Ultrasuurisen proteiinin uuttaminen kudoksista ja soluviljelmistä
- Proteiini uuttamalla on välttämätön näytteen valmistus askel proteomiikka.
- Proteiinit voidaan uuttaa kasvi- ja eläinkudoksesta, hiivat ja mikro-organismit.
- Sonikoimalla on luotettava, tehokas proteiini uuttamalla menetelmää, joka antaa korkea-proteiinin saannot lyhyen uuttoaika.
Proteiini uutto kudoksista ja soluista
Proteiinien uuttaminen kudoksista ja viljellyistä soluista on olennainen näytteenvalmistusvaihe, joka suoritetaan monien biokemiallisten ja analyyttisten tekniikoiden, kuten ELISA, PAGE, Western blotting, massaspektrometria tai proteiinipuhdistus, aikana. Ultraäänisolujen häiriöt, lyysi ja uuttaminen on tarkasti hallittavissa, ei-terminen tekniikka, jolla varmistetaan proteiinien korkea saanto.
Proteiinin uuttaminen soluista, joissa on ultraäänianturi UP200St
- nopea
- korkeat saannot
- erittäin tehokas
- Tarkan kontrollin parametrit
- toistettavia tuloksia
- lineaarinen skaalautuvuus
Yleiset ohjeet ultraäänilyysiin ja proteiinien uuttamiseen
- Lämpötilan säätö: Varmistaa korkea proteiinin tuotto ilman lämpödenaturaation, lämpötila uuton aikana on valvottava. Hielscher state-of-art ultraääni homogenoijia – kutsutaan myös ultraäänihajoajaksi tai ultraäänipuhdistimeksi – ovat juuri hallittavissa. Ne tulevat plugable lämpötila-anturi. Asettamisessa vaihtoehdot ultraäänihomogenisaattoriin, maksimilämpötila voidaan asettaa. Kun tämä lämpötila max on saavutettu, ultraäänilaitteen pysähtyy automaattisesti, kunnes näyte on jäähtynyt.
- Puskuri: Valinta on sopivassa puskurissa ja oikean puskurin tilavuus vaihtelee kudoksesta kudoksen ja on keksin-out tutkimus-ja-erehdys testaus.
- Eristäminen / puhdistus: Proteiinilysaattien voi sisältää ylimäärin biomolekyylien, kuten DNA: n tai hiilihydraattien, joka voidaan poistaa proteiinisaostuksen (deoksikolaatti-trikloorietikkahappo) tai puskurin vaihto.
Chittapalo ja Noomhorm (2009) raportoivat tutkimuksessaan, että proteiinin saanto kasvoi sonikaatiolla ja että ultraäänikudoksen homogenisointi- ja lyysiprosessi voi parantaa olemassa olevia uuttoprosesseja merkittävästi – mahdollistaa uusia kaupallisia louhinta mahdollisuuksia.
ultraääni CupHorn useiden näytteiden samanaikaiseen, erittäin tehokkaaseen näytteen valmisteluun samoissa olosuhteissa proteiinien eristämiseksi ja DNA:n pirstoutumiseksi.
Proteiini uuttamalla eläinkudoksesta
Täysikokoisen kudoksen (esim. Munuaisten, sydämen, keuhkojen, lihasten jne.) Valmistukseen kudos on leikattava hyvin pieniksi paloiksi puhtailla työkaluilla, jään päälle edullisesti ja mahdollisimman nopeasti estämään proteaasien hajoaminen (esim. lyysauspuskuria, kuten RIPA tai hypotoninen lyysipuskuri, joka sisältää proteaasi- ja fosfataasi-inhibiittori-cocktaattia). Hajotuksen jälkeen näyte upotetaan nestemäiseen typpeä pakastekuivaukseen. Näytettä voidaan säilyttää -80 ° C: ssa myöhempää käyttöä varten tai jättää jäätä välittömään homogenisointiin. Välittömästi ennen ultraäänimittausta, näyteputkiin lisätään nopeasti jääkylmää hajotuspuskuria (proteaasi-inhibiittoreita DTT, leupeptiini ja aprotiniini) (noin 10 mg kudosta suositellaan noin 600 μl puskuria). N. 20-60 mg kudosta suositellaan näyteliukua kohden.
