C. Elegans -näytteiden ultraäänivalmistus

C. elegans, sukkulamato, on laajalti käytetty malliorganismi biologiassa. Näytteen valmistus ennen analyysiä vaatii lyysiä, proteiinien ja lipidien uuttamista sekä RNA: n pirstoutumista, joka voidaan luotettavasti suorittaa sonikaatiolla. Ultraäänisolujen häiritsijät ovat luotettavia, hienostuneita ja helppokäyttöisiä laitteita C. elegans -näytteiden nopeaan valmistukseen.

C. Elegans -näytteiden ultraäänivalmistus

C. elegans ovat pyöreitä matoja, joita käytetään laajalti tutkimuslaboratorioissa genomiikan, kehitysbiologian ja sairauksien tutkimiseen. Monilla C. elegansin genomin geeneillä on toiminnallisia vastineita ihmisillä. Siten sukkulamatoto on erittäin hyödyllinen malli ihmisten sairauksiin. Muita etuja C. elegansin laajalle käytölle ovat sen helppo ja halpa viljely bakteereja (esim. E. coli) sisältävillä levyillä, läpinäkyvyys, kätevä käsittely sekä mahdollisuus jäädyttää ja säilyttää matoja pidempään.
Proteiini- ja lipidianalyysi ovat säännöllisiä menetelmiä laboratorioissa, ja ultraääninäytteiden valmistus on vakiintunut menetelmä C. elegans -sukkulamatojen hajottamiseksi kaikissa kehitysvaiheissa (eli alkiot, toukat L1-L4, aikuiset). Koska C. elegansia käytetään myös proteiinien ilmentymisjärjestelmänä kohdeproteiinien yli-ilmentymiseen, tarvitaan luotettava, toistettavissa oleva hajoamis- ja proteiiniuuttomenetelmä, joka antaa korkeat proteiinisaannot. Ultraäänisolujen häiriö- ja uuttojärjestelmiä on saatavana koetintyyppisinä homogenisaattoreina ja moninäytteisinä ultraäänilaitteina. Hielscher Ultrasonicsilla on kätevä näytteen valmistelu ja kaikenlaiset näytekokojen numerot, ja sillä on ihanteellinen ultraäänisolujen häiritsijä laboratoriomenettelyyn.

Ultraääniprotokollat C. Elegansin häiriöille ja lyysille

C. elegansin ultraäänihomogenisointi ja lyysi sekä sitä seuraava proteiini- ja lipidiuutto voidaan suorittaa käyttämällä erilaisia homogenointi- ja lyysipuskureita jne. Kaikille lyysiprotokollille on yhteistä, että näytteitä on pidettävä jatkuvasti jäällä proteiinien hajoamisen estämiseksi. Alla esittelemme sinulle joitakin luotettavia ja nopeita ultraäänilyysi- ja uuttoprotokollia korkealaatuisten proteiini- tai lipidipitoisten C. elegans -näytteiden valmistamiseksi.

Ultraääni C. elegans -lyysin edut

• luotettava
• Toistettavissa
• tarkasti lämpötilasäädelty
• luotettava prosessinohjaus
• hellävarainen menetelmä
• helppo levittää
• Turvallinen

Ultraääniproteiinin uuttaminen C. elegans -näytteistä

C. elegans -matojen ultraäänilyysi ja proteiiniuutto voidaan suorittaa käyttämällä erilaisia protokollia. Alla esittelemme sinulle muutamia luotettavia ja nopeita lyysiprotokollia toistettaville proteiiniuuttotuloksille.

Sytosolisen uutteen nopea valmistelu C. elegans -matoista sonikaatiolla

Seuraavan protokollan avulla voit valmistaa C. elegans -lysaatit alle 30 minuutissa.
Kokoelma C. elegans
Valitse haluamasi C. elegans -madot 1,5 ml:n putkifosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS) tai pese ne lautaselta, jossa on 1,5 ml PBS:ää. Sentrifugoi 1 minuutin ajan nopeudella 2000 rpm pelletiksi. Pidä näytteet koko ajan jäällä.
Pese sitten madot kahdesti PBS: llä.
Pese sen jälkeen matoja kahdesti ddH: lla₂O.
Jäähdytä madot uudelleen vähintään 500 ul:aan homogenointipuskuria (HB). Matonäytteet ovat nyt valmiita ultraäänilyysiin.
Proteiiniuutteen laadun parantamiseksi kannattaa ehkä vähentää bakteerikontaminaatiota pesemällä matoja 5 minuutin ajan PBS:ssä ja steriilissä, erittäin puhtaassa vedessä (ddH₂O) tai suorittaa sakkaroosin kellunta. Pidä matonäytteet jatkuvasti jäissä.

Ultraääni C. elegans Lysis Protocol

• Varmista, että valmistelet ultraäänilaitteen etukäteen niin, että ultraäänihomogenisaattori on käyttövalmis (koetin asennettu, sonikaatio-ohjelma esiasetettu).

Jos ultraäänilaite on asennettu jalustalle, aseta jäähaude näyteputkineen ultraäänianturin alle ja aseta ultraäänianturi 1,5 ml: n putkeen.

• C. elegans -lyysissä UP200St: n tai UP200H: n kanssa ultrasonication tulisi suorittaa mikrokärjellä (esim. 2 mm: n anturi S26d2; katso kuva vasemmalla) 40%: n amplitudilla 1 sekunnin ajan 30 sekunnin taukojen välillä. 5 sonikaatiosykliä jokaista 1 sekuntia kohden 30 sekunnin tauoilla ovat ihanteellisia C. elegans -lyysille. Jos suoritat lyysin ensimmäistä kertaa, voit tarkistaa hajoamisen etenemisen pieninä erinä näytteestä jokaisen pulssin jälkeen mikroskoopilla.
• Lyysi suoritetaan onnistuneesti, kun matoja häiritään. Over-sonication johtaa ytimien rikkoutumiseen ja tulee näkyviin, kun näyte saa viskoosia tai vaahtoa. Näytteen hajoamisen estämiseksi käytä tarvittaessa useampia pulsseja. Älä lisää jokaisen ultraäänipulssisyklin aikaa saadaksesi korkealaatuisia proteiiniuutteita.
• Kirkas solulysaatti sentrifugoimalla ultraäänellä lysoituja matoja nopeudella 14 000 rpm 10 minuutin ajan 4 ºC: ssa.
• Tämän jälkeen supernatantti siirretään uuteen putkeen ja valmistellaan immunosaostukseen tai muihin määrityksiin.

Huomautus homogenointipuskurista: Valmistele homogenointipuskuri yllä olevaa ultraäänilyysiprotokollaa varten seuraavasti:

C. elegansin korkean suorituskyvyn hajoaminen 96-kuoppaisissa levyissä UIP400MTP Plate Sonicatorilla

C. elegans Lysis (aikuisten sukkulamatot)
UIP400MTP 80% amplitudi, 20 sykliä (jokainen sonikaatiojakso: 30 sekuntia päällä, 30 sekuntia pois)
Lysis-puskuri:

• Vaihtoehto 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Vaihtoehto 2) koimmunosaostukselle (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (täydellinen proteinaasi-inhibiittoricocktail)

Korkean suorituskyvyn DNA-pirstoutuminen
C. elegans (aikuisten sukkulamatot) DNA 200-300bp: UIP400MTP levysonikaattori – Aseta 80% amplitudi, 30pulssia – joka 30sek päällä, 30sek pois päältä

UIP400MTP Plate Sonicator korkean suorituskyvyn näytteen valmistukseen sonikoi näytteet tasaisesti monikuoppa-, mikrotiitaattorilevyissä ja 96-kuoppalevyissä

