Drosophila melanogaster -näytteiden ultraäänilyysi

Drosophila melanogasteria käytetään laajalti laboratorioissa malliorganismina. Siksi Drosophila melanogaster -näytteiden esianalyyttiset valmisteluvaiheet, kuten lyysi, solujen hajoaminen, proteiinien uuttaminen ja DNA-leikkaus, on suoritettava usein. Ultraääni dismembrators ovat luotettavia ja tehokkaita, ja niitä voidaan käyttää suorittamaan erilaisia tehtäviä, kuten lyysi, proteiiniuutto tai DNA: n pirstoutuminen helposti säätämällä vain ultraääniprosessiparametreja. Ultraäänihomogenisaattorit ovat siten joustavia työkaluja, joilla on laaja valikoima sovelluksia.

Ultraäänilyysi ja proteiinien uuttaminen

Lyysi, solujen liukeneminen, kudosten homogenisointi ja proteiinien uuttaminen ovat tyypillisiä tehtäviä ultraääni dismembrators biologisissa laboratorioissa. Ultraäänidismembraattorit ja solujen häiritsijät soveltuvat hyvin eläinkudosten, hyönteisten (esim. Drosophila melanogaster, C. elegans) tai kasvinäytteiden homogenisointiin. Ultrasonicationin myöhemmät sovellukset ovat solususpensioiden ja pellettien hajoaminen sekä solunsisäisten proteiinien uuttaminen.
Ultraäänilyysi ja proteiiniuutto ovat erittäin luotettavia ja toistettavissa olevia prosesseja, jotka voidaan suorittaa vakiintuneiden protokollien perusteella. Koska ultraääniprosessin intensiteettiä voidaan säätää tarkasti sonikaatioparametrien, kuten amplitudin, syklin / pulssitilan, lämpötilan ja näytteen tilavuuden, avulla, kun todistetut protokollat voidaan toistaa samalla tuloksella uudestaan ja uudestaan.

Ultraääni-DNA ja RNA-pirstoutuminen

Solulyysin ja proteiiniuuton jälkeen yleinen vaadittu vaihe näytteen valmistelussa on DNA:n, RNA:n ja kromatiinin leikkaaminen ja pirstoutuminen, esimerkiksi ennen kromatiinin immunosaostusta (ChIP). DNA: n ja RNA: n pirstoutuminen voidaan saavuttaa luotettavasti rikkomalla kovalenttiset sidokset, jotka pitävät DNA: ta yhdessä fysikaalisilla voimilla. Käyttämällä fyysistä leikkausta, kuten sonikaatiota, aluksi DNA-säikeet rikkoutuvat, sitten DNA pirstoutuu pienemmiksi paloiksi.
Ultraääni-DNA: n pirstoutuminen on luotettava ja tehokas DNA: n leikkaamisessa tavoitepituuteen, esimerkiksi 500bp (emäsparit). Ultraääni-DNA: n pirstoutumisen tärkeimmät edut sisältävät ultraääniprosessiparametrien ja intensiteetin tarkan hallinnan. Ultraääniprosessiparametreja voidaan säätää virittämällä sonikaatiointensiteettiä, syklejä ja aikaa tarkasti. Tämä mahdollistaa haluttujen DNA-kokojen luomisen ja tavoiteltu DNA-pituus voidaan luotettavasti tuottaa ja jäljentää. Ultraääni-DNA-leikkaus on myös ihanteellinen suurimolekyylipainoisten DNA-fragmenttien luomiseksi.

Drosophila melanogasterin ultraäänilyysin protokollat

Alta löydät erilaisia protokollia Drosophila-näytteiden ultraäänellä avustetulle lyysille, proteiinien uuttamiselle ja DNA: n tai kromatiinin pirstoutumiselle.

Ultraäänilyysi silloittavaa immunosaostusmääritystä (CLIP) varten

CLIP-määritys suoritettiin aiemmin raportoidulla tavalla tietyin muutoksin. Noin 20 mg munasarjoja 0–1 päivän ikäisiltä villityyppisiltä naarailta silloitettiin UV-silloitettuna (3 × 2000 μJ/cm2), homogenoitiin jäällä 1 ml:ssa RCB-puskuria (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1 % Triton X-100, 250 mM sakkaroosi, 1 mM DTT, 1× EDTA-vapaat täydelliset proteaasi-inhibiittorit, 1 mM PMSF), täydennettiin 300 U RNAseOUTilla ja laitettiin jäälle 30 minuutiksi. Homogenaatti sonikoitiin jäällä, 80%: n teholla, viisi kertaa 20 sekunnin purskeissa 60 sekunnin levolla välillä Hielscherin ultraääniprosessorilla UP100H (100 W, 30 kHz) ja sentrifugoitu (16000 × g 5 minuutin ajan 4 °C:ssa). Liukoinen uute esipuhdistettiin 20 μl:lla proteiini-G-dynahelmiä 20 minuutin ajan 4 °C:ssa. Kun näytteet oli poistettu immunoblottausta ja RNA:n sisääntulon kvantitointia varten (1 %), HP1 immunosaostettiin anti-HP1 9A9 -vasta-aineella 450 μl:sta esipuhdistettua uutetta inkuboimalla 4 tunnin ajan 50 μl:n proteiini-G-dynahelmillä. Immunosaostumat pestiin 4 kertaa RCB: llä. Immunopresaosoituneiden RNA:iden eluoimiseksi pelletoituja helmiä keitettiin 100 μl:ssa UltraPure-DEPC-käsiteltyä vettä 5 minuutin ajan. 900 μl Qiazol-reagenssia lisättiin RNA-valmistusta varten talteen otettuun supernatanttiin. Puhdistettua RNA: ta käytettiin mallina cDNA: n syntetisoimiseksi käyttämällä oligo dT: tä, satunnaisia heksameerejä ja SuperScript-käänteiskopioijaa III valmistajan protokollan mukaisesti.
(Cassale ym. 2019)

Ultraäänilyysi kromatiinin immunosaostusmääritykseen

Kromatiinin immunosaostus suoritettiin Menetin kuvaaman menetelmän mukaisesti pienin muutoksin. Noin 20 mg munasarjoja 0–1 päivän ikäisiltä villityyppisiltä naarailta homogenoitiin 1 ml:aan NEB-puskuria (10 mM HEPES-Na pH:ssa 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na pH:ssa 8, 0,5 mM EDTA-Na pH:ssa 8, 1 mM DTT, 0,5 % NP-40, 0,5 mM spermidiini, 0,15 mM spermiini, 1× EDTA-vapaat täydelliset proteaasi-inhibiittorit) homogenisaattorilla / upotusdispergointilaitteella 1 min (nopeudella 3000 rpm). Homogenaatti siirrettiin esijäähdytettyyn lasiunssiin ja 15 täyttä vetoa levitettiin tiukalla survimella. Vapaita ytimiä sentrifugoitiin sitten 6000xg:ssa 10 minuutin ajan 4 °C:ssa. Ytimiä sisältävät pelletit suspendoitiin uudelleen 1 ml:aan NEB:tä ja sentrifugoitiin 20000 × g:ssa 20 minuutin ajan sakkaroosigradientissa (0,65 ml 1,6 M sakkaroosia NEB:ssä, 0,35 ml 0,8 M sakkaroosia NEB:ssä). Pelletti suspendoidaan uudelleen 1 ml:aan NEB:tä ja formaldehydiä lopulliseen pitoisuuteen 1 %. Ytimet silloitettiin 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa ja sammutettiin lisäämällä 1/10 tilavuusosaa 1,375 M glysiiniä. Ytimet kerättiin sentrifugoimalla 6000 × g:ssa 5 minuutin ajan. Ytimet pestiin kahdesti 1 ml:ssa NEB:tä ja suspendoitiin uudelleen 1 ml:aan lyysipuskuria (15 mM HEPES-Na pH:ssa 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA pH:ssa 8, 1 % Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1 % Na-deoksikolaattia, 0,1 % SDS, 0,5 % N-lauroyylisarkosiinia ja 1× EDTA-vapaata täydellistä proteaasinestäjää). Ytimet sonikoitiin Hielscherin ultraääniprosessorilla UP100H (100 W, 30 kHz) kuusi kertaa 20 s jäällä ja 1 min jäällä. Sonikoituja ytimiä sentrifugoitiin 13000 × g: ssa 4 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Suurin osa sonikoidusta kromatiinista oli 500-1000 emäsparin (bp) pituinen. Kutakin immunosaostusta varten inkuboitiin 15 μg kromatiinia 10 μg:n monoklonaalisen HP1 9A9 -vasta-aineen läsnä ollessa (3 tuntia 4 °C:ssa pyörivässä pyörässä). Sitten lisättiin 50 μl dynahelmiproteiini G:tä ja inkubaatiota jatkettiin yön yli 4 °C:ssa. Supernatantit heitettiin pois ja näytteet pestiin kahdesti lyysipuskurissa (kumpikin pesu 15 min 4 °C:ssa) ja kahdesti TE-puskurissa (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl pH:ssa 8). Kromatiini eluoitui helmistä kahdessa vaiheessa; ensin 100 μl:ssa Eluition Buffer 1:tä (10 mM EDTA, 1 % SDS, 50 mM TrisHCl pH:ssa 8) 65 °C:ssa 15 minuutin ajan, minkä jälkeen supernatantti sentrifugoidaan ja otetaan talteen. Helmimateriaali uutettiin uudelleen 100 μl: ssa TE + 0,67% SDS: ää. Yhdistettyä eluaattia (200 μl) inkuboitiin yön yli 65 °C:ssa ristisidosten kääntämiseksi ja käsiteltiin 50 μg/ml RNaasiA:lla 15 minuutin ajan 65 °C:ssa ja 500 μg/ml proteinaasi K:lla 3 tunnin ajan 65 °C:ssa. Näytteet uutettiin fenoli-kloroformilla ja saostettiin etanoli. DNA suspendoitiin uudelleen 25 μl:aan vettä. Molekyylianalyysien maksimoimiseksi immunosaostuneella DNA:lla ehdokasgeenit monistettiin pareittain optimoidun duplex-PCR-protokollan avulla käyttämällä kahta erilaista alukkeiden sarjaa, joilla oli samanlaiset sulamislämpötilat yhdessä reaktiossa.
(Casale ym. 2019)
 

Korkean suorituskyvyn ultraäänisolujen häiritsijät biologisille näytteille

Hielscher Ultrasonics on pitkäaikainen kokenut kumppanisi, kun on kyse korkean suorituskyvyn ultraäänilaitteista solujen häiriöihin, lyysiin, proteiinien uuttamiseen, DNA: han, RNA: han ja kromatiinin pirstoutumiseen sekä muihin esianalyyttisiin näytteenvalmistusvaiheisiin. Tarjoamalla kattavan valikoiman ultraäänilaboratorion homogenisaattoreita ja näytteenvalmistusyksiköitä, Hielscherillä on ihanteellinen ultraäänilaite biologiseen sovellukseesi ja vaatimuksiin.
Klassinen anturityyppinen ultraäänilaite, jossa on mikrokärki, kuten UP200St (200W; katso kuva vasemmalla) tai yksi ultraääninäytteen valmistusyksiköistä VialTweeter tai UP200St_TD_CupHorn VialHolderin kanssa ovat suosikkimalleja tutkimus- ja analyyttisissä laboratorioissa. Klassinen ultraäänianturi on ihanteellinen, kun valmistetaan vähemmän näytteitä, jotka on analysoitava, uutettava tai pirstoutettava. Näytteenvalmistusyksiköt VialTweeter ja UP200St_TD_CupHorn mahdollistavat jopa 10 tai 5 injektiopullon samanaikaisen sonikaation.
Jos on käsiteltävä suuria näytemääriä (esim. 96-kuoppalevyjä, mikrotitterilevyjä jne.), UIP400MTP on ihanteellinen sonikaatioasetus. UIP400MTP toimii kuin suurempi kuppitorvi, joka on täytetty vedellä ja jossa on tarpeeksi tilaa mikrokuoppalevyjen pitämiseen. 400 watin tehokkaalla ultraääniprosessorilla toimiva UIP400MTP tuottaa erittäin yhtenäisen ja intensiivisen monikuoppalevyjen sonikoinnin solujen häiritsemiseksi, lyse-näytteiksi, pellettien liuottamiseksi, proteiinien uuttamiseksi tai DNA: n leikkaamiseksi.

Tarkka ohjaus älykkään ohjelmiston avulla

Kaikki Hielscherin sonikaatioratkaisut 200 watista ylöspäin on varustettu digitaalisella värikosketusnäytöllä ja älykkäällä ohjelmistolla. Älykkään dataprotokollan avulla kaikki ultraääniprosessiparametrit tallennetaan automaattisesti CSV-tiedostona sisäänrakennetulle SD-kortille heti, kun ultraäänilaite käynnistetään. Tämä tekee tutkimuksesta ja protokollasta paljon helpompaa. Sonikaatiokokeiden tai näytteen valmistuksen jälkeen voit yksinkertaisesti tarkistaa kunkin sonikaatioajon sonikaatioparametrit ja verrata niitä.
Intuitiivisen valikon kautta voidaan esiasettaa lukuisia parametreja ennen sonikaatiota: Esimerkiksi näytteen lämpötilan säätämiseksi ja sen lämpöhajoamisen estämiseksi voidaan asettaa näytteen lämpötilan yläraja. Kytkettävä lämpötila-anturi, joka tulee ultraääniyksikön mukana, antaa ultraääniprosessorille palautetta todellisesta sonikaatiolämpötilasta. Kun ylempi lämpötilaraja saavutetaan, ultraäänilaite pysähtyy, kunnes asetetun ∆T: n alaraja saavutetaan ja alkaa sitten automaattisesti sonikoida uudelleen.
Jos tarvitaan sonikaatiota tietyllä energian syötöllä, voit asettaa sonikaatioajon lopullisen ultraäänienergian. Tietenkin myös ultraäänipulsaatio- ja syklitila voidaan asettaa erikseen.
Jos haluat käyttää menestyneimpiä sonikaatioparametrejasi uudelleen, voit tallentaa erilaisia sonikaatiotiloja (esim. sonikaatioaika, intensiteetti, syklitila jne.) ennalta asetettuina tiloina, jotta ne voivat olla helppoja ja nopeasti käynnistettyjä uudelleen.
Käyttömukavuuden lisäämiseksi kaikkia digitaalisia ultraääniyksiköitä voidaan käyttää selaimen kaukosäätimellä missä tahansa yleisessä selaimessa (esim. InternetExplorer, Safari, Chrome jne.). LAN-yhteys on yksinkertainen plug-n-play-asennus, eikä se vaadi ohjelmiston lisäasennusta.
Me Hielscherissä tiedämme, että biologisten näytteiden onnistunut sonikointi vaatii tarkkuutta ja toistettavuutta. Siksi suunnittelimme ultraäänilaitteemme älylaitteiksi, joissa on kaikki ominaisuudet, jotka mahdollistavat tehokkaan, luotettavan, toistettavan ja kätevän näytteenvalmistuksen.

Alla oleva taulukko antaa sinulle viitteitä ultraäänijärjestelmiemme likimääräisestä käsittelykapasiteetista ultraäänimikrokärjistä ja klassisista ultraäänihomogenisaattoreista MultiSample-ultraäänilaitteisiin lukuisten näytteiden kätevään ja luotettavaan valmistukseen: