ja käyttäen Hielscher UP400St -ultraääniprosessoria 100%:n tehoasetuksella. Sentrifugoinnin jälkeen (10 min, 9000 g) supernatantin 800 μl:n osanäytteet säilytettiin -20 °C:ssa. (Waldminghaus 2010)

Entsyymien ylituotanto ja puhdistus ultraäänianturilla

Dekahistidiini (His10) -merkittyjen proteiinien ylituotantoa varten E. coli BL21(DE3) -bakteerit transformoitiin pET19b-konstrukteilla. Yön yli kasvatettu esiviljelmä kerättiin sentrifugoimalla, ja siitä 1% käytettiin ekspressioviljelmän ymppäämiseen. pET19mgtB:tä kantavia soluja kasvatettiin 22°C:ssa, kunnes optinen tiheys 600 nm:ssä (OD600) oli 0,7. Viljelmä siirrettiin 17°C:seen ja indusoitiin 100 μM IPTG:llä. 16 h kuluttua viljelmä kerättiin sentrifugoimalla 7 500 × g:ssä 4°C:ssa. Solut suspendoitiin uudelleen 50 mM fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS), joka sisälsi 0,3 M NaCl:a ja jonka pH oli 7,4, ja hajotettiin ultraäänikäsittelyllä käyttäen Hielscher UP200St -ultraäänilaitteeseen liitettyä S2-mikrokärkisonotrodia syklillä 0,5 ja 75%:n amplitudilla.
Dekahistidiinimerkityn GtfC:n ylituotanto indusoitiin 37°C:ssa, kun OD₆₀₀ -arvo oli 0,6, käyttäen 100 μM IPTG:tä. Soluja inkuboitiin sitten 4 h ajan, kerättiin ja hajotettiin lyysillä kuten edellä MgtB:n kohdalla.
Raakasolu-uutteet sentrifugoitiin 15 000 × g:ssä ja 4°C:ssa solujätteen sedimentoimiseksi. Kirkastetut uutteet ladattiin 1 ml:n HisTrap FF Crude -kolonneihin ÄKTAprime Plus -järjestelmällä. Entsyymit puhdistettiin valmistajan His-merkittyjen proteiinien gradienttieluutiota koskevan menetelmäohjeen mukaisesti. Eluoidut proteiiniliuokset dialysoitiin kahdesti 1 000-kertaista tilavuutta vastaan 50 mM PBS:ää, jonka pH oli 7,4 ja joka sisälsi 0,3 M NaCl:a, 4°C:ssa. Puhdistusta analysoitiin 12% SDS-PAGE:lla. Proteiinipitoisuus määritettiin Bradfordin menetelmällä käyttäen Roti-Quant-valmistetta. (Rabausch et al. 2013)

Proteiinien ultraääniuutto E. coli -bakteereista
Tutkittava syöttiproteiini (tässä tapauksessa Arabidopsis thaliana -kasvin MTV1) liitetään GST-merkkiin ja tuotetaan BL21 Escherichia coli (E. coli) -soluissa.

Ota yksi GST-MTV1-pelletti ja yksi GST-pelletti (jotka vastaavat 50 ml:n bakteeriviljelmää) ja suspendoi kumpikin uudelleen 2,5 mL:aan jääkylmää uuttopuskuria.
Käytä ultraäänilaitetta UP100H (joka on varustettu MS3 -mikrokärkisonotrodilla pieniä, noin 2–5 mL:n tilavuuksia varten) bakteerisolujen hajottamiseen, kunnes ne ovat lysoituneet, mikä ilmenee sameuden vähenemisenä ja viskositeetin kasvuna. Tämä on tehtävä jäällä, ja ultraäänikäsittelyä suositellaan tehtäväksi jaksoittain (esim. 10 sec ultraäänikäsittelyä, sitten 10 sec tauko jäällä ja niin edelleen). On varottava käyttämästä liian suurta ultraäänikäsittelyn intensiteettiä. Jos havaitaan vaahtoamista tai valkoisen saostuman muodostumista, intensiteettiä on pienennettävä.
Siirrä lysoitunut bakteeriliuos 1,5 mL:n mikrosentrifugiputkiin ja sentrifugoi 4°C:ssa, 16 000 x g:ssä 20 min ajan.

Ultraäänianturit hyödyntävät akustisen kavitaation voimia solujen hajottamiseen sekä molekyylien ja DNA:n uuttamiseen E. coli -bakteereista.

Anturityyppiset ultraäänilaitteet, kuten UP400St, hyödyntävät akustisen kavitaation toimintaperiaatetta E. coli -bakteerien tehokkaassa lyysissä.

Rekombinanttiproteiinin ekspressioanalyysi ja puhdistus ultraäänikäsittelyllä

E. coli -pelletti käsiteltiin ultraäänellä Hielscher UP100H -ultraäänilaitteella. Tätä varten solupelletti suspendoitiin uudelleen jäähdytettyyn lyysipuskuriin (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) ja jäähdytettiin jäällä 10 min ajan. Sen jälkeen solususpensiota käsiteltiin ultraäänellä 10 lyhyellä, 10 s kestävällä pulssilla, joiden jälkeen pidettiin 30 s tauko jäähdytystä varten. Lopuksi solujäte poistettiin ultrasentrifugoimalla 4°C:ssa 15 min ajan 14 000 rpm:n nopeudella. rPR:n ekspression varmistamiseksi supernatantti ajettiin 12% polyakryyliamidigeelillä ja analysoitiin SDS-PAGE:lla ja Western blot -menetelmällä. rPR puhdistettiin Ni2+-NTA-hartsilla (Invitrogen, USA) valmistajan ohjeen mukaisesti. Tässä vaiheessa käytettiin natiivia puhdistusmenetelmää. Puhdistetun proteiinin puhtaus arvioitiin elektroforeesilla 12% polyakryyliamidigeelillä ja sitä seuranneella Coomassie-sinivärjäyksellä. Puhdistetun proteiinin pitoisuus mitattiin Micro BCA -proteiinimäärityspakkauksella (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al. 2016)

Videolla esitellään 200 watin ultraäänikuppisonotrodi laboratorionäytteiden dispergointiin, homogenointiin, uuttoon ja kaasunpoistoon.

Ultraäänihomogenisaattorit E. coli -bakteerien lyysiin

Hielscher Ultrasonics suunnittelee, valmistaa ja toimittaa suorituskykyisiä ultraäänihomogenisaattoreita E. coli -bakteerien sekä muiden solutyyppien, kudosten ja soluviljelmien luotettavaan ja tehokkaaseen lyysiin.
Laaja ultraäänianturien ja epäsuorien ultraäänikäsittelyjärjestelmien valikoima mahdollistaa ihanteellisen ultraäänikudoshomogenisaattorin tarjoamisen solujen hajotus- ja uuttosovellukseesi.

Suunnittelu, valmistus ja konsultointi – Saksassa valmistettua laatua

Hielscher tunnetaan ultraäänilaitteidensa korkeimmista laatu- ja suunnittelustandardeista. Älykäs ohjelmisto, intuitiivinen valikko, ohjelmoitavat asetukset ja automaattinen tietojen kirjaaminen ovat vain muutamia ultraäänilaitteiden ominaisuuksista, joita Hielscher tarjoaa. Kestävyys ja helppokäyttöisyys mahdollistavat ultraäänilaitteidemme sujuvan integroinnin tutkimus- ja biotekniikkalaitoksiin. Hielscher tarjoaa ultraäänilaitteita, jotka selviytyvät helposti myös ankarista olosuhteista ja vaativista ympäristöistä.

Hielscher Ultrasonics on ISO-sertifioitu yritys, joka painottaa erityisesti suorituskykyisiä ultraäänilaitteita, joissa yhdistyvät uusin tekniikka ja käyttäjäystävällisyys. Hielscher tarjoaa luonnollisesti ultraäänilaitteita, jotka ovat CE-vaatimusten mukaisia ja täyttävät UL:n, CSA:n ja RoHs:n vaatimukset.

Alla oleva taulukko antaa käsityksen ultraäänilaitteidemme likimääräisestä käsittelykapasiteetista:

Erätilavuus	Tilavuusvirta	Suositellut laitteet
monikuoppa- / mikrotiitterilevyt	n.a.	UIP400MTP
CupHorn näytepulloille tai dekantterilasille	n.a.	Ultraäänilaite CupHorn
ultraääneen perustuva mikrovirtausreaktori	n.a.	GDmini2
jopa 10 näytepulloa, joissa on 0,5–1,5mL	n.a.	VialTweeter
0,5–1,5mL	n.a.	VialTweeter
1–500mL	10–200mL/min	UP100H
10–2000 mL	20–400mL/min	UP200Ht, UP400St
0,1–20L	0,2–4L/min	UIP2000hdT
10–100L	2–10L/min	UIP4000
n.a.	10–100L/min	UIP16000
n.a.	suurempi	laiteryhmä, jossa on UIP16000

Ota yhteyttä! / Kysy meiltä!

Videolla esitellään ultraääninäytteenkäsittelyjärjestelmä UIP400MTP, joka mahdollistaa näytteiden luotettavan käsittelyn kaikilla vakiomallisilla monikuoppalevyillä voimakkaan ultraäänen avulla. UIP400MTP:n tyypillisiä käyttökohteita ovat solulyysi, DNA:n, RNA:n ja kromatiinin pilkkominen sekä proteiinien uutto.

Lisää menetelmäohjeita E. coli -bakteerien ultraäänilyysiin

Allisiinilla muokatut proteiinit E. coli -bakteereissa ultraäänilaitetta VialTweeter käyttäen

Sulfhydryylipitoisuuksien määritys 5,5′-ditiobis(2-nitrobentsoehappo) (DTNB) -määrityksellä
Yön yli kasvatettua E. coli MG1655 -viljelmää käytettiin MOPS-minimielatusaineen ymppäämiseen (1:100). Viljelmää kasvatettiin aerobisesti, kunnes A600-arvo oli 0,4. Viljelmä jaettiin kolmeen 15 ml:n viljelmään stressikäsittelyä varten. Käsittelemätön viljelmä toimi negatiivisena kontrollina. Toiseen jäljellä olevista kahdesta viljelmästä lisättiin 0,79 mM allisiinia (128 μg ml-1) ja toiseen 1 mM diamidia. Viljelmiä inkuboitiin 15 min ajan. Kustakin viljelmästä kerättiin 5 ml sentrifugoimalla (8 525 × g, 4°C, 10 min). Solut pestiin kahdesti 1 ml:lla PBS:ää (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, säilytetty anaerobisesti ennen käyttöä) ja sentrifugoitiin (13 000 × g, 4°C, 10 min). Solut suspendoitiin uudelleen lyysipuskuriin (PBS, joka sisälsi 6 mM guanidinium-HCl:a, pH 7,4) ennen hajotusta 4°C:ssa ultraäänikäsittelyllä (VialTweeter -ultraäänilaite, Hielscher GmbH, Saksa) (3 × 1 min). Solujäte pelletoitiin sentrifugoimalla (13 000 × g, 4 °C, 15 min). Supernatantti siirrettiin 3,5 ml:n QS-makrokyvettiin (10 mm), jossa oli magneettisekoitussauva, ja sekoitettiin 1 ml:aan lyysipuskuria. Näytteiden absorbanssia seurattiin 412 nm:ssä Jasco V-650 -spektrofotometrillä, joka oli varustettu lämpötilasäädetyllä PSC-718-kyvettipidikkeellä, huoneenlämmössä. Lisättiin 100μl 3 mM ditiobis(2-nitrobentsoehappo)liuosta. Absorbanssia seurattiin, kunnes se saavutti kyllästymistason. Tiolipitoisuus laskettiin käyttäen absorptiokerrointa ϵ₄₁₂ = 13 700 M^-1 cm^-1 tio-2-nitrobentsoehapolle (TNB). Solujen tiolipitoisuudet laskettiin käyttämällä E. coli -solujen tilavuutena 6,7 × 10^-15 litraa ja solutiheytenä A600 = 0,5 (vastaa 1 × 10⁸ solua ml^-1 viljelmää). (Müller et al. 2016)

Glutationin määritys in vivo ultraääneen perustuvalla solunhajottimella

E. coli MG1655 -bakteereja kasvatettiin MOPS-minimielatusaineessa 200ml:n kokonaistilavuudessa, kunnes A600-arvo oli 0,5. Viljelmä jaettiin 50 ml:n viljelmiin stressikäsittelyä varten. Kun soluja oli inkuboitu 15 min ajan 0,79 mM allisiinin, 1 mM diamidin tai dimetyylisulfoksidin (kontrolli) kanssa, ne kerättiin 4 000g:ssä 4°C:ssa 10 min ajan. Solut pestiin kahdesti KPE-puskurilla ennen pellettien uudelleensuspendointia 700µl:aan KPE-puskuria. Proteiinien poistamiseksi lisättiin 300l 10% (w/v) sulfosalisyylihappoa ennen solujen hajotusta ultraäänikäsittelyllä (3 x 1 min; VialTweeter -ultraäänilaite). Supernatantit kerättiin sentrifugoinnin jälkeen (30 min, 13 000g, 4°C). Sulfosalisyylihappopitoisuudet pienennettiin 1%:iin lisäämällä 3 tilavuusosaa KPE-puskuria. Kokonaisglutationin ja GSSG:n mittaukset tehtiin edellä kuvatulla tavalla. Solujen glutationipitoisuudet laskettiin käyttämällä E. coli -solujen tilavuutena 6,7×10^-15 litraa ja solutiheytenä A600 0,5 (vastaa 1×10⁸ solua ml^-1 viljelmää). GSH-pitoisuudet laskettiin vähentämällä 2[GSSG] kokonaisglutationista. (Müller et al. 2016)

Ihmisen mAspAT:n ekspressio E. coli -bakteereissa ultraäänihomogenisaattoria käyttäen

Yksittäinen ekspressiovektoria kantava E. coli BL21 (DE3) -pesäke siirrettiin 30 mL:aan Luria-Bertani (LB) -elatusainetta, joka sisälsi 100μg/mL ampisilliinia, ja sitä kasvatettiin sitten 37ºC:ssa, kunnes optinen tiheys (OD₆₀₀) saavutti arvon 0,6. Solut kerättiin sentrifugoimalla 4 000 × g:ssä 10 min ajan ja suspendoitiin uudelleen 3L:aan tuoretta LB-elatusainetta, joka sisälsi 100μg/mL ampisilliinia.
Tämän jälkeen proteiiniekspressio indusoitiin 1 mM isopropyyli-β-ᴅ-1-tiogalaktopyranosidilla (IPTG) 20 h ajan 16ºC:ssa. Solut kerättiin sentrifugoimalla 8 000 × g:ssä 15 min ajan ja pestiin puskurilla A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). 3 L:n viljelmästä saatiin noin 45g soluja (märkäpaino). Sentrifugoinnin jälkeen solupelletit suspendoitiin uudelleen 40 mL:aan (1 L:n viljelmää kohti) jääkylmää uuttopuskuria A ja hajotettiin lyysillä käyttäen ultraäänikäsittelyä jääkylmässä lämpötilassa Hielscher UP400St -ultraäänisolunhajottimella. Solulysaatti sentrifugoitiin 12 000 rpm:n nopeudella 15 min ajan liukoisen (supernatantti) ja saostuneen (pelletti) fraktion erottamiseksi. (Jiang et al. 2015)

Liittyvät aiheet

Hyödyllisiä tietoja

E. coli

Escherichia coli (E. coli) on Escherichia-sukuun kuuluva gramnegatiivinen, fakultatiivisesti anaerobinen, sauvamainen koliforminen bakteeri, jota tavataan yleisesti tasalämpöisten eliöiden (endotermien) suoliston alaosassa. E. coli -kantoja (tai alatyyppejä) on suuri määrä, ja niillä on erilaisia ominaisuuksia. Useimmat E. coli -kannat ovat ihmiselle vaarattomia, esimerkiksi B- ja K-12-kannat, joita käytetään yleisesti laboratorioiden tutkimussovelluksissa. Jotkin kannat ovat kuitenkin haitallisia ja voivat aiheuttaa vakavia sairauksia.
E. coli on tärkeässä roolissa nykyaikaisessa biologisessa tekniikassa ja teollisessa mikrobiologiassa, koska bakteeria on helppo muokata. Yleisiä laboratoriosovelluksia, joissa E. coli -bakteereja usein käytetään, ovat esimerkiksi rekombinanttideoksiribonukleiinihapon (DNA) tuottaminen ja käyttö malliorganismina.
E. coli on erittäin monipuolinen isäntä heterologisten proteiinien tuotantoon, ja rekombinanttiproteiinien tuottamiseen E. coli -bakteereissa on saatavana monenlaisia proteiiniekspressiojärjestelmiä. Käyttämällä plasmideja, jotka mahdollistavat proteiinien korkean ekspressiotason, bakteereihin voidaan siirtää geenejä, mikä mahdollistaa tällaisten proteiinien tuottamisen suurina määrinä teollisissa fermentointiprosesseissa.
E. coli -bakteereja käytetään solutehtaina insuliinin tuottamiseen. Muita sovelluksia ovat muokattujen E. coli -solujen käyttö rokotteiden ja immobilisoitujen entsyymien kehittämiseen ja tuottamiseen, biopolttoaineiden tuottamiseen sekä bioremediaatioon.
K-12-kanta on E. coli -bakteerin mutanttimuoto, joka yliekspressoi alkalista fosfataasia (ALP). Tämä mutaatio johtuu viasta geenissä, joka koodaa entsyymiä jatkuvasti. Jos geeni tuottaa tuotetta ilman mitään estoa, tätä kutsutaan konstitutiiviseksi aktiivisuudeksi. Tätä erityistä mutanttimuotoa käytetään ALP-entsyymin eristämiseen ja puhdistamiseen.
E. coli -bakteereja käytetään myös laajalti solutehtaina. Muokattuja mikrobeja (esim. bakteereja) ja kasvisoluja voidaan käyttää niin sanottuina solutehtaina. Nämä geneettisesti muokatut solut tuottavat molekyylejä, kemikaaleja, polymeerejä, proteiineja ja muita aineita, joita käytetään esimerkiksi lääke-, elintarvike- ja kemianteollisuudessa. Tällaisten bioteknisesti muokattujen solujen sisällä tuotettujen molekyylien vapauttamiseksi ultraäänilyysi on yleinen menetelmä, jolla hajotetaan soluseinät ja siirretään kohdeaineet ympäröivään nesteeseen. Lue lisää bioteknisesti muokattujen solujen lyysistä!

DNA:n katkominen ultraäänen leikkausvoimilla

Ultraäänen leikkausvoimat ovat yleisesti käytetty keino vapauttaa molekyylejä, soluelimiä ja proteiineja solun sisältä sekä katkoa DNA-juosteita osiin. Akustinen kavitaatio rikkoo soluseinät ja solukalvot DNA:n uuttamiseksi soluista ja tuottaa noin 600–800 bp:n pituisia fragmentteja, mikä on ihanteellista analyysiä varten.
Napsauta tästä ja lue lisää DNA:n fragmentointiin tarkoitetuista ultraäänihomogenisaattoreista!

Kirjallisuus / lähteet

Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.

Suorituskykyistä ultraäänitekniikkaa! Hielscher tarjoaa tuotevalikoiman, joka kattaa koko kirjon kompaktista laboratorion ultraäänilaitteesta pöytälaitteisiin ja täyden teollisuusmittakaavan ultraäänijärjestelmiin.

Hielscher Ultrasonics valmistaa suorituskykyisiä ultraäänihomogenisaattoreita laboratoriomittakaavasta aina teolliseen mittakaavaan.