C. elegansin ultraäänilyysi kvantitatiivisiin affiniteettipuhdistusmäärityksiin

C. elegans -alkiot (∼2 miljoonaa per rinnakkaisnäyte) kerättiin juuri biologisessa kolminkertaisessa muodossa valkaisemalla nuoria gravid-hermafrodiitteja ja sonikoitiin jäällä (sykli: 0,5 s, amplitudi: 40–45%, 5 iskua / istunto, 5 istuntoa, istuntojen välinen aika: 30 s; UP200S-ultraääniprosessori mikrokärjellä S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) lyysipuskurissa (kokonaistilavuus: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% glyseroli, proteaasi-inhibiittoriseos, 0,1% Nonidet P-40 -korvike). Sonikoinnin jälkeen Nonidet P-40 -korvike lisättiin 1%: iin ja lysaatteja inkuboitiin pään yli hännän pyörimisellä 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan, jota seurasi sentrifugointi 20 000 × g: ssa 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Puhdistettu lysaatti imetään sitten häiritsemättä ylempää lipidikerrosta ja jaetaan puoliksi joko anti-GFP-agaroosihelmiksi tai tukkeutuneiksi kontrollihelmiksi (40–50 μl). Kun helmet oli kierretty pään yli 4 °C:ssa 60–90 minuutin ajan, ne pestiin kerran lyysipuskurilla, joka sisälsi 0,1 % Nonidet P-40 -korviketta, minkä jälkeen ne pestiin kahdesti joko puskurissa I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) tai puskurissa II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) tai molemmat. GFP:MBK-2-alasvetoja varten suoritettiin kaksi erillistä koetta käyttäen erilaisia pesuolosuhteita. Proteiinit eluoituivat ravistelemalla orbitaalisesti 50 μl:ssa 6 M ureaa/2 M tioureaa huoneenlämmössä. MBK-1::GFP-alasvetokokeissa proteiinit eluoituivat kahdesti ravistamalla 50 μl:ssa 8 M guanidiniumkloridia 90 °C:ssa, minkä jälkeen etanoli saostettiin. Eluoituneet proteiininäytteet pilkottiin sitten liuoksessa.
(vrt. Chen et al., 2016)

Ultraäänimaton homogenisointi ja lyysi

C.elegans-lyysi- ja proteiiniuuttomenetelmää varten näytettä kohden kerättiin 30 000 asiaankuuluvan vaiheen nemotodia ja pestiin jääkylmässä S-basaalissa, väkevöitiin sentrifugoimalla nopeudella 1500 kierrosta minuutissa 2 minuutin ajan, pestiin kuusi kertaa jääkylmällä S-basaalilla jäännösbakteerien poistamiseksi ja varastoitiin sitten jäällä, kunnes se oli käyttövalmis. Proteiinin uuttamista varten gravid-aikuisten matojen annettiin muodostaa kompakti pelletti viimeisen S-basaalipesun jälkeen. Matopelletit suspendoitiin sitten uudelleen 1 ml:aan jääkylmää uuttopuskuria [20 mM kaliumfosfaattia, pH 7,4, 2 mM EDTA, 1 % Triton-X-100, proteaasi-inhibiittorit (Sigma P2714)] ja käsiteltiin välittömästi.
∼30 000 gravid-aikuista matoa (vastaa ∼100 mg märkäpainoa) sonikoitiin jäällä käyttämällä koetintyyppistä ultraäänilaitetta (esim. UP50H mikrokärjellä MS2) 40%: n amplitudilla 10 syklin ajan 3 sekuntia, 30 sekuntia pois, 1 ml: ssa jääkylmää uuttopuskuria. (vrt. Baskharan et al. 2012)

Ultraäänilipidien uuttaminen C. elegansista

Lipidomiikassa, metabolomiikan haarassa, karakterisoidaan ja analysoidaan biologisten järjestelmien lipidikomplementtia. C. elegansia käytetään laajalti lipidomiikassa tutkimaan metabolisten lipidien vuorovaikutusta ja niiden vaikutuksia terveyteen ja elinikään.
Ultraäänilyysiä ja uuttamista käytetään lipidien, kuten sfingolipidien, vapauttamiseen C. elegansin alkioista, toukista ja aikuisista matoista. Ultrasonicationia käytetään matohomogenaattien valmistamiseen ja sen jälkeen lipidien uuttamiseen näytteestä.
Protokolla ultraäänilipidien uuttamiseksi C. elegansista
Sulata C. elegans -pelletti jäällä ja suspendoi uudelleen 0,5 ml:aan ultravettä. 
Sonikoidaan C. elegans -näytteet 1,5 ml: n koeputkissa pitäen näytteet jatkuvasti jäällä.
Sonikaatio voidaan suorittaa käyttämällä koetin-ultraäänistoria, kuten UP200Ht, ultraääninäytteen valmisteluyksikkö VialTweeter (10 näytteen samanaikainen sonikaatio) tai UIP400MTP (monikuoppalevyjen, kuten 96-kuoppalevyjen, sonikaatioon). Ultraäänilyysiin UP200Ht: n kanssa käytä mikrokärkeä S26d2. Aseta ultraäänisyklitila digitaaliseen valikkoon. Aseta amplitudi 10%: iin ja sonikaatiosyklitila 2 sekunnin pulsseja 20 syklistä 30 sekunnin tauolla jokaisen ultraäänipulsaatiopurskeen välillä.
Supernatantit siirretään kierrekorkilla varustettuihin lasiputkiin. 
Folch-uutto suoritetaan lisäämällä 1 ml ultravettä kuhunkin lasiputkeen ja lisäämällä sitten 6 ml kloroformin ja metanolin seosta (suhde = 2:1) kuhunkin lasiputkeen.
Pyörre kutakin lasiputkea 30 sekuntia 4 kertaa. 
Sentrifugoidaan putkia 1 258 x g:ssa 15 minuutin ajan (Eppendorf, 5810 R) faasien erotuksen tehostamiseksi entisestään. 
Siirrä alempi hydrofobinen fraktio puhtaaseen lasiputkeen lasisella Pasteur-pipetillä. 
Alempi hydrofobinen jae kuivataan typpivirtauksessa typpihaihduttimessa. 
Säilytä kuivattu sakka -80 °C pakastimessa käyttöön asti.

Matolysaattien ultraäänivalmistus

Matolysaatti: L4-vaiheen madot kerättiin ja pestiin kolme kertaa M9-puskurilla (42,26 mM Na)₂HKO₄, 22,04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl ja 0,87 mM MgSO₄) kaikkien bakteerien poistamiseksi. Kun mahdollisimman paljon M9-puskuria oli poistettu, madot suspendoitiin uudelleen lyysipuskuriin: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1 mM EGTA, 5 mM fosfaatti β-glyseroli, 0,1% (v / v) Triton X-100, 50 mM natriumfluoridi, 1 mM natriumortovanadaatti, 5 mM natriumpyrofosfaatti, 0,2 mM fenyylimetaanisulfonyylifluoridi ja proteaasi-inhibiittori. Madot jäädytettiin nestemäisessä typessä ja sulatettiin 37 ° C: ssa kolme kertaa, sitten matoja sonikoitiin kuivajäällä ultraääni VialTweeter -yksiköllä 10 näyteputken samanaikaiseksi valmistamiseksi. Sonikaatio suoritettiin 50%: n amplitudilla 10 jaksossa 2 sekuntia. 30 sekunnin tauolla sonikaatiopurskeiden välillä. Tämän jälkeen näytteitä sentrifugoitiin nopeudella 12000 rpm 4 °C:ssa 15 minuutin ajan. Supernatantti kerättiin ja säilytettiin -70 °C:ssa. Bradfordin määritys käytti proteiinin kvantifiointiin osamäärää.
Kokonaisglutationin, GSH:n ja GSSG:n määrittäminen: Glutationin kvantifiointia varten lysaatit ja määritys tehtiin samana päivänä. Glukoosilla syötetyt ja kontrolli-L4-toukat kerättiin ja pestiin M9-puskurilla kolme kertaa. Kun mahdollisimman paljon M9-puskuria oli poistettu, madot suspendoitiin uudelleen jääkylmään metafosforihappoon (5% w / v), sitten madot sonikoitiin jäässä ultraääni VialTweeterillä 50%: n amplitudilla kymmenessä sonikaatiosyklissä 2 sekuntia. 30 sekunnin tauko jokaisen syklin välillä. Sen jälkeen sentrifugoidaan nopeudella 12000 rpm 4 ̊C: ssa 15 minuutin ajan.
(vrt. Alcántar-Fernández et ai., 2018)

