Hielscher Ultra ääni tekniikka

E. Colin ultraääni-lyysi

  • E. coli -bakteerit ovat mikrobiologian ja bioteknologian yleisimmin käytetyt bakteerit.
  • Ultraäänisolun haitta-aineet tuottavat luotettavia ja toistettavia tuloksia E. colin hajoamiseen.
  • Voimakas, mutta tarkasti hallittavissa oleva kavitaatio- ja leikkausvoimat aiheuttavat täydellisen häiriön ja suuret uuttotuotokset (esim. Proteiinit, DNA).

Kondensaation soluhäiriö

Escherichia coli -bakteerit luotettavasti hajotetaan käyttäen ultraäänikudossovegeneraattoreita.Ultraäänitutkityyppiset homogenisaattorit toimivat n. 20 000 sekuntia sekunnissa (20 kHz: ssä) ja aiheuttavat kavitaatiota nesteissä tai sumuissa. Akustiset kavitaation mikroskooppiset alueet tyhjiöisiä paineita ja korkeita lämpötiloja, jotka repivät soluja erilleen. Vaikka lämpötilat voivat nousta useita tuhansia astetta, kavitaatiomäärät ovat niin pieniä, etteivät ne lämmitä prosessia merkittävästi. Ultrasta muodostettu akustinen kavitaatio ja leikkausvoimat rei'ittävät tai rikkovat E.colin solumembraania – riippuen ultraäänen homogenisaattorin asetuksesta.

Edut Ultrasonic Lysis

  • täsmällinen lyysihallinta (intensiteetti, amplitudi, lämpötila)
  • optimaalinen mukautuminen tiettyihin näytteisiin
  • lämpötilan säätö
  • hyvin pienille tai erittäin suurille näytteille (μL - litra)
  • puhdasta mekaanista käsittelyä
  • lineaarinen asteikko laboratorioista tuotantoon
Ultraäänilaite VialTweeter mahdollistaa samanaikaisen näytteen valmistamisen jopa 10 injektiopulloon samassa prosessiohjelmassa. (Klikkaa suurentaaksesi!)

VialTweeter ultraäänilaitoksen osalta

Informaatio pyyntö




Huomaa, että Tietosuojakäytäntö.


Vaikka kemiallinen ja entsyymivaikutus voi olla ongelmallinen – koska kemiallinen hajotus voi muuttaa proteiinirakenteita ja ottaa käyttöön puhdistusongelmia ja entsymaattinen hajotus vaatii pitkiä inkubointiaikoja eikä se ole toistettavissa – ultraäänihäiriö on hienostunut, nopea solujen hajotusmenetelmä.
Ultraäänilyysi perustuu vain mekaanisiin voimiin. Kemikaaleja ei lisätä, sonikaatio rikkoo solun seinämän leikkausvoimilla. Kemiallinen lyysi voi muuttaa proteiinirakennetta ja aiheuttaa puhdistusongelmia. Entsymaattinen häiriö vaatii pitkiä itämisaikoja, eikä se ole toistettavissa. E.coli-bakteerisolujen ultraäänisolujen häiriöt ovat nopeita, yksinkertaisia, luotettavia ja toistettavissa. Siksi Hielscher-ultraääniainteja käytetään biologisissa ja biokemiallisissa laboratorioissa ympäri maailmaa näytteiden valmistukseen, esiananlyytiikkaan, in vitro -diagonstiikkaan ja moninaisiin määrityksiin.

Yleiset suositukset

UP400St-ultraäänilaite, jossa virtausreaktoriSonication on suosituin tekniikka lysing hyvin pieniä, keskisuuria ja suuria määriä solujen suspensioita – pico-litrasta aina 100 litraan / tunti (käyttämällä ultraäänivirta-solua). Solut hajotetaan nestemäisellä leikkauksella ja kavitaatiolla. DNA myös leikataan sonikaation aikana, joten ei ole tarpeen lisätä DNaasia solususpensioon.
Lämpötilan säätö:
Esijäähdyttämällä näytettä ja pitämällä näytettä sonikaation aikana jäällä näytteen lämpötilan hajoaminen voidaan helposti estää.
Ihanne tapauksessa näytteet on pidettävä kylmänä lyysin aikana, mutta useimmille näytteille riittää, jos lämpö tila ei nouse kulttuurin tai kudos lähteen lämpö tilan yläpuolelle. Siksi on suositeltavaa, pitää jousitus jäällä ja sonikaatti useita lyhyitä Ultrasonics pulssin 5-10 sek ja taukoja 10-30 SEK. Aikana taukoja, lämpö voi hälventaa, jotta uudelleen luoda alhaiseen lämpö tilaan. Suuremmille solu näytteille on saatavilla erilaisia virtaus solu reaktoreita, joissa on jäähdytys vaippa.

E. coli-lysaattien valmistusprotokollat

Ekspressiosanalyysi ja puhdistus rekombinanttiproteiinista

E. colin pelletti sonikoitiin ultraäänisysteemillä UP100H (Hielscher). Tätä tarkoitusta varten solupelletti suspensoitiin uudelleen jäähdytettyyn lyysipuskuriin (50 mM Tris-HCl pH = 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) ja jäähdytettiin jäällä 10 min. Sitten solususpensiota sonikoitiin 10 lyhyen purskeen 10 s jälkeen, jonka jälkeen 30 sekunnin välein jäähdyttämistä varten. Lopuksi solujätteet poistettiin ultrasentrifugoimalla 4 ° C: ssa 15 minuutin ajan nopeudella 14000 rpm. RPR-ekspression vahvistamiseksi supernatantti ajettiin 12% polyakryyliamidigeelillä ja analysoitiin SDS-PAGE: lla ja Western-blottauksella. RPR: n puhdistus suoritettiin käyttämällä Ni: tä2 +-kirjain-NTA-hartsia (Invitrogen, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tässä vaiheessa käytettiin natiivia puhdistusmenetelmää. Puhdistetun proteiinin puhtaus arvioitiin käyttäen elektroforeesia 12% polyakryyliamidigeelillä ja sen jälkeen Coomassie blue -värjäyksellä. Puhdistettu proteiinipitoisuus mitattiin Micro BCA -proteiinimäärityspakkauksella (PIERCE, USA). (Azarnezhad et ai., 2016)

Ultraääni-solun hajotin UP100H (100W) lyysiä, solujen häiriöitä ja DNA leikkausta varten.

Ultrasonic homogenisaattori UP100H 100W

Solujen kasvu, silloittaminen ja E. coli -solujen uutteiden valmistus

SeqA: n ja RNA-polymeraasin ChIP-sirulle E. coli MG1655 tai MG1655 ΔseqA kasvatettiin 37 ° C: ssa OD: ksi600 noin 0,15 50 ml: ssa LB: tä (+ 0,2% glukoosia) ennen kuin lisättiin 27 pl formaldehydiä (37%) / ml elatusainetta (loppupitoisuus 1%). Silloittuminen suoritettiin hitaasti ravistellen (100 rpm) huoneenlämpötilassa 20 min, mitä seurasi sammutus 10 ml: lla 2,5 M glysiiniä (lopullinen pitoisuus 0,5 M). Lämpösokkakokeissa E. coli MG1655 kasvatettiin 65 ml: n LB-väliaineessa 30 ° C: ssa OD: ksi600 noin 0,3. Sen jälkeen 30 ml viljelmää siirrettiin esilämmitettyyn pulloon 43 ° C: ssa ja loput pidettiin 30 ° C: ssa. Silloittuminen ja sammutus olivat samoja kuin edellä kuvattiin, paitsi että soluja pidettiin 30 ° C: ssa tai 43 ° C: ssa 5 minuuttia ennen hidastusta vielä hitaammin huoneenlämpötilassa. Solut kerättiin sentrifugoimalla ja pestiin kahdesti kylmällä TBS: llä (pH 7,5). Uudelleen suspendoimisen jälkeen 1 ml: ssa lyysipuskuri (10 mM Tris (pH 8,0), 20% sakkaroosi, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg / ml lysotsyymi) ja inkubaatio 37 ° C: ssa 30 min, mitä seurasi 4 ml IP puskuria, soluja sonikoitiin jäillä 12 kertaa 30 sekuntia ja 30 sekuntia taukoja UP400St ultraääniprosessori (Hielscher Ultrasonics GmbH) 100% teholla. 10 minuutin jälkeen 9000 g: n sentrifugoinnin jälkeen 800 ui: n supernatanttitäytepitoisuuksia säilytettiin -20 ° C: ssa. (Waldminghaus 2010)

Entsyymien ylituotanto ja puhdistus.

Deakhistidiini (His10) -tagged -proteiinien ylituotantoa varten E. coli BL21 (DE3) transformoitiin pET19b-konstrukteilla. Yön yli esikulttuuri kerättiin sentrifugoimalla ja 1%: lla käytettiin ilmentämiskulttuurin inokuloimiseksi. Soluja, jotka kantavat pET19mgtB: tä, kasvatettiin 22 ° C: ssa, kunnes optinen tiheys 600 nm: ssä (OD600) 0,7. Viljelmä siirrettiin 17 ° C: seen ja indusoitui 100 uM IPTG: llä. 16 tunnin kuluttua viljelmä otettiin talteen sentrifugoimalla 7 500 x g: n lämpötilassa 4 ° C: ssa. Solut suspendoitiin uudelleen 50 mM fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS) 0,3 M NaCl: llä pH-arvossa 7,4 ja hajotettiin ultraääni käyttäen S2-mikrokärki sonotrodea UP200St ultrasonicator (Hielscher, Teltow, Saksa) 0,5 jakson ja 75%: n amplitudin.
Dekekistidiinilla merkityn GtfC: n ylituotanto indusoitui 37 ° C: ssa OD: ssa600 0,6, 100 uM IPTG: llä. Sitten soluja inkuboitiin 4 h, kerättiin ja hajotettiin MgtB: n mukaisesti.
Raakasolu- uutteita sentrifugoitiin 15 000 x g: n ja 4 ° C: n lämpötilassa sedimenttien sakkaamiseksi. Kirkastetut uutteet ladattiin 1 ml: n HisTrap FF Crude -pylväät käyttäen ÄKTAprime Plus -järjestelmää (GE Healthcare). Entsyymit puhdistettiin valmistajan protokollan mukaisesti His-merkittyjen proteiinien gradienttieluution suhteen. Eluoituja proteiiniliuoksia dialysoitiin kahdesti 1000 tilavuutta kohti 50 mM PBS: ää, pH 7,4, 0,3 M NaCl: lla 4 ° C: ssa. Puhdistaminen analysoitiin 12% SDS-PAGE: lla. Proteiinipitoisuus määritettiin Bradford-menetelmällä käyttäen Roti-Quantia (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Saksa). (Rabausch et ai., 2013)

Proteiinin uuttaminen E. coli -bakteereista
Kiinnostuksen kohteena oleva syötti-proteiini (tässä tapauksessa Arabidopsis thalianan MTV1) fuusioidaan GST-tagille ja ekspressoidaan BL21 Escherichia coli (E. coli) -soluissa.
1. Ota yksi GST-MTV1- ja GST-pelletti (vastaa 50 ml: n bakteeriviljelmää) ja suspendoidaan uudelleen kukin 2,5 ml: n jääkylmällä uutospuskurilla.
2. Käytä ultraääniääniä UP100H (varustettu pienikokoisilla MS3-mikrotip-sonotrodeilla (2-5 ml), jotta bakteerisolut häiritsevät, kunnes ne hajoavat, mikä on osoitettu pienentyneellä läpikuultavuudella ja viskositeetilla. Tämä on tehtävä jäällä, ja suosittelemme hiljentämään väliajoin (esim. 10 sekunnin sonikointi, jota seuraa 10 sekuntia jäällä ja niin edelleen). On huolehdittava siitä, että se ei särje liian voimakkaasti. Jos vaahtoamista tai valkoisen sakkauksen muodostumista havaitaan, intensiteettiä on alennettava.
3. Siirretään lysoidun bakteeriliuoksen 1,5 ml: n mikrocentrifugeputkiin ja sentrifugoidaan 4 ° C: ssa, 16 000 xg 20 minuutin ajan.

Alliinimodifioidut proteiinit E. colissa

VialTweeter on mukava ultronaattori pieneen näytteen homogenisointiinSulfhydryylisisällön määritys 5,5'-dithiobis (2-nitrobentsoehappo) (DTNB) -määrityksellä
E. coli MG1655 yön yli -viljelmää käytettiin MOPS-minimaalisen väliaineen (1: 100) inokulointiin. Viljelmää kasvatettiin aerobisesti, kunnes A600 oli 0,4. Viljelmä jaettiin kolmeen 15 ml: n viljelmään jännityskäsittelyä varten. Käsittelemätön kulttuuri toimi negatiivisena kontrollina. 0,79 mM allisiinia (128 pg ml-1) tai 1 mM diamidi lisättiin jompaankumpaan jäljellä olevasta kahdesta viljelmästä. Viljelmää inkuboitiin 15 minuutin ajan. 5 ml kutakin viljelmää kerättiin sentrifugoimalla (8,525 x g, 4 ° C, 10 min). Solut pestiin kahdesti 1 ml: lla PBS: ää (137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na2HKO4, 2 mM KH2Po4, pH 7,4, jotka on varastoitu anaerobisesti ennen käyttöä) ja sentrifugoidaan (13 000 x g, 4 ° C, 10 min). Solut suspendoitiin uudelleen lyysauspuskuriin (PBS 6 mM guanidinium HCI: llä, pH 7,4) ennen häiriöitä 4 ° C: ssa ultraääni (VialTweeter ultraääni, Hielscher GmbH, Saksa) (3 × 1 min). Solujätteet pelletoitiin sentrifugoimalla (13 000 x g, 4 ° C, 15 min). Supernatantti siirrettiin 3,5 ml: n QS-makro-kyvettiin (10 mm) magneettisella sekoittimella ja sekoitettiin 1 ml: n kanssa lyysipuskuria. Näytteiden lopettamista seurattiin 412 nm: ssä Jasco V-650-spektrofotometrillä, joka oli varustettu PSC-718-lämpötilasäädellyllä solupidikkeellä (Jasco) huoneenlämmössä. Lisättiin 100 ui 3 mM ditiobis (2-nitrobentsoehappo) liuosta. Häivyttämistä seurattiin, kunnes se saavutettiin kyllästymisellä. Tiolipitoisuuden laskeminen suoritettiin käyttämällä ekstinktiokerrointa ε412 = 13 700 M-1 Cm-1 tio-2-nitrobentsoehapolle (TNB). Cellulitioli pitoisuudet laskettiin perustuen 6,7 × 10 E. coli-solujen tilavuuteen-15 litra ja A-solutiheys600 = 0,5 (vastaa 1 × 108 solut ml-1 kulttuuri). (Müller et ai., 2016)

In vivo glutationin määrittäminen

E. coli MG1655 viljeltiin MOPS-minimaalisessa elatusaineessa kokonaistilavuudessa 200 ml, kunnes A: ta600 0,5 saavutettiin. Viljelmä jaettiin 50 ml: n viljelmiin jännityshoitoa varten. 15 minuutin inkubaation jälkeen 0,79 mM allisiinilla, 1 mM diamidilla tai dimetyylisulfoksidilla (kontrolli), solut kerättiin 4 000 g: ksi 4 ° C: ssa 10 minuutin ajan. Solut pestiin kahdesti KPE-puskurilla ennen pellettien uudelleen suspendointia 700 ui: ssa KPE-puskuria. Proteiininpoiston yhteydessä lisättiin 300 1 10% (paino / tilavuus) sulfosalisyylihappoa ennen solujen hajotusta ultraäänikaudella (3 x 1 min; VialTweeter ultraäänilaitteen). Supernatantit kerättiin sentrifugoinnin jälkeen (30 min, 13 000 g, 4 ° C). Sulfosalisyylihappopitoisuudet vähenivät 1 prosenttiin lisäämällä 3 tilavuusosaa KPE-puskuria. Glutationin ja GSSG: n mittaukset suoritettiin edellä kuvatulla tavalla. Solu-glutationi-pitoisuudet laskettiin perustuen 6,7: n E. coli-solujen tilavuuteen×10-15 litra ja A-solutiheys600 0.5 (vastaa 1×108 solut ml-1 kulttuuri). GSH-pitoisuudet laskettiin vähentämällä 2 [GSSG] kokonaisglutatsonista. (Müller et ai., 2016)

Ultrasonic-hajotin solujen hajottamiseen ja biologisen materiaalin louhintaan (Klikkaa nähdäksesi suuremmaksi!)

Probe-tyyppinen ultraäänilaitteen UP400St

Ihmisen mAspAT ilmentäminen E. colissa

Ultrasuurisolun häiriö UP400St (400 W) intrasellulaaristen aineiden uuttamiseen (esim. Proteiinit, organelit, DNA, RNA jne.)E. coli BL21: n (DE3) yksittäinen siirtomaa, joka sisälsi ekspressiovektoria 30 ml: ssa Luria-Bertani (LB) -alustaa, joka sisälsi 100 ug / ml ampisilliinia, ja viljeltiin sitten 37 ° C: ssa, kunnes optinen tiheys (OD600) saavutti 0,6. Solut kerättiin sentrifugoimalla 4 000 x g: llä 10 minuutin ajan ja suspendoitiin uudelleen 3 litraan tuoreeseen LB-alustaan, joka sisälsi 100 ug / ml ampisilliinia.
Tämän jälkeen proteiinin ilmentyminen indusoitiin 1 mM isopropyyli-P-1-tiogalaktopyranosidilla (IPTG) 20 h ajan 16 ° C: ssa. Solut kerättiin sentrifugoimalla 8 000 x g: llä 15 minuutin ajan ja pestiin puskurilla A (20 mM NaH2P04, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Noin 45 g (märkäpaino) soluja saatiin 3 litran viljelmästä. Sentrifugoinnin jälkeen solupelletit suspensoitiin uudelleen 40 ml: aan (1 litran viljelmässä) jääkylmällä uutospuskurilla A ja hajotettiin ultrashoation avulla jääkylmään lämpötilaan käyttämällä UP400St instrumentti (Dr. Hielscher GmbH, Saksa). Solulyysi sentrifugoitiin 12 000 rpm: llä 15 minuutin ajan liukoisten (supernatanttien) ja saostettujen (pelletti) jakeiden erottamiseksi. (Jiang et ai. 2015)

Seuraavassa taulukossa on merkintä ultrasonicatorien likimääräisestä käsittelykapasiteetista:

erätilavuus Virtausnopeus Suositeltavat laitteet
0.5 - 1,5 ml n.a VialTweeter
1 - 500 ml 10 - 200 ml / min UP100H
10 - 2000 ml 20 - 400 ml / min Uf200 ः t, UP400St
0.1 - 20L 0.2 - 4 l / min UIP2000hdT
10 - 100 litraa 2 - 10 l / min UIP4000
n.a 10 - 100 l / min UIP16000
n.a suuremmat klusterin UIP16000

Ota meihin yhteyttä! / Kysy meiltä!

Käytä alla olevaa lomaketta, jos haluat lisätietoja ylimääräisestä homogenoinnista. Olemme iloisia voidessamme tarjota sinulle ultrasonic-järjestelmän, joka vastaa tarpeitasi.









Huomaathan, että Tietosuojakäytäntö.


Kirjallisuus / Viitteet



Tosiasiat, jotka kannattaa tietää

E. coli

Escherichia coli (E. coli) on Gram-negatiivinen, puolueettomasti anaerobinen, sauvanmuotoinen, coliform-bakteeri, Escherichia-suvun, joka tavallisesti esiintyy lämpöveristen eliöiden alemmassa suolessa (endotermit). On olemassa runsaasti E. coli -kantoja (tai alatyyppejä), joilla on erilaisia ​​ominaisuuksia. Useimmat E. coli -kannat ovat vaarattomia ihmisille, esim. B- ja K-12-kannoille, joita käytetään yleensä tutkimustarkoituksiin laboratoriossa. Jotkut kannat ovat kuitenkin haitallisia ja voivat aiheuttaa vakavia sairauksia.
E. colilla on tärkeä rooli nykyaikaisessa biologisessa suunnittelussa ja teollisessa mikrobiologiassa, koska bakteereja on helppo käsitellä. Yhteiset laboratoriosovellukset, joihin liittyy usein E. colin käyttö, esimerkiksi rekombinanttisen deoksiribonukleiinihapon (DNA) luomiseksi tai mallin organismin toimimiseksi.
E. coli on hyvin monipuolinen isäntä heterologisten proteiinien tuottamiseksi ja moninaiset proteiinin ilmentämisjärjestelmät ovat käytettävissä rekombinanttiproteiinien tuottamisessa E. colissa. Plasmideja, jotka mahdollistavat proteiinin korkean tason ekspression, geenit voidaan tuoda bakteereihin, mikä mahdollistaa sellaisten proteiinien tuottamisen suurina määrinä teollisissa käymisprosesseissa.
E. colia käytetään solutehtaina insuliinin tuottamiseksi. Muita sovellutuksia ovat muun muassa modifioidut E. coli-solut, jotka kehittävät ja tuottavat rokotteita ja immobilisoituja entsyymejä biopolttoaineiden tuottamiseksi sekä bioreferenssia varten.
Kanta K-12 on E. colin mutanttimuoto, joka yli-ilmentää alkaliinifosfataasin (ALP) entsyymiä. Tämä mutaatio tapahtuu johtuen geenin vioista, joka jatkuvasti koodaa entsyymiä. Jos geeni tuottaa tuotetta ilman mitään inhibitiota, sitä kutsutaan konstitutiiviseksi aktiivisuudeksi. Tätä spesifistä mutanttimuotoa käytetään eristämään ja puhdistamaan ALP-entsyymi.

Ultraääni-DNA leikkaus

Ultronaariset leikkausvoimat ovat yleisesti käytetty menetelmä erottaa solu ja katkaista DNA-säikeet paloiksi. Akustinen kavitaatio katkaisee soluseinät ja kalvot DNA: n uuttamiseksi soluista ja tuottaa fragmentteja, jotka ovat noin 600 – 800 bp pituus, joka on ihanteellinen analyysiin.
Klikkaa tästä saadaksesi lisätietoja ultraäänen homogenisaattoreista DNA-pirstoutumiseen!