Ultraäänihomogenointi, lyysi ja uuttaminen suoritetaan ultraäänihomogenisaattorilla, kuten UP100H tai UP200Ht, joka on varustettu mikrokärjen sonotrodilla. Sonikoinnin kesto on 60-90 sekuntia ultraäänisyklitilassa 15 sekuntia sonikaatiota ja 10 sekuntia. Näyte on säilytettävä jäässä koko ajan.
Heti ultraäänikäsittelyn jälkeen homogenoinnin / uutto, lysaatti sentrifugoidaan 27,000g n. 20 min. Tämän jälkeen supernatantti kerätään siten, että proteiinipitoisuus voidaan määrittää proteiinin, kuten määritys, Pierce proteiinin määritys BCA.
Proteiini uuttamalla veren seerumin
Seerumin ja fosfaattipuskurin homogeeniselle seokselle näyte pyörretään ensin ennen ultraäänisolujen lyysiä. Ultraäänilyysiä varten näyte sonikoidaan ultraäänilaboratoriohomogenisaattorilla, kuten UP100H: lla 8 sykliä 20%: n amplitudilla, kunkin 5 sekunnin jaksoille päälle ja 15 sekuntia pois. Proteiiniuutto suoritetaan sonikoimalla sykleissä (pulsaatiotila) ja asettamalla näyte jäälle siten, että näytteen ylikuumeneminen ja lämpöhajoaminen vältetään. Koska seerumi sisältää suuren molekyylipainon proteiineja (kuten albumiini, a1-antitrypsiini, transferriini, haptoglobuliini, immunoglobuliini G ja immunoglobuliini A), jotka häiritsevät pienimolekyylipainoisten proteiinien erottumista IEF: n aikana, on suositeltavaa poistaa ne seerumista tyhjennyskolonnin avulla.
Proteiini uuttamalla kasvikudoksen
Tuore, pehmeä kasvien kudos, esim. Sammal jne., Voidaan helposti hajottaa asettamalla hienonnettu näyteaine lyysipuskurille sonikoimalla. Kova, likaiset kasvikudokset, kuten siemenet, kuusen neulat jne., On kuivattava. Jotkut kova, puumaiset kasvimateriaalit on jäädytettävä ja jauhettava nestemäisessä työssä ennen niiden poistamista sonikaatiolla. Kasvinsoluviljelmäsuspensioiden tapauksessa ultraäänikäsittely 30 - 150 sekunnin ajan lyysipuskurissa on useimmiten riittävä. Tiukempi materiaali, kuten kurpitsansiemenet, vaatii voimakkaampaa sonikaatiota, kuten alla on kuvattu.
Pöytäkirja kurpitsan siemeniin kuuluvan albumiinin ultraäänimitteesta
Albumiinin ultraääniproteiiniuuttoa varten hienoksi jauhetusta kurpitsansiemenjauheesta lisätään 10 g rasvatonta kurpitsansiemenjauhetta ja 100 ml deionisoitua vettä liuottimena 250 ml: n lasiseen dekantterilasiin. Proteiiniuutto koostuu kahdesta vaiheesta: Ensinnäkin näyte sonikoidaan koetintyyppinen ultraäänilaite UP400St (400W, 24kHz), joka on varustettu sonotrode S24d7: llä. Lasidekantterilasi asetetaan kylmään vesihauteeseen ultraäänihomogenoinnin aikana. Ultrasonicator UP400St: n kytkettävä lämpötila-anturi ja lämpötilan säätöasetukset varmistavat, että näytteen lämpötila pidetään aina alle 30 ° C: ssa. Tarkalla lämpötilan säädöllä sonikoinnin aikana vältetään albumiinin denaturoituminen. Toiseksi uuttaminen suoritettiin sekoittimella nopeudella 200 rpm ja nopeudella 30 °C. Tämän jälkeen dekantterilasi siirretään termostaattiseen ravistelijaan. Globuliini poistuu dialyysissä tislatulla vedellä. Globuliinin poiston jälkeen proteiiniuutteesta voidaan ottaa näyte albumiiniprofiilin määrittämiseksi, minkä jälkeen se säädetään arvoon pI = 3,0 käyttäen 0,1 M HCl:aa albumiinin hyytymiseen. Kiinteä faasi erotetaan sentrifugoimalla 5000 g:ssa 20 °C:ssa ja liuotetaan uudelleen deionisoituun veteen. Albumiinin hyytyminen suoritetaan kahdesti albumiinikonsentraatin proteiinisuhteen lisäämiseksi.
Ultraääni emäksinen proteiini uuttamalla valmistamiseksi proteiinikonsentraatista riisinleseistä osoittaa, että ultraäänikäsittely johtaa suurempaan proteiini saannolla huomattavasti lyhyempi ekstraktioajalla – verrattuna tavanomaisiin uuttomenetelmät.
Näytteen valmistus protokolla toiminnallinen iNOS-entsyymin
Täysin toimivan iNOS-entsyymin saamiseksi (esim. lääkeseulontaan) suositellaan seuraavaa protokollaa: Solususpensio tulee asettaa jäälle ja se sonikoidaan UP100H:lla 10μm:n amplitudilla syklitilassa 5 sekunnin sonikaatiossa ja 25 sekunnin lepotilassa jäällä. Toimenpide tulisi toistaa noin 3 kertaa. Sonikaatiosyklien välinen lepoaika vähentää lämpötilan nousua ja vähentää siten denaturoitumisen riskiä.
Ultraääni Proteiini solubilisointimenetelmä
Sonikoimalla voi kiihdyttää proteiini liukoiseksi prosessi, joka vaatii yleensä useita tunteja. Jotta ei ylikuumentaa näyte ja estää proteiinien hajoaminen ja muutokset ureaa sisältäviä liuoksia, ultraääni purskeet ei pitäisi kestää kauemmin kuin muutaman sekunnin.
Ultraäänilaite UP200Ht 2 mm: n mikrokärjellä S26d2 pienten näytteiden sonikointiin.
Ultraääni Laitteet Proteiiniuutto
Hielscher Ultrasonics tarjoavat laajan valikoiman ultraääni homogenointilaitteet hajoamisen solujen, kudosten, bakteerit, mikro-organismit, hiiva, ja itiöt.
Hielscher-laboratorion ultraäänilaitteet ovat tehokkaita ja helppokäyttöisiä. Ne on rakennettu 24/7-käyttöön, ja ne on suunniteltu kestäviksi ja tehokkaiksi laboratorio- ja pöytälaitteiksi. Kaikkien laitteiden energiantuottoa ja amplitudia voidaan ohjata tarkasti. Laaja lisävarustevalikoima avaa lisää asennusvaihtoehtoja. Digitaalisissa ultraäänilaitteissa, kuten VialTweeter, UP200Ht, UP200St ja UP400St, on integroitu lämpötilan säätö ja sisäänrakennettu SD-kortti automaattista tietojen tallennusta varten.
Useiden näytteiden epäsuoraan, ristikontaminaatioon ja samanaikaiseen sonikointiin tarjoamme VialTweeter tai ultraääni CupHorn.
Alla oleva taulukko antaa sinulle yleiskatsauksen ultraäänilaitteistamme näytteen valmisteluun, solujen häiriöihin ja uuttamiseen. Napsauta laitetyyppiä saadaksesi lisätietoja jokaisesta ultraäänihomogenisaattorista. Hyvin koulutettu ja pitkäaikainen kokemus tekninen henkilökunta auttaa mielellään valitsemaan sopivimman ultraäänilaitteen näytteen valmisteluun!
| erätilavuus | Virtausnopeus | Suositeltavat laitteet |
|---|---|---|
| enintään 10 injektiopulloa tai putkea | n.a | VialTweeter |
| multiwell / mikrotitterilevyt | n.a | UIP400MTP-työkalu |
| useita putkia / astioita | n.a | Cuphorn |
| 1 - 500 ml | 10 - 200 ml / min | UP100H |
| 10-1000ml | 20-200ml/min | Uf200 ः t, UP200St |
| 10 - 2000 ml | 20 - 400 ml / min | UP400St |
Sovelluksesta riippuen, materiaali, ja näytteen tilavuus, suosittelemme sinulle sopivimman setup oman näytteen prep. Ota yhteyttä jo tänään!
Ota meihin yhteyttä! / Kysy meiltä!
Hielscherin digitaalisissa ultraäänilaitteissa on selaimen kaukosäädin ja automaattinen dataprotokolla integroidulla SD-kortilla.
VialTweeter epäsuoran sonication.
Tosiasiat, jotka kannattaa tietää
proteomiikka
Proteomiikassa on tutkimusala, joka tutkii proteiineja ja proteomiin. Proteiinit fullfil suuri joukko elintärkeiden toimintojen organismeja. Proteomin on koko joukko proteiinien ilmaistaan genomin, solu, kudos, tai organismi tietyllä hetkellä. Proteomin vaihtelee ajan myötä ja, tai korostaa, että solu tai organismi läpikäy. Tarkemmin, se on joukko ekspressoidut proteiinit tietyn tyyppisen solun tai organismin, tietyllä hetkellä, määrätyissä olosuhteissa. Termi on sekoitus proteiinien ja genomin. Proteomiikassa on tutkimuksen proteomin.
proteiini
Proteiinit ovat suuria biomolekyylien ns makromolekyylejä – jotka koostuvat yhdestä tai useammasta pitkäketjuisesta aminohappotähteestä. Proteiinit ovat läsnä kaikissa kasviperäisissä ja eläinperäisissä organismeissa, ja ne ovat ratkaisevia useimpien biologisten toimintojen kannalta. Koska proteiinit sisältävät paljon biologista tietoa, ne uutetaan analyyttisiin tarkoituksiin, esim. Proteomista tutkimusta varten. Tärkein proteiinien suorittama toiminto käsittää metabolisen reaktion, DNA: n replikaation, vastineen ärsykkeisiin liittyvän katalyysin ja molekyylien kuljettamisen paikasta toiseen. Proteiinit eroavat toisistaan ensisijaisesti niiden aminohappojen sekvenssissä, jonka geenien nukleotidisekvenssi määrää, ja joka yleensä johtaa proteiinin taittumiseen tiettyyn kolmiulotteiseen rakenteeseen, joka määrittää sen aktiivisuuden. Proteiinit ovat – lisäksi peptidit – yksi tärkeimmistä komponenteista ruokaa. Siksi proteomiikka on tehokas väline ravitsemustieteen prosessien optimoinnin, elintarviketurvallisuus ja ravitsemustilan arviointi.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction on esianalyysimenetelmä analyyttien erottamiseksi ja esikonsentroimiseksi. Yhdessä ultraäänen kanssa pilvipisteiden uuttamista voidaan tehostaa, mikä tekee prosessista tehokkaamman, nopeamman ja ympäristöystävällisemmän. Ultraäänellä pilvipisteen uuttaminen on huomattavasti tehokkaampi menetelmä analyyttien valmistamiseksi. Lue lisää ultraäänellä avustetusta pilvipisteiden uuttamisesta!Geelielektroforeesi
Geelielektroforeesi on suuri erotus- ja analyysi makromolekyylejä, kuten DNA, RNA ja proteiinit sekä niiden fragmentit, jotka perustuvat niiden koon ja varauksen. Sitä käytetään kliinisen kemian proteiinien erottamiseksi varauksen perusteella ja / tai koko (IEF agaroosi, olennaisesti koko riippumattomia) ja biokemian, molekyylibiologian ja proteomiikan erottaa sekapopulaatioon DNA- ja RNA-fragmenttien pituus, koon arvioimiseksi DNA- ja RNA-fragmenttien tai erottamiseksi proteiinien varauksen.
soluviljelmät
Soluviljelmässä on ohjattu kasvava prosessi, jossa soluja viljellään valvotuissa olosuhteissa. Soluviljelmässä olosuhteet vaihtelevat kunkin solutyypin. Yleisesti, ympäristön soluviljelmän koostuu sopivassa astiassa (esim. Petri-maljalle) substraatin tai välineellä, joka toimittaa välttämättömiä ravintoaineita (aminohappoja, hiilihydraatteja, vitamiineja, mineraaleja), kasvutekijät, hormonit ja kaasujen (CO2The2), Ja säätelee fysikaalis-kemiallinen ympäristö (pH: n puskuri, osmoottinen paine, lämpötila). Useimmat solut tarvitsevat pinnalle tai keinotekoinen substraatti, kun taas muut soluviljelmiä voidaan viljellä vapaasti kelluva viljelyväliaineessa (suspensioviljelmässä, solususpensiota).
Massa viljelmiä eläinsolulinjat käytetään teollisessa tuotannossa virus- rokotteiden ja muiden bioteknisesti johdettuja tuotteita. Ihmisen kantasoluja viljellään laajentaa solujen lukumäärä ja erottamaan solut eri somaattisten solujen tyypit transplantaation tarkoituksiin.
kudosnäytteet
Termi kudos on esitetty matkapuhelimen välituote, jossa solu materiaali on organisaatiotasolla solujen välillä ja yksi kokonainen elin. Kudoksen, samanlaisia soluja, samaa alkuperää, jotka yhdessä suorittamaan tietyn toiminnon, kootaan. Toiminnallisilla ryhmittely useita kudoksia, monimutkaisiin rakenteisiin elimet on muodostettu.
Kudos otetaan näyte tutkimusta biologian, histologia / histopatologia, parasitologia, biokemia, immunohistokemia sekä viljellä ja purkaa DNA: ta. Se voidaan erottaa välillä eläimen (osa-alue: nisäkäs kudosta) ja kasvin kudosta. Eläinkudokset ryhmitellään neljään ryhmään sidekudoksen, lihasten, hermoston, ja epiteelikudoksen. Kasvikudosjätteet jakautuu kolmeen kudoksen järjestelmiä: iho, jauhettua kudosta, ja vaskulaarikudoksessa.
Kudosnäytteitä voidaan valmistaa eläimen tai kasvin osia, esim. luu, lihas, lehtiä, jne
kehon nesteiden
Veri, seerumi, plasma, aivo-selkäydinnesteen, syljen ja nivelnesteessä ovat kehon nesteet, jotka tarjoavat suuri lähde diagnostisesti tarvittavat tiedot. Näin ollen, hienostunut valmiste kehon nesteen näytteiden analyysi on tärkeää. Ensimmäinen vaikeus liittyy laajan dynaamisen alueen komponenttien läsnä kehon nesteissä.
Proteiinipitoisuuden määrittämiseen
Bradfordin menetelmällä, Lowry-määritys ja bikinkoniinihappoa (BCA) -määrityksellä ovat yhteisiä määrityksiä määrittää proteiinien pitoisuus. Naudan seerumin albumiini (BSA) on yksi yleisimmin käytetty proteiinia standardina.
hajotuspuskuria
Lyysipuskuria on valinnut mukaisesti solun materiaalin tai kudoksen (kudosviljelmässä, kasvi, bakteerit, sienet, jne.), Ja onko solut ovat rakenteen ja rakenteen tyypistä. Laaja valikoima lyysin puskuroi varten Proteiinien uuttamiseksi, kalvot, ja soluelimiin on formuloitu yhden tai useamman pesuaineita. Pesuaine valitaan yleensä kautta tutkimus-ja-erehdys testejä tai – jos saatavilla – mukaan olemassa olevaan proteiiniin uuttomenettelyä. Pesuaine on oltava yhteensopiva kudoksen kanssa, lähde ja proteiinit. Yleisesti, lievin pesuainetta, joka toimii tietyn kudoksen / proteiini, valitaan säilyttämiseksi maksimaalisen toiminnallisuuden uutteesta. Lisäksi, kun kyseessä on uuttamalla kalvot ja soluelimiin mietoa pesuainetta pitää kalvon ehjänä. Yleisesti käytetty detergenttejä hajoamisen puskureita ovat enimmäkseen ei-ioniset tai kahtaisioniset, esim. CHAPS, deoksikolaatti, Triton ™ X-100, NP40, ja Tween 20: tä.
Esimerkiksi, kudokset kuten aivot, maksa, suoli, munuainen, perna jne. Voidaan yksinkertaisesti puskuroitu RIPA – kuitenkin proteaasi-inhibiittorit ja DTT: tä (esim. geelielektroforeesia) olisi sisällytettävä.
Hajotuspuskuria luustolihasvaurio (jääkylmää): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCI, 2,7 mM KCI, 1 mM MgCI2, 1% Triton X-100, 10% (paino / tilavuus) glyserolia, 1 mM EDTA , 1 mM ditiotreitolia, jota on täydennetty proteaasi-ja fosfataasi-inhibiittori cocktail
Taulukko yhteisen puskureita ja niiden pH-alueella. Yleensä näitä puskureita käytetään yleensä pitoisuuksina, jotka ovat 20-50 mM.
| Puskuri | pH-alue |
|---|---|
| Sitruunahappo – Naoh | 2,2 – 6,5 |
| Natriumsitraatti – Sitruunahappo | 3,0 – 6,2 |
| Natriumasetaattia – etikkahappo | 3,6 – 5,6 |
| Kakodyylihappo natriumsuola – HCl: | 5,0 – 7,4 |
| MY – Naoh | 5,6 – 6,8 |
| Natriumdivetyfosfaatti – dinatriumvetyfosfaattia | 5,8 – 8,0 |
| imidatsoli – HCl: | 6,2 – 7,8 |
| Mopit – Koh | 6,6 – 7,8 |
| trietanoliamiinihydrokloridia – Naoh | 6,8 – 8,8 |
| tris – HCl: | 7,0 – 9,0 |
| HEPES – Naoh | 7,2 – 8,2 |
| trisiini – Naoh | 7,6 – 8,6 |
| natriumtetraboraatiksi – boorihappo | 7,6 – 9,2 |
| bisiiniä – Naoh | 7,7 – 8,9 |
| glysiini – Naoh | 8,6 – 10,6 |
Useimmat puskurit osoittavat pH-riippuvuus lämpötila. Tämä pätee erityisesti Tris-puskureita. PKa muuttuu 8,06 25 ° C: ssa 8,85 0 ° C: ssa.
(PH: n ja pKa puskuria: pH mittaavat vetyionien vesiliuoksessa. PKa (= happodissosiaatiovakio) on siihen liittyvä, mutta tarkempia toimenpiteellä, että se auttaa ennustamaan, miten molekyyli toimii tietyllä PH arvo.)
TRIzolia
TRIzolia on kemiallinen liuos käytetään erottamaan RNA / DNA / proteiini aikana guanidiinitiosyanaatti-fenoli-kloroformiuutolla. Käyttö ultraäänellä avustaa TRIzolia uutto johtaa korkean DNA: n, RNA: n ja proteiinin saannot samasta näytteestä ja loistaa siten muita uuttomenetelmiä.
Kirjallisuus / Viitteet
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.