C. elegans -näytteen valmistelu ennen immunosaostusta ja Western Blottingia

Lyhyesti sanottuna alkiouutteita varten C. elegans L1 -toukkia kasvatettiin laajamittaisissa nestemäisissä S-keskikokoisissa viljelmissä aikuisuuteen asti. Alkiot kerättiin tavanomaisella valkaisumenetelmällä ja suspendoitiin lyysipuskuriin (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% glyseroli, 0,05% NP-40, 1kymmeni��� proteaasi-inhibiittoricocktail ja 1 tuhannensalaatti fosfataasi-inhibiittoricocktail I ja II), jäädytettiin nopeasti nestemäisessä typessä ja lyseerattiin ultraäänisolujen häiriöillä käyttämällä ultraäänilaitetta, jossa on mikrokärki, kuten UP200Ht S26d2:lla 10 pulssille 10 sekunnin aikana 30 %:n amplitudilla. Jos on valmistettava suurempi määrä näytteitä, ultraääni VialTweeter tai suositellaan MultiSample-Ultrasonicator-UIP400MTP kaivolevyille. Sonikoinnin jälkeen uutteet esipuhdistettiin sentrifugoimalla 30 000 g: ssa 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Esipuhdistettua uutetta (300μg kokonaisproteiinia) inkuboitiin 40μ:lla anti-CDC-25.1-affiniteettipuhdistettua vasta-ainetta (tämä tutkimus), joka oli silloitettu proteiini A-agaroosiin, tai kontrollina käytettiin samanlaista määrää kanin immunoglobuliinia (Ig)G, joka oli silloitettu proteiini A-agaroosiin, kokonaistilavuudessa 200 μl lyysipuskuria, joka sisälsi 1% NP-40:tä, jonka sisällyttäminen vähensi proteiinien epäspesifistä sitoutumista matriisiin. Näytteitä pyöritettiin 1 tunti 4 °C:ssa, helmet pestiin kolme kertaa lyysipuskurilla ja eluoituivat 30 μl:lla glysiiniä/HCl ja 200 mM NaCl:a, pH 2,2. Immunosaostuksen jälkeen eluaatit laimennettiin 30 μ:aan SDS-näytepuskuria, kuumennettiin 95 °C:seen 4 minuutiksi, ja tyypillisesti 3 % kokonaispitoisuudesta syöttöä varten ja 30 % eluaatteja varten levitettiin SDS-PAGE:lle, jota seurasi Western blottaus anti-CDC-25.1:llä (1:400), anti-LIN-23:lla (1:750), anti-ubikitiinilla (1:1000), anti-GSK3:��� (1:500) tai anti-mutaatio-3 β-aktiinilla (1:2000) vasta-aineilla. Jos uutteita ei altistettu immunosaostukselle, sama määrä näistä uutteista saatua kokonaisproteiinia suspendoitiin uudelleen SDS-näytepuskuriin, kuumennettiin 95 °C:seen ja levitettiin sitten suoraan SDS-PAGE:lle ja analysoitiin Western blottingilla. (vrt. Segref ym. 2020)

Ultraäänilyysi Prescise lämpötilan säädössä

Tarkka ja luotettava lämpötilan säätö on ratkaisevan tärkeää biologisia näytteitä käsiteltäessä. Korkeat lämpötilat käynnistävät termisesti indusoidun proteiinin hajoamisen näytteissä.
Kuten kaikki mekaaniset näytteenvalmistustekniikat, sonikaatio luo lämpöä. Näytteiden lämpötilaa voidaan kuitenkin hallita hyvin VialTweeteriä käytettäessä. Esittelemme sinulle erilaisia vaihtoehtoja näytteiden lämpötilan seuraamiseksi ja säätämiseksi valmistellessasi niitä VialTweeterillä ja VialPressillä analysointia varten.

1. Näytteen lämpötilan seuranta: VialTweeteriä ohjaava ultraääniprosessori UP200St on varustettu älykkäällä ohjelmistolla ja kytkettävällä lämpötila-anturilla. Kytke lämpötila-anturi UP200St-laitteeseen ja aseta lämpötila-anturin kärki yhteen näyteputkista. Digitaalisen värillisen kosketusnäytön avulla voit asettaa UP200St: n valikossa tietyn lämpötila-alueen näytteen sonikaatiolle. Ultraäänilaite pysähtyy automaattisesti, kun maksimilämpötila saavutetaan, ja pysähtyy, kunnes näytteen lämpötila on laskenut asetetun lämpötilan ∆ alempaan arvoon. Sitten sonikaatio alkaa automaattisesti uudelleen. Tämä älykäs ominaisuus estää lämmön aiheuttaman hajoamisen.
2. VialTweeter-lohko voidaan esijäähdyttää. Laita VialTweeter-lohko (vain sonotrode ilman anturia!) jääkaappiin tai pakastimeen titaanilohkon esijäähdyttämiseksi, mikä auttaa lykkäämään näytteen lämpötilan nousua. Jos mahdollista, myös itse näyte voidaan esijäähdyttää.
3. Käytä kuivajäätä jäähtymään sonikoinnin aikana. Käytä matalaa alustaa, joka on täytetty kuivajäällä, ja aseta VialTweeter kuivajäälle, jotta lämpö haihtuu nopeasti.

Löydä optimaalinen ultraäänisolujen häiritsijä lyysisovelluksellesi

Hielscher Ultrasonics on pitkäaikainen kokenut korkean suorituskyvyn ultraäänisolujen häiritsijöiden ja homogenisaattoreiden valmistaja laboratorioihin, penkki- ja teollisen mittakaavan järjestelmiin. Bakteerisoluviljelmän koko, tutkimus- tai tuotantotavoitteesi ja prosessoitavan solun määrä tunnissa tai päivässä ovat olennaisia tekijöitä oikean ultraäänisolujen häiritsijän löytämiseksi sovellukseesi.
Hielscher Ultrasonics tarjoaa erilaisia ratkaisuja useiden näytteiden (enintään 10 injektiopulloa) sekä massanäytteiden (eli mikrotitterilevyjen / 96-kuoppalevyjen) samanaikaiseen sonikaatioon, klassiseen koetintyyppiseen laboratorioultraäänilaitteeseen, jolla on erilaiset tehotasot 50 - 400 wattia täysin teollisiin ultraääniprosessoreihin, joissa on jopa 16 000 wattia yksikköä kohti kaupallisten solujen häiriöihin ja proteiinien uuttamiseen suuressa tuotannossa. Kaikki Hielscher-ultraäänilaitteet on rakennettu 24/7/365 toimintaan täydellä kuormituksella. Kestävyys ja luotettavuus ovat ultraäänilaitteidemme keskeisiä ominaisuuksia.
Kaikki digitaaliset ultraäänihomogenisaattorit on varustettu älykkäällä ohjelmistolla, värillisellä kosketusnäytöllä ja automaattisella dataprotokollalla, mikä tekee ultraäänilaitteesta kätevän työvälineen laboratorio- ja tuotantolaitoksissa.
Kerro meille, millaisia soluja, mitä tilavuutta, millä taajuudella ja millä kohteella sinun on käsiteltävä biologisia näytteitäsi. Suosittelemme sinulle sopivinta ultraäänisolujen häiritsijää prosessivaatimuksiisi.

Alla oleva taulukko antaa sinulle viitteitä ultraäänijärjestelmiemme likimääräisestä käsittelykapasiteetista kompakteista kädessä pidettävistä homogenisaattoreista ja MultiSample Ultrasonicators teollisiin ultraääniprosessoreihin kaupallisiin sovelluksiin: