Hielscher Ultrasonics
Keskustelemme mielellämme prosessistanne.
Soita meille: +49 3328 437-420
Lähetä meille sähköpostia: [email protected]

C. Elegans -näytteiden valmistelu ultraäänellä

C. elegans on sukkulamato, jota käytetään laajalti mallieliönä biologiassa. Näytteiden valmistelu ennen analyysiä edellyttää lyysiä, proteiinien ja lipidien uuttoa sekä RNA:n fragmentointia, jotka voidaan tehdä luotettavasti ultraäänikäsittelyllä. Ultraäänikäyttöiset solujen hajotuslaitteet ovat luotettavia, kehittyneitä ja helppokäyttöisiä laitteita C. elegans -näytteiden nopeaan valmisteluun.

C. elegans -näytteiden valmistelu ultraäänellä

Caenorhabditis elegans on sukkulamato, jota käytetään laajalti tutkimuslaboratorioissa genomiikan, kehitysbiologian ja sairauksien tutkimiseen. Monilla C. elegansin genomin geeneillä on toiminnallisia vastineita ihmisessä. Siksi tämä sukkulamato on erittäin hyödyllinen malli ihmisen sairauksien tutkimiseen. Muita C. elegansin laajaa käyttöä tukevia etuja ovat sen helppo ja edullinen kasvatus bakteereita (esim. E. coli) sisältävillä maljoilla, läpinäkyvyys, kätevä käsittely sekä mahdollisuus pakastaa ja säilyttää matoja pidempään.
Proteiini- ja lipidianalyysit ovat laboratorioiden tavanomaisia menetelmiä, ja näytteiden valmistelu ultraäänellä on vakiintunut menetelmä C. elegans -sukkulamatojen lyysiin kaikissa kehitysvaiheissa (eli alkioina, toukkavaiheissa L1–L4 ja aikuisina). Koska C. elegansia käytetään myös proteiinien ilmentämisjärjestelmänä kohdeproteiinien yli-ilmentämiseen, tarvitaan luotettava ja toistettava lyysi- ja proteiininuuttomenetelmä, jolla saadaan suuri proteiinisaanto. Ultraäänikäyttöisiä solujen hajotus- ja uuttojärjestelmiä on saatavilla sekä anturityyppisinä homogenisaattoreina että usean näytteen ultraäänilaitteina. Hielscher Ultrasonics tarjoaa ihanteellisen ultraäänikäyttöisen solujen hajotuslaitteen laboratoriomenetelmääsi varten, jotta näytteiden valmistelu on kätevää kaikenlaisilla näyteko’oilla ja näytemäärillä.
C. elegans on laajalti käytetty mallieliö biologisessa tutkimuksessa. Ultraäänilyysi on kehittynyt, luotettava, toistettava ja nopea tekniikka korkealaatuisten proteiininuutteiden valmistamiseen C. elegansista.

C. elegansin ultraäänilyysi seuraaviin tarkoituksiin

  • Matohomogenaattien valmistus
  • Proteiinien uutto
  • Lipidien uutto
  • Proteiinien määritys
  • Immunosaostus
  • Western blot -analyysi
  • RNA:n uutto
  • Entsymaattiset määritykset
VialTweeter ultraääniprosessorissa UP200ST

VialTweeter-ultraäänilaite usean näytteen käsittelyyn 10 koeputken samanaikaiseen valmisteluun.

Tietopyyntö



Ultraääniprotokollat C. Elegansin hajotukseen ja lyysiin

C. elegansin ultraäänihomogenointi ja lyysi sekä niitä seuraava proteiinien ja lipidien uutto voidaan tehdä erilaisilla menetelmillä käyttämällä esimerkiksi erilaisia homogenointi- ja lyysipuskureita. Kaikille lyysiprotokollille on yhteistä, että näytteet on pidettävä jatkuvasti jäällä proteiinien hajoamisen estämiseksi. Alla esittelemme luotettavia ja nopeita ultraäänilyysi- ja uuttoprotokollia korkealaatuisten, proteiineja tai lipidejä sisältävien C. elegans -näytteiden valmisteluun.

C. elegansin ultraäänilyysin edut

  • luotettava
  • toistettava
  • tarkasti säädelty lämpötila
  • luotettava prosessinhallinta
  • hellävarainen menetelmä
  • helppo käyttää
  • turvallinen

Proteiinien ultraääniuutto C. elegans -näytteistä

C. elegans -matojen ultraäänilyysi ja proteiinien uutto voidaan tehdä erilaisilla protokollilla. Alla esittelemme muutamia luotettavia ja nopeita lyysiprotokollia toistettavien proteiininuuttotulosten saavuttamiseksi.

Sytosoliuutteen nopea valmistus C. elegans -madoista ultraäänikäsittelyllä

Seuraavalla protokollalla voit valmistaa C. elegans -lysaatteja alle 30 minuutissa.
C. elegansin kerääminen
Poimi halutut C. elegans -madot fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS) sisältävään 1,5 ml:n putkeen tai huuhtele ne maljalta 1,5 ml:lla PBS:ää. Sentrifugoi 1 min nopeudella 2 000 rpm pelletin muodostamiseksi. Pidä näytteet koko ajan jäällä.
Pese sitten madot kahdesti PBS:llä.
Pese sen jälkeen madot kahdesti ddH2O:lla.
Suspendoi madot uudelleen vähintään 500 ul:aan homogenointipuskuria (HB). Matonäytteet ovat nyt valmiita ultraäänilyysiin.
Proteiininuutteen laadun parantamiseksi voit vähentää bakteerikontaminaatiota pesemällä matoja 5 min sekä PBS:ssä että steriilissä ultrapuhtaassa vedessä (ddH2O) tai tekemällä sakkaroosiflotaation. Pidä matonäytteet jatkuvasti jäällä.

C. elegansin ultraäänilyysiprotokolla

  • Varmista, että valmistelet ultraäänilaitteen etukäteen niin, että ultraäänihomogenisaattori on käyttövalmis (anturi asennettu ja ultraäänikäsittelyohjelma esiasetettu). 
  • Ultraäänilaite UP200Ht (200 wattia, 26 kHz) ja mikrokärki S26d2 biologisten näytteiden valmisteluunJos ultraäänilaitteesi on asennettu telineeseen, aseta näyteputket sisältävä jäähaude ultraäänianturin alle ja työnnä ultraäänianturi 1,5 ml:n putkeen.

  • Kun C. elegansin lyysi tehdään laitteella UP200St tai UP200Ht, ultraäänikäsittely tulee tehdä mikrokärjellä (esim. 2 mm:n anturi S26d2; katso kuva vasemmalla) 40 %:n amplitudilla 1 sekunnin ajan ja pitää käsittelyjen välillä 30 sekunnin tauot. C. elegansin lyysiin soveltuvat ihanteellisesti 5 ultraäänikäsittelyjaksoa, joista kukin kestää 1 sekunnin ja joiden välillä on 30 sekunnin tauot. Jos teet lyysin ensimmäistä kertaa, voit tarkistaa lyysin etenemisen mikroskoopilla pienistä näyteosuuksista jokaisen pulssin jälkeen.
  • Lyysi on onnistuneesti valmis, kun madot on hajotettu. Liiallinen ultraäänikäsittely hajottaa tumia, mikä näkyy näytteen muuttumisena viskoosiksi tai vaahtoamisena. Estä näytteen hajoaminen käyttämällä tarvittaessa useampia pulsseja. Älä pidennä yksittäisten ultraäänipulssijaksojen kestoa, jotta saat korkealaatuisia proteiininuutteita.
  • Kirkasta solulysaatti sentrifugoimalla ultraäänellä hajotettuja matoja nopeudella 14 000 rpm 10 min ajan 4 ºC:ssa.
  • Siirrä sitten supernatantti uuteen putkeen ja valmistele se immunosaostusta tai muita määrityksiä varten.

Huomautus homogenointipuskurista: valmista yllä olevaa ultraäänilyysiprotokollaa varten homogenointipuskuri seuraavasti:

  • 15 mM Hepes, pH 7,6  – 15 ml 0,5 M:n liuosta
  • 10 mM KCl  – 2,5 ml 2 M:n liuosta
  • 1,5 mM MgCl2  – 0,75 ml 1 M:n liuosta
  • 0,1 mM EDTA – 100 ul 0,5 M:n liuosta
  • 0,5 mM EGTA – 2,5 ml 0,1 M:n liuosta
  • 44 mM sakkaroosi  – 14,7 ml 50 %:n liuosta
  • Lisää juuri ennen käyttöä: 1 mM DTT – 1000x 1 M:n liuosta
  • sekä proteaasi-inhibiittori

 

Sopivan ultraäänilaitteen valinta solujen hajottamiseen ja proteiinien uuttoon tutkimuksessa ja analytiikassaTässä opastusvideossa kerrotaan, millainen ultraäänilaite soveltuu parhaiten näytteenkäsittelytehtäviin, kuten lyysiin, solujen hajottamiseen, proteiinien eristämiseen sekä DNA:n ja RNA:n fragmentointiin laboratorioissa, analytiikassa ja tutkimuksessa. Valitse laitetyyppi käyttökohteen, näytetilavuuden, näytemäärän ja käsittelykapasiteetin mukaan. Hielscher Ultrasonics tarjoaa tarpeisiinne ihanteellisen ultraäänihomogenisaattorin!
Tässä opastusvideossa kerrotaan, millainen ultraäänilaite soveltuu parhaiten näytteenkäsittelytehtäviin, kuten lyysiin, solujen hajottamiseen, proteiinien eristämiseen sekä DNA:n ja RNA:n fragmentointiin laboratorioissa, analytiikassa ja tutkimuksessa. Valitse laitetyyppi käyttökohteen, näytetilavuuden, näytemäärän ja käsittelykapasiteetin mukaan. Hielscher Ultrasonics tarjoaa tarpeisiinne ihanteellisen ultraäänihomogenisaattorin!

 

C. elegansin suuren näytemäärän lyysi 96-kuoppalevyillä käyttäen levyultraäänilaitetta UIP400MTP

C. elegansin lyysi (aikuiset sukkulamadot)
UIP400MTP, 80 %:n amplitudi, 20 jaksoa (kukin ultraäänikäsittelyjakso: 30 sec PÄÄLLÄ, 30 sec POIS)
Lyysipuskuri:

  • Vaihtoehto 1) 4 % SDS, 0,1 M Tris/HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA
  • Vaihtoehto 2) yhteisimmunosaostukseen (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (Complete-proteinaasi-inhibiittoriseos)

Suuren näytemäärän DNA-fragmentointi
C. elegansin (aikuiset sukkulamadot) DNA, 200–300 bp: levyultraäänilaite UIP400MTP – aseta amplitudiksi 80 %, 30 pulssia – kukin 30 sec päällä, 30 sec pois

Levyultraäänilaite UIP400MTP suuren näytemäärän valmisteluun: UIP400MTP käsittelee näytteet tasaisesti ultraäänellä monikuoppalevyillä, mikrotiitterilevyillä ja 96-kuoppalevyillä hajottaen soluja, uuttaen proteiineja sekä fragmentoiden DNA:ta, RNA:ta ja alfa-synukleiinifibrillejä.

Suuren näytemäärän valmisteluun tarkoitettu levyultraäänilaite UIP400MTP käsittelee näytteet tasaisesti ultraäänellä monikuoppalevyillä, mikrotiitterilevyillä ja 96-kuoppalevyillä

C. elegansin ultraäänilyysi kvantitatiivisia affiniteettipuhdistusmäärityksiä varten

C. elegans -alkiot (∼2 miljoonaa toistoa kohti) kerättiin tuoreeltaan kolmena biologisena toistona käsittelemällä nuoria munia kantavia hermafrodiitteja valkaisuliuoksella ja ultraäänikäsiteltiin jäällä (jakso: 0,5 s, amplitudi: 40–45 %, 5 pulssia/käsittelykerta, 5 käsittelykertaa, käsittelykertojen väli: 30 s; käytössä ultraääniprosessori UP200S ja mikrokärki S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) lyysipuskurissa (kokonaistilavuus: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10 % glyserolia, proteaasi-inhibiittoriseos, 0,1 % Nonidet P-40 Substitute). Ultraäänikäsittelyn jälkeen Nonidet P-40 Substitute -reagenssia lisättiin 1 %:iin asti, ja lysaatteja inkuboitiin päästä päähän pyörittäen 4 °C:ssa 30 min, minkä jälkeen ne sentrifugoitiin 20 000 × g:llä 20 min ajan 4 °C:ssa. Kirkastettu lysaatti imettiin sitten talteen häiritsemättä ylempää lipidikerrosta ja jaettiin puoliksi anti-GFP-agaroosihelmiin tai blokattuihin kontrollihelmiin (40–50 μl). Kun helmiä oli pyöritetty päästä päähän 4 °C:ssa 60–90 min, ne pestiin kerran 0,1 % Nonidet P-40 Substitute -reagenssia sisältävällä lyysipuskurilla ja sen jälkeen kahdesti joko puskurilla I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) tai puskurilla II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) tai molemmilla. GFP:MBK-2-pull-down-määrityksissä tehtiin kaksi erillistä koetta eri pesuolosuhteissa. Proteiinit eluoitiin kiertoravistelulla 50 μl:ssa 6 m ureaa / 2 M tioureaa huoneenlämmössä. MBK-1::GFP-pull-down-kokeissa proteiinit eluoitiin kahdesti ravistelemalla 50 μl:ssa 8 m guanidiniumkloridia 90 °C:ssa, minkä jälkeen tehtiin etanolisaostus. Eluoidut proteiininäytteet pilkottiin sitten liuoksessa.
(ks. Chen et al., 2016)

Sonotrodissa MTP-24-8-96 on kahdeksan ultraäänianturia mikrotiitterilevyjen kuoppien ultraäänikäsittelyyn.

Sonotrodissa MTP-24-8-96 on kahdeksan ultraäänianturia mikrotiitterilevyjen kuoppien ultraäänikäsittelyyn.

Matojen ultraäänihomogenointi ja lyysi

C. elegansin lyysiä ja proteiinien uuttoa varten kerättiin näytettä kohti 30 000 kyseisessä kehitysvaiheessa olevaa sukkulamatoa. Ne pestiin jääkylmällä S-basal-liuoksella, konsentroitiin sentrifugoimalla nopeudella 1 500 rpm 2 min ajan, pestiin kuusi kertaa jääkylmällä S-basal-liuoksella jäljelle jääneiden bakteerien poistamiseksi ja säilytettiin sitten jäällä käyttöön asti. Proteiinien uuttoa varten munia kantavien aikuisten matojen annettiin muodostaa tiivis pelletti viimeisen S-basal-pesun jälkeen. Matopelletit suspendoitiin sitten uudelleen 1 ml:aan jääkylmää uuttopuskuria [20 mM kaliumfosfaattia, pH 7,4, 2 mM EDTA, 1 % Triton-X-100, proteaasi-inhibiittorit (Sigma P2714)] ja käsiteltiin välittömästi.
∼30 000 munia kantavaa aikuista matoa (vastaa ∼100 mg:n märkäpainoa) ultraäänikäsiteltiin jäällä anturityyppisellä ultraäänilaitteella (esim. UP50H ja mikrokärki MS2) 40 %:n amplitudilla 10 jaksossa, joissa laite oli 3 sec päällä ja 30 sec pois, 1 ml:ssa jääkylmää uuttopuskuria. (ks. Baskharan et al. 2012)

Lipidien ultraääniuutto C. elegansista

Lipidomiikassa, joka on metabolomiikan osa-alue, karakterisoidaan ja analysoidaan biologisten järjestelmien lipidikokonaisuutta. C. elegansia käytetään laajalti lipidomiikassa aineenvaihdunnan lipidien vuorovaikutusten sekä niiden terveyteen ja elinikään kohdistuvien vaikutusten tutkimiseen.
Ultraäänilyysiä ja -uuttoa käytetään lipidien, kuten sfingolipidien, vapauttamiseen C. elegansin alkioista, toukista ja aikuisista madoista. Ultraäänikäsittelyä käytetään matohomogenaattien valmistukseen ja sen jälkeen lipidien uuttamiseen näytteestä.
Protokolla lipidien ultraääniuuttoon C. elegansista
Sulata C. elegans -pelletti jäällä ja suspendoi se uudelleen 0,5 ml:aan ultrawater-vettä. Ultraäänikäsittele C. elegans -näytteet 1,5 mL:n koeputkissa pitäen näytteet jatkuvasti jäällä.
Ultraäänikäsittely voidaan tehdä anturityyppisellä ultraäänilaitteella, kuten laitteella UP200Ht, näytteiden valmisteluun tarkoitetulla ultraääniyksiköllä VialTweeter (10 näytteen samanaikainen ultraäänikäsittely) tai laitteella UIP400MTP (monikuoppalevyjen, kuten 96-kuoppalevyjen, ultraäänikäsittelyyn).
Käytä laitteella UP200Ht tehtävään ultraäänilyysiin mikrokärkeä S26d2. Esiaseta ultraäänen jaksotila digitaalisessa valikossa. Aseta amplitudiksi 10 % ja ultraäänikäsittelyn jaksotilaksi 20 jaksoa, joissa pulssit kestävät 2 sec ja kunkin ultraäänipulssin välillä on 30 sec tauko.
Siirrä supernatantit kierrekorkillisiin lasiputkiin. 
Tee Folch-uutto lisäämällä kuhunkin lasiputkeen 1 ml ultrawateria ja sen jälkeen 6 ml kloroformi-metanoliseosta (suhde = 2:1).
Sekoita kutakin lasiputkea vorteksisekoittimella 30 sec ajan 4 kertaa. 
Sentrifugoi putkia 1 258 x g:llä 15 min ajan (Eppendorf, 5810 R) faasien erottumisen tehostamiseksi edelleen. 
Siirrä alempi hydrofobinen fraktio puhtaaseen lasiputkeen lasisella Pasteur-pipetillä. 
Kuivaa alempi hydrofobinen fraktio typpivirrassa typpihaihduttimessa. 
Säilytä kuivattu pelletti -80 °C:n pakastimessa käyttöön asti. 


Matolysaattien valmistus ultraäänellä

Matolysaatti: L4-vaiheen madot kerättiin ja pestiin kolmesti M9-puskurilla (42,26 mM Na2HPO4, 22,04 mM KH2PO4, 85,56 mM NaCl ja 0,87 mM MgSO4) kaikkien bakteerien poistamiseksi. Kun M9-puskuria oli poistettu mahdollisimman paljon, madot suspendoitiin uudelleen lyysipuskuriin: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 5 mM β-glyserolifosfaattia, 0,1 % (v/v) Triton X-100, 50 mM natriumfluoridia, 1 mM natriumortovanadaattia, 5 mM natriumpyrofosfaattia, 0,2 mM fenyylimetaanisulfonyylifluoridia ja proteaasi-inhibiittori. Madot jäädytettiin nestetypessä ja sulatettiin 37 °C:ssa kolme kertaa, minkä jälkeen ne ultraäänikäsiteltiin kuivajäällä ultraääniyksiköllä VialTweeter, jolla voidaan valmistella samanaikaisesti 10 näyteputkea. Ultraäänikäsittely tehtiin 50 %:n amplitudilla 10 jaksossa, joista kukin kesti 2 sec ja joiden välillä oli 30 sec tauko. Tämän jälkeen näytteitä sentrifugoitiin nopeudella 12 000 rpm 4 °C:ssa 15 min ajan. Supernatantti kerättiin ja säilytettiin -70 °C:ssa. Näyteosuutta käytettiin proteiinien määritykseen Bradford-menetelmällä.
Kokonaisglutationin, GSH:n ja GSSG:n määritys: glutationin määritystä varten lysaatit valmistettiin ja määritys tehtiin samana päivänä. Glukoosilla ruokitut ja kontrolliryhmän L4-toukat kerättiin ja pestiin M9-puskurilla kolme kertaa. Kun M9-puskuria oli poistettu mahdollisimman paljon, madot suspendoitiin uudelleen jääkylmään metafosforihappoon (5 % w/v), minkä jälkeen madot ultraäänikäsiteltiin jäässä ultraäänilaitteella VialTweeter 50 %:n amplitudilla kymmenessä 2 sec kestävässä ultraäänikäsittelyjaksossa, joiden välillä oli 30 sec tauko. Tämän jälkeen niitä sentrifugoitiin nopeudella 12 000 rpm 4 ̊C:ssa 15 min ajan.
(ks. Alcántar-Fernández et al., 2018)

C. elegans -näytteiden valmistelu ennen immunosaostusta ja Western blot -analyysiä

Lyhyesti kuvattuna alkioiden uutteita varten C. elegansin L1-toukat kasvatettiin aikuisiksi laajamittaisissa nestemäisissä S-elatusaineviljelmissä. Alkiot kerättiin tavanomaisella valkaisumenetelmällä ja suspendoitiin lyysipuskuriin (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7 % glyserolia, 0,05 % NP-40, 1􏰅 proteaasi-inhibiittoriseosta sekä 1􏰅 fosfataasi-inhibiittoriseoksia I ja II), jäädytettiin nopeasti nestetypessä ja lysoitiin ultraäänellä tehtävällä solujen hajotuksella käyttäen mikrokärjellä varustettua ultraäänilaitetta, kuten laitetta UP200Ht ja kärkeä S26d2, 10 pulssilla 10 s aikana 30 %:n amplitudilla. Jos on valmisteltava suurempi määrä näytteitä, suositellaan ultraäänilaitetta VialTweeter tai kuoppalevyille tarkoitettua usean näytteen ultraäänilaitetta UIP400MTP. Ultraäänikäsittelyn jälkeen uutteet esikirkastettiin sentrifugoimalla 30 000 g:llä 20 min ajan 4 °C:ssa. Esikirkastettua uutetta (300 µg kokonaisproteiinia) inkuboitiin affiniteettipuhdistetun anti-CDC-25.1-vasta-aineen (40 µ􏰂g; tämä tutkimus) kanssa, joka oli ristisidottu proteiini A -agaroosiin, tai kontrollina käytettiin vastaavaa määrää proteiini A -agaroosiin ristisidottua kanin immunoglobuliini (Ig)G:tä. Kokonaistilavuus oli 200 µl lyysipuskuria, joka sisälsi 1 % NP-40:tä; sen lisääminen vähensi proteiinien epäspesifistä sitoutumista matriisiin. Näytteitä pyöritettiin 1 h ajan 4 °C:ssa, helmet pestiin kolmesti lyysipuskurilla ja eluoitiin 30 µl:lla glysiini/HCl-liuosta ja 200 mM NaCl:ää, pH 2,2. Immunosaostuksen jälkeen eluaatit laimennettiin 30 µ􏰂l:aan SDS-näytepuskuria, kuumennettiin 95 °C:seen 4 min ajaksi, ja tyypillisesti lähtönäytteestä 3 % kokonaismäärästä ja eluaateista 30 % ajettiin SDS-PAGE:ssa. Sen jälkeen tehtiin Western blot -analyysi anti-CDC-25.1- (1:400), anti-LIN-23- (1:750), anti-ubikitiini- (1:1000), anti-GSK3􏰁- (1:500) tai anti-􏰁β-aktiinivasta-aineilla (1:2000). Kun uutteille ei tehty immunosaostusta, niistä peräisin oleva sama kokonaisproteiinimäärä suspendoitiin uudelleen SDS-näytepuskuriin, kuumennettiin 95 °C:seen ja ajettiin sitten suoraan SDS-PAGE:ssa sekä analysoitiin Western blot -menetelmällä. (ks. Segref et al. 2020)

Anturityyppinen ultraäänilaite UP200St lyysiin

Ultraäänikäyttöinen solujen hajotuslaite UP200St ja mikrokärki S26d2 lyysiin ja proteiinien uuttoon

Ultraäänilyysi tarkasti säädellyssä lämpötilassa

VialTweeter on usean näytteen ultraäänilaite, joka mahdollistaa luotettavan näytteiden valmistelun tarkasti säädellyissä lämpötilaolosuhteissa.Tarkka ja luotettava lämpötilan säätely on ratkaisevan tärkeää biologisia näytteitä käsiteltäessä. Korkeat lämpötilat käynnistävät näytteissä lämmön aiheuttaman proteiinien hajoamisen.
Kuten kaikki mekaaniset näytteiden valmistelumenetelmät, myös ultraäänikäsittely tuottaa lämpöä. Näytteiden lämpötilaa voidaan kuitenkin säädellä hyvin käyttämällä laitetta VialTweeter. Esittelemme erilaisia tapoja seurata ja säädellä näytteidesi lämpötilaa, kun valmistelet niitä analyysiä varten laitteilla VialTweeter ja VialPress.

  1. Näytteen lämpötilan seuranta: ultraääniprosessori UP200St, joka käyttää laitetta VialTweeter, on varustettu älykkäällä ohjelmistolla ja liitettävällä lämpötila-anturilla. Liitä lämpötila-anturi laitteeseen UP200St ja työnnä lämpötila-anturin kärki yhteen näyteputkista. Voit asettaa näytteesi ultraäänikäsittelylle tietyn lämpötila-alueen laitteen UP200St valikossa digitaalisen värikosketusnäytön avulla. Ultraäänilaite pysähtyy automaattisesti, kun enimmäislämpötila saavutetaan, ja pitää tauon, kunnes näytteen lämpötila on laskenut asetetun lämpötilaeron ∆ alarajalle. Sitten ultraäänikäsittely käynnistyy automaattisesti uudelleen. Tämä älykäs toiminto estää lämmön aiheuttaman hajoamisen.
  2. Laitteen VialTweeter lohko voidaan esijäähdyttää. Laita laitteen VialTweeter lohko (vain sonotrodi ilman ultraäänimuunninta!) jääkaappiin tai pakastimeen. Titaanilohkon esijäähdytys auttaa viivästyttämään näytteen lämpötilan nousua. Myös itse näyte voidaan esijäähdyttää, jos se on mahdollista.
  3. Käytä kuivajäätä jäähdytykseen ultraäänikäsittelyn aikana. Täytä matala astia kuivajäällä ja aseta VialTweeter kuivajään päälle, jotta lämpö pääsee poistumaan nopeasti.

Löydä optimaalinen ultraäänikäyttöinen solujen hajotuslaite lyysisovellukseesi

Hielscher Ultrasonics on pitkän kokemuksen omaava valmistaja, joka tuottaa suorituskykyisiä ultraäänikäyttöisiä solujen hajotuslaitteita ja homogenisaattoreita laboratorioihin, pöytämittakaavan järjestelmiin ja teollisen mittakaavan järjestelmiin. Bakteerisoluviljelmäsi koko, tutkimus- tai tuotantotavoitteesi sekä tunnissa tai päivässä käsiteltävien solujen tilavuus ovat olennaisia tekijöitä oikean ultraäänikäyttöisen solujen hajotuslaitteen löytämisessä sovellukseesi.
Hielscher Ultrasonics tarjoaa erilaisia ratkaisuja usean näytteen samanaikaiseen ultraäänikäsittelyyn (jopa 10 näyteputkea) sekä suurten näytemäärien käsittelyyn (eli mikrotiitterilevyt / 96-kuoppalevyt). Valikoima ulottuu perinteisistä anturityyppisistä laboratorion ultraäänilaitteista, joiden tehot ovat 50–400 wattia, täysin teollisiin ultraääniprosessoreihin, joiden teho on jopa 16 000 wattia yksikköä kohti ja jotka on tarkoitettu kaupalliseen solujen hajotukseen ja proteiinien uuttoon laajamittaisessa tuotannossa. Kaikki Hielscher-ultraäänilaitteet on suunniteltu 24/7/365-käyttöön täydellä kuormalla. Kestävyys ja luotettavuus ovat ultraäänilaitteidemme keskeisiä ominaisuuksia.
Kaikki digitaaliset ultraäänihomogenisaattorit on varustettu älykkäällä ohjelmistolla, värikosketusnäytöllä ja automaattisella tietojen tallennuksella, jotka tekevät ultraäänilaitteesta kätevän työvälineen laboratorioissa ja tuotantolaitoksissa.
Kerro meille, millaisia soluja, kuinka suuria tilavuuksia, kuinka usein ja mihin tarkoitukseen sinun on käsiteltävä biologisia näytteitäsi. Suosittelemme prosessisi vaatimuksiin parhaiten sopivaa ultraäänikäyttöistä solujen hajotuslaitetta.

Alla oleva taulukko antaa käsityksen ultraäänijärjestelmiemme likimääräisestä käsittelykapasiteetista kompakteista käsikäyttöisistä homogenisaattoreista ja usean näytteen ultraäänilaitteista kaupallisiin sovelluksiin tarkoitettuihin teollisiin ultraääniprosessoreihin:

Erätilavuus Tilavuusvirta Suositellut laitteet
96-kuoppalevyt / mikrotiitterilevyt n.a. UIP400MTP
10 näyteputkea, kukin 0,5–1,5 mL n.a. VialTweeter laitteessa UP200St
0,01–250 mL 5–100 mL/min UP50H
0,01–500 mL 10–200 mL/min UP100H
10–2 000 mL 20–400 mL/min UP200Ht, UP400St
0,1–20 L 0,2–4 L/min UIP2000hdT
10–100 L 2–10 L/min UIP4000hdT
n.a. 10–100 L/min UIP16000
n.a. suurempi laiteryhmä, joka koostuu laitteista UIP16000

Ota yhteyttä! / Kysy meiltä!

Pyytäkää lisätietoja

Pyytäkää alla olevalla lomakkeella lisätietoja ultraääniprosessoreista, käyttökohteista ja hinnasta. Keskustelemme mielellämme kanssanne prosessistanne ja tarjoamme vaatimuksenne täyttävän ultraäänijärjestelmän!





Suuria leikkausvoimia tuottavia ultraäänihomogenisaattoreita käytetään laboratorio-, pöytä-, pilotti- ja teollisen mittakaavan käsittelyssä.

Hielscher Ultrasonics valmistaa suorituskykyisiä ultraäänihomogenisaattoreita sekoitussovelluksiin, dispergointiin, emulgointiin ja uuttoon laboratorio-, pilotti- ja teollisessa mittakaavassa.

Kirjallisuus / Viitteet



Hyödyllistä tietoa

Caenorhabditis elegans

C. elegans on vapaana elävä, läpinäkyvä, noin 1 mm:n pituinen sukkulamato, joka syö bakteereita (esim. E. coli) ja jonka elinkaari on suhteellisen lyhyt. C. elegansin laboratoriokannan (N2) keskimääräinen elinikä on 20 °C:ssa noin 2–3 viikkoa ja sukupolven pituus 3–4 päivää. Kun C. elegansia kasvatetaan suuria määriä, mikä on helppoa tarkasti säädellyissä laboratorio-olosuhteissa, niiden avulla voidaan helposti seuloa uusien lääkkeiden toimintaperiaatteita sekä niiden vaikutuksia ja vuorovaikutuksia ihmisen sairauksien monimutkaisissa molekyyliprosesseissa. Lyhyt genomi, lyhyt elinkaari ja helppo käsittely laboratorio-olosuhteissa tekevät C. elegansista ihanteellisen mallieliön esimerkiksi genomiikan, proteomiikan, kehitysbiologian, sairaustutkimuksen ja lääkekehityksen tutkimukseen.
Caenorhabditis elegans -madot voivat olla joko koiraita tai hermafrodiitteja. Hermafrodiiteilla on sekä koiraan että naaraan lisääntymiselimet. Naarasmatoja ei kuitenkaan ole. Hermafrodiitit voivat joko hedelmöittää itsensä tai lisääntyä koirasmatojen kanssa. C. elegans voi tuottaa yli 1 000 munaa joka päivä.
Koska C. elegans on yksi yksinkertaisimmista hermoston omaavista eliöistä, tätä sukkulamatoa on käytetty tutkimuksen mallieliönä vuodesta 1963 lähtien. Hermosolut eivät tuota aktiopotentiaaleja eivätkä ilmennä jänniteherkkiä natriumkanavia. Hermafrodiitilla tämä järjestelmä koostuu 302 hermosolusta, joiden kytkentäverkosto on kartoitettu kattavasti niin sanotuksi konnektomiksi.
Monilla C. elegansin genomin geeneillä on toiminnallisia vastineita ihmisessä, mikä tekee siitä erittäin hyödyllisen mallin ihmisen sairauksien tutkimiseen. Sitä käytetään esimerkiksi kehitysbiologian, ikääntymisen ja pitkäikäisyyteen vaikuttavien tekijöiden tutkimiseen. Lisäksi C. elegansin mutantit tarjoavat malleja moniin ihmisen sairauksiin, kuten neurologisiin sairauksiin (esim. Alzheimerin tauti), synnynnäisiin sydänsairauksiin ja munuaissairauksiin.
Nämä tekijät tekivät C. elegansista erittäin arvokkaan mallin monille tutkimusaloille. Niinpä C. elegans oli ensimmäinen monisoluinen eliö, jonka koko genomi sekvensoitiin. Genomi sisältää arviolta 20 470 proteiinia koodaavaa geeniä. Noin 35 %:lla C. elegansin geeneistä on homologit ihmisessä. Merkille pantavaa on, että ihmisen geenien on toistuvasti osoitettu korvaavan C. elegansin homologinsa, kun ne siirretään C. elegansiin. Vastaavasti monet C. elegansin geenit voivat toimia samoin kuin nisäkkäiden geenit.

C. elegansin elinikä on noin 3 viikkoa, ja sen elinkaari koostuu kuudesta vaiheesta: alkionkehityksestä (munavaihe), neljästä toukkavaiheesta (L1–L4) ja aikuisvaiheesta. Sukkulamadot kuoriutuvat munista L1-toukiksi, jotka koostuvat 560 solusta. Kasvu kussakin toukkavaiheessa tapahtuu solujen jakautumisen ja solujen hypertrofian kautta. Kutikulan vaihtuminen rytmittää kutakin toukkavaihetta. Jos ankarat ympäristöolosuhteet viestivät kehittyvälle madolle, että olosuhteet eivät todennäköisesti tue aikuisen lisääntymiskykyä, C. elegans voi muuttaa kehitystään ja muodostaa vaihtoehtoisen L3-toukkavaiheen, jossa toukat siirtyvät dauer-vaiheeseen. Tässä tilassa eläimet sietävät poikkeuksellisen hyvin stressiä, ovat pitkäikäisiä ja voivat selviytyä kolmesta yhdeksään kuukautta. Dauer-toukat suojautuvat epäsuotuisilta oloilta sulkemalla sekä suu- että peräaukko-ontelonsa, kutistamalla suolensa ja käynnistämällä daf-16/FOXO-riippuvaisen geneettisen ohjelman, joka muun muassa johtaa dauer-vaiheelle ominaisen kutikulan ilmentymiseen. (ks. Henderson et al., 2006)

C. elegansin dauer-toukat

Dauer-toukiksi kutsutaan sukkulamatojen toukkia, jotka ovat siirtyneet vaihtoehtoiseen kehitysvaiheeseen. Termiä ”dauer-toukat” käytetään erityisesti Rhabditidae-heimon madoista, kuten Caenorhabditis elegansista. Sana ”Dauer” on saksalaista alkuperää ja tarkoittaa ”kestoa” merkityksessä ”ajanjakso”. Dauer-toukat siirtyvät eräänlaiseen lepotilaan ja voivat selviytyä ankarista olosuhteista. Ympäristöolosuhteet määräävät, siirtyykö toukka dauer-vaiheeseen ja milloin. Dauer-toukkia tutkitaan laajasti biologiassa, koska niillä on poikkeuksellinen kyky selviytyä ankarissa ympäristöissä ja elää pitkään. Esimerkiksi C. elegansin dauer-toukat voivat selviytyä jopa neljä kuukautta, mikä on paljon pidempään kuin niiden keskimääräinen noin kolmen viikon elinikä normaalissa lisääntymiseen johtavassa kehityksessä.

Yleiskatsaus C. elegansin elinkaareen

C. elegansin kehitys suotuisissa ympäristöissä:
Caenorhabditis elegansin (C. elegans) kehitys etenee eri tavoin suotuisissa ja epäsuotuisissa ympäristöolosuhteissa.
 
C. elegansin vaste suotuisiin olosuhteisiin:
Suotuisissa olosuhteissa mikroskooppinen sukkulamato Caenorhabditis elegans (C. elegans) noudattaa tarkasti määriteltyä kehityskulkua. Sukkulamato käy elinkaarensa yleensä läpi melko nopeasti, kun ympäristöolosuhteet ovat optimaaliset, tavallisesti lämpötilan ollessa 15 °C – 20 °C.

  1. Lisääntymiseen johtava kehitys: C. elegans aloittaa elinkaarensa alkiona. Sen jälkeen se käy läpi neljä erillistä toukkavaihetta, joiden lyhenteet ovat L1–L4.
  2. Aikuisvaihe: Neljän toukkavaiheen jälkeen C. elegans saavuttaa aikuisvaiheen vain 3–5 päivässä. Tässä vaiheessa madot kykenevät lisääntymään ja elävät vielä 2–3 viikkoa ympäristötekijöistä riippuen.

 
C. elegansin vaste epäsuotuisiin olosuhteisiin:

C. elegans on kuitenkin sitkeä eliö ja voi sopeutua epäsuotuisiin olosuhteisiin dauer-vaiheen muodostumiseksi kutsutun prosessin avulla.

  1. Dauer-vaiheen muodostuminen: Kun ympäristöolosuhteet muuttuvat epäsuotuisiksi esimerkiksi liian suuren populaatiotiheyden, rajallisen ravinnonsaannin tai korkeiden lämpötilojen vuoksi, C. elegans voi siirtyä poikkeukselliseen kolmanteen toukkavaiheeseen, jota kutsutaan dauer-vaiheeksi ja jonka lyhenne on L3d.
  2. Selviytyminen dauer-vaiheessa: Dauer-toukat ovat erityisesti sopeutuneet selviytymään ankarissa olosuhteissa. Ne voivat elää tässä vaiheessa useita kuukausia säästäen energiaa ja kestäen haastavia ympäristöjä.

 

Palautuminen suotuisissa ympäristöissä:
C. elegansin merkittävä ominaisuus on sen kyky palata normaaliin elinkaareen olosuhteiden parantuessa.

  1. Paluu suotuisiin olosuhteisiin: Kun C. elegansin dauer-toukat kohtaavat jälleen suotuisat olosuhteet, kuten runsaan ravinnonsaannin, pienemmän populaatiotiheyden ja sopivat lämpötilat, ne havaitsevat ympäristön muutoksen.
  2. Palautuminen ja lisääntyminen: Vasteena näihin parantuneisiin olosuhteisiin dauer-toukat käyvät läpi ”palautumiseksi” kutsutun prosessin. Palautumisen aikana ne siirtyvät takaisin toukkavaiheisiin ja kehittyvät lopulta lisääntymiskykyisiksi aikuisiksi, joiden elinikä on normaali.

 
Tämä kyky siirtyä kehitysvaiheesta toiseen ympäristöolosuhteiden mukaan on C. elegansin biologian erityispiirre. Sen avulla ne voivat selviytyä ja lisääntyä tehokkaasti monenlaisissa olosuhteissa, mikä tekee niistä arvokkaan mallieliön tieteellisessä tutkimuksessa, erityisesti kehityksen, genetiikan ja ikääntymisen tutkimuksessa.

Keskustelemme mielellämme prosessistanne.

✕