Drosophila Melanogaster -näytteiden lyysi ultraäänellä

Drosophila melanogasteria käytetään laboratorioissa laajalti malliorganismina. Siksi Drosophila melanogaster -näytteille on usein tehtävä esianalyyttisiä valmisteluvaiheita, kuten lyysi, solujen hajotus, proteiinien uutto ja DNA:n pilkkominen leikkausvoimilla. Ultraäänihajottimet ovat luotettavia ja tehokkaita, ja niillä voidaan helposti suorittaa erilaisia tehtäviä, kuten lyysiä, proteiinien uuttoa tai DNA:n fragmentointia, pelkästään ultraääniprosessin parametreja säätämällä. Ultraäänihomogenisaattorit ovat siten joustavia työkaluja, joilla on laaja käyttöalue.

Lyysi ja proteiinien uutto ultraäänellä

Lyysi, solujen liuottaminen, kudosten homogenointi ja proteiinien uutto ovat ultraäänihajottimien tyypillisiä tehtäviä biologisissa laboratorioissa. Ultraäänihajottimet ja soluhajottimet soveltuvat hyvin eläinkudosten, hyönteisten (esim. Drosophila melanogaster, C. elegans) tai kasvinäytteiden homogenointiin. Ultraäänikäsittelyn myöhempiä käyttökohteita ovat solususpensioiden ja pellettien lyysi sekä solunsisäisten proteiinien uutto.
Ultraäänellä tehtävä lyysi ja proteiinien uutto ovat erittäin luotettavia ja toistettavia prosesseja, jotka voidaan suorittaa vakiintuneiden protokollien pohjalta. Koska ultraääniprosessin intensiteettiä voidaan säätää tarkasti ultraäänikäsittelyn parametreilla, kuten amplitudilla, jakso- / pulssitilalla, lämpötilalla ja näytetilavuudella, toimiviksi osoitetut protokollat voidaan toistaa yhä uudelleen samoin tuloksin.

DNA:n ja RNA:n fragmentointi ultraäänellä

Solujen lyysin ja proteiinien uuton jälkeen näytteiden valmistelussa tarvitaan usein DNA:n, RNA:n ja kromatiinin pilkkomista leikkausvoimilla ja fragmentointia esimerkiksi ennen kromatiinin immunosaostusta (ChIP). DNA:n ja RNA:n fragmentointi voidaan toteuttaa luotettavasti katkaisemalla DNA:ta koossa pitäviä kovalenttisia sidoksia fysikaalisilla voimilla. Käytettäessä fysikaalista pilkkomista leikkausvoimilla, kuten ultraäänikäsittelyä, DNA-juosteet katkeavat ensin ja DNA fragmentoituu sen jälkeen pienemmiksi paloiksi.
DNA:n fragmentointi ultraäänellä on luotettava ja tehokas menetelmä DNA:n pilkkomiseen leikkausvoimilla tavoitepituuteen, esimerkiksi 500 bp:iin (emäspariin). Ultraäänellä tehtävän DNA:n fragmentoinnin tärkeimpiin etuihin kuuluu ultraääniprosessin parametrien ja intensiteetin tarkka hallinta. Ultraääniprosessin parametreja voidaan säätää muuttamalla tarkasti ultraäänikäsittelyn intensiteettiä, jaksoja ja kestoa. Näin voidaan tuottaa haluttuja DNA-kokoja, ja DNA:n tavoitepituus voidaan saavuttaa luotettavasti myös toistuvasti. DNA:n pilkkominen ultraäänen leikkausvoimilla soveltuu ihanteellisesti myös suuren molekyylipainon DNA-fragmenttien tuottamiseen.

Protokollat Drosophila melanogasterin lyysiin ultraäänellä

Alla on erilaisia protokollia Drosophila-näytteiden ultraääniavusteiseen lyysiin, proteiinien uuttoon sekä DNA:n tai kromatiinin fragmentointiin.

Lyysi ultraäänellä ristisidontaimmunosaostusmääritystä (CLIP) varten

CLIP-määritys suoritettiin aiemmin raportoidun mukaisesti muutamin muutoksin. Noin 20 mg 0–1 päivän ikäisten villityypin naaraiden munasarjoja ristisidottiin UV-säteilyllä (3 × 2000 μJ/cm2), homogenoitiin jäillä 1 mL:ssa RCB-puskuria (50 mM HEPES, pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1 % Triton X-100, 250 mM sakkaroosi, 1 mM DTT, 1× EDTA-vapaat Complete Protease Inhibitors -proteaasinestäjät, 1 mM PMSF), johon oli lisätty 300 U RNAseOUT-valmistetta, ja asetettiin jäille 30 minuutiksi. Homogenaatti ultraäänikäsiteltiin jäillä 80 %:n teholla viisi kertaa 20 s:n pulsseina, joiden välillä pidettiin 60 s:n tauko, käyttäen Hielscher Ultraääniprosessoria UP100H (100 W, 30 kHz) ja sentrifugoitiin (16 000 × g, 5 min, 4 °C). Liukoinen uute esipuhdistettiin 20 μl:lla Protein-G Dynabeads -helmiä 20 min ajan 4 °C:ssa. Kun näytteet oli otettu immunoblottausta ja lähtö-RNA:n määritystä (1 %) varten, HP1 immunosaostettiin anti-HP1 9A9 -vasta-aineella 450 μl:sta esipuhdistettua uutetta inkuboimalla sitä 4 h yhdessä 50 μl:n Protein-G Dynabeads -helmimäärän kanssa. Immunosaostumat pestiin 4 kertaa RCB:llä. Immunosaostettujen RNA-molekyylien eluoimiseksi pelletoituja helmiä keitettiin 100 μL:ssa UltraPure DEPC -käsiteltyä vettä 5 min ajan. RNA:n valmistelua varten talteen otettuun supernatanttiin lisättiin 900 μL Qiazol-reagenssia. Puhdistettua RNA:ta käytettiin templaattina cDNA:n syntetisointiin käyttäen oligo dT:tä, satunnaisia heksameerejä ja SuperScript III -käänteiskopioijaentsyymiä valmistajan protokollan mukaisesti.
(Cassale et al. 2019)

Lyysi ultraäänellä kromatiinin immunosaostusmääritystä varten

Kromatiinin immunosaostus suoritettiin Menetin kuvaaman menetelmän mukaisesti pienin muutoksin. Noin 20 mg 0–1 päivän ikäisten villityypin naaraiden munasarjoja homogenoitiin 1 mL:ssa NEB-puskuria (10 mM HEPES-Na, pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na, pH 8, 0,5 mM EDTA-Na, pH 8, 1 mM DTT, 0,5 % NP-40, 0,5 mM spermidiini, 0,15 mM spermiini, 1× EDTA-vapaat Complete Protease Inhibitors -proteaasinestäjät) homogenisaattorilla / upotettavalla dispergointilaitteella 1 min ajan (3 000 rpm). Homogenaatti siirrettiin esijäähdytettyyn lasiseen Dounce-homogenisaattoriin, jossa tehtiin 15 täyttä iskua tiukasti istuvalla männällä. Vapaat tumat sentrifugoitiin sitten 6 000 × g:ssä 10 min ajan 4 °C:ssa. Tumia sisältävät pelletit suspendoitiin uudelleen 1 mL:aan NEB-puskuria ja sentrifugoitiin 20 000 × g:ssä 20 min ajan sakkaroosigradientissa (0,65 mL 1,6 M sakkaroosia NEB-puskurissa, 0,35 mL 0,8 M sakkaroosia NEB-puskurissa). Pelletti suspendoitiin uudelleen 1 mL:aan NEB-puskuria, ja formaldehydiä lisättiin 1 %:n loppupitoisuuteen. Tumia ristisidottiin 10 min ajan huoneenlämmössä, ja reaktio pysäytettiin lisäämällä 1/10 tilavuusosa 1,375 M glysiiniä. Tumat kerättiin sentrifugoimalla 6 000 × g:ssä 5 min ajan. Tumat pestiin kahdesti 1 mL:ssa NEB-puskuria ja suspendoitiin uudelleen 1 mL:aan lyysipuskuria (15 mM HEPES-Na, pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA, pH 8, 1 % Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1 % natriumdeoksikolaatti, 0,1 % SDS, 0,5 % N-lauroylsarcosine ja 1× EDTA-vapaat Complete Protease Inhibitors -proteaasinestäjät). Tumat ultraäänikäsiteltiin käyttäen Hielscher Ultraääniprosessoria UP100H (100 W, 30 kHz) kuusi kertaa siten, että ultraäänikäsittely kesti 20 s ja jäillä pitäminen 1 min. Ultraäänikäsitellyt tumat sentrifugoitiin 13 000 × g:ssä 4 min ajan 4 °C:ssa. Suurin osa ultraäänikäsitellystä kromatiinista oli pituudeltaan 500–1 000 emäsparia (bp). Kutakin immunosaostusta varten 15 μg kromatiinia inkuboitiin yhdessä 10 μg:n monoklonaalisen HP1 9A9 -vasta-ainemäärän kanssa (3 h, 4 °C, pyörivässä inkubointipyörässä). Sitten lisättiin 50 μl Dynabeads Protein G -helmiä, ja inkubointia jatkettiin yön yli 4 °C:ssa. Supernatantit poistettiin ja näytteet pestiin kahdesti lyysipuskurissa (kukin pesu 15 min, 4 °C) ja kahdesti TE-puskurissa (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl, pH 8). Kromatiini eluoitiin helmistä kahdessa vaiheessa: ensin 100 μl:ssa eluutiopuskuria 1 (10 mM EDTA, 1 % SDS, 50 mM TrisHCl, pH 8) 65 °C:ssa 15 min ajan, minkä jälkeen suoritettiin sentrifugointi ja supernatantin talteenotto. Helmimateriaali uutettiin uudelleen 100 μl:ssa TE-puskuria + 0,67 % SDS:ää. Yhdistettyä eluaattia (200 μl) inkuboitiin yön yli 65 °C:ssa ristisidosten purkamiseksi ja käsiteltiin 50 μg/ml RNaseA:lla 15 min ajan 65 °C:ssa sekä 500 μg/ml proteinaasi K:lla 3 h ajan 65 °C:ssa. Näytteille tehtiin fenoli–kloroformiuutto ja etanolisaostus. DNA suspendoitiin uudelleen 25 μl:aan vettä. Immunosaostetulla DNA:lla tehtävien molekyylianalyysien maksimoimiseksi ehdokasgeenit monistettiin pareittain optimoidulla duplex-PCR-protokollalla käyttäen yhdessä reaktiossa kahta erilaista alukesarjaa, joiden sulamislämpötilat olivat samankaltaiset.
(Casale et al. 2019)
 

Tehokkaat ultraäänisoluhajottimet biologisille näytteille

Hielscher Ultrasonics on kokenut kumppanisi, kun tarvitset tehokkaita ultraäänilaitteita solujen hajotukseen, lyysiin, proteiinien uuttoon, DNA:n, RNA:n ja kromatiinin fragmentointiin sekä muihin esianalyyttisiin näytteiden valmisteluvaiheisiin. Kattavan ultraäänilaboratoriohomogenisaattorien ja näytteiden valmistelulaitteiden valikoimansa ansiosta Hielscher tarjoaa ihanteellisen ultraäänilaitteen biologiseen sovellukseesi ja vaatimuksiisi.
Perinteinen mikrokärjellä varustettu anturityyppinen ultraäänilaite, kuten UP200St (200 W; katso kuva vasemmalla), tai jokin ultraäänellä toimivista näytteiden valmistelulaitteista VialTweeter tai UP200ST_TD_CupHorn VialHolder-pidikkeellä on suosittu malli tutkimus- ja analyysilaboratorioissa. Perinteinen ultraäänianturi on ihanteellinen, kun pienemmälle määrälle näytteitä on tehtävä lyysi, uutto tai fragmentointi. Näytteiden valmistelulaitteet VialTweeter ja UP200St_TD_CupHorn mahdollistavat vastaavasti jopa 10 tai 5 näytepullon samanaikaisen ultraäänikäsittelyn.
Jos käsiteltävänä on suuri määrä näytteitä (esim. 96-kuoppalevyjä, mikrotiitterilevyjä jne.), UIP400MTP on ihanteellinen ultraäänikäsittelylaitteisto. UIP400MTP toimii suuremman CupHorn -kuppisonotrodin tavoin: se täytetään vedellä, ja siinä on riittävästi tilaa mikrokuoppalevyille. Tehokkaan 400 watin ultraääniprosessorin avulla UIP400MTP tuottaa erittäin tasaisen ja voimakkaan monikuoppalevyjen ultraäänikäsittelyn solujen hajottamiseksi, näytteiden lysoimiseksi, pellettien liuottamiseksi, proteiinien uuttamiseksi tai DNA:n pilkkomiseksi leikkausvoimilla.

Tarkka hallinta älykkäällä ohjelmistolla

Kaikki Hielscher ultraäänikäsittelyratkaisut 200 watista ylöspäin on varustettu digitaalisella värikosketusnäytöllä ja älykkäällä ohjelmistolla. Älykäs tietojen kirjaus tallentaa kaikki ultraääniprosessin parametrit automaattisesti CSV-tiedostoon laitteen sisäiselle SD-kortille heti, kun ultraäänilaite käynnistetään. Tämä tekee tutkimuksesta ja tietojen kirjaamisesta huomattavasti helpompaa. Ultraäänikäsittelykokeiden tai näytteiden valmistelun jälkeen voit helposti tarkastella kunkin ultraäänikäsittelyajon parametreja ja verrata niitä.
Intuitiivisen valikon kautta voidaan esiasettaa lukuisia parametreja ennen ultraäänikäsittelyä. Esimerkiksi näytteen lämpötilan hallitsemiseksi ja lämpöhajoamisen estämiseksi voidaan asettaa näytteen lämpötilan yläraja. Ultraäänilaitteen mukana toimitettava liitettävä lämpötila-anturi antaa ultraääniprosessorille palautetta ultraäänikäsittelyn todellisesta lämpötilasta. Kun lämpötilan yläraja saavutetaan, ultraäänilaite keskeyttää käsittelyn, kunnes asetetun ∆T:n alaraja saavutetaan, ja käynnistää sitten ultraäänikäsittelyn automaattisesti uudelleen.
Jos ultraäänikäsittelyssä tarvitaan tietty energiansyöttö, voit esiasettaa ultraäänikäsittelyajon lopullisen ultraäänienergian. Myös ultraäänipulssitus ja jaksotila voidaan luonnollisesti säätää yksilöllisesti.
Voit käyttää onnistuneimpia ultraäänikäsittelyparametrejasi uudelleen tallentamalla erilaisia ultraäänikäsittelytiloja (esim. ultraäänikäsittelyn keston, intensiteetin, jaksotilan jne.) esiasetuksiksi, jolloin ne voidaan käynnistää uudelleen helposti ja nopeasti.
Käytön helpottamiseksi kaikkia digitaalisia ultraäänilaitteita voidaan käyttää selaimen etäohjauksella missä tahansa yleisessä selaimessa (esim. InternetExplorer, Safari, Chrome jne.). LAN-yhteys on helppo ottaa käyttöön plug-n-play-periaatteella, eikä se vaadi lisäohjelmistojen asentamista.
Me, Hielscher, tiedämme, että biologisten näytteiden onnistunut ultraäänikäsittely vaatii tarkkuutta ja toistettavuutta. Siksi suunnittelimme ultraäänilaitteemme älykkäiksi laitteiksi, joissa on kaikki tehokkaan, luotettavan, toistettavan ja vaivattoman näytteiden valmistelun mahdollistavat ominaisuudet.

Alla oleva taulukko antaa käsityksen ultraäänijärjestelmiemme likimääräisestä käsittelykapasiteetista: valikoima ulottuu ultraäänimikrokärjistä ja perinteisistä ultraäänihomogenisaattoreista useiden näytteiden vaivattomaan ja luotettavaan valmisteluun tarkoitettuihin MultiSample-ultraäänilaitteisiin: