Proteiinien ultraääniuutto kudoksista ja soluviljelmistä
- Proteiinien uutto on olennainen näytteenkäsittelyvaihe proteomiikassa.
- Proteiineja voidaan uuttaa kasvi- ja eläinkudoksista, hiivoista ja mikro-organismeista.
- Ultraäänikäsittely on luotettava ja tehokas proteiinien uuttomenetelmä, jolla saavutetaan suuri proteiinisaanto lyhyessä uuttoajassa.
Proteiinien uutto kudoksista ja soluista
Proteiinien uutto kudoksista ja viljellyistä soluista on olennainen näytteenkäsittelyvaihe monissa biokemiallisissa ja analyyttisissä menetelmissä, kuten ELISA:ssa, PAGE:ssa, Western blot -menetelmässä, massaspektrometriassa ja proteiinien puhdistuksessa. Ultraäänellä toteutettava solujen hajotus, lyysi ja uutto on tarkasti hallittava, ei-terminen menetelmä, jolla varmistetaan suuri proteiinisaanto.
Proteiinien uutto soluista ultraäänianturilla UP200St
- Nopea
- Suuret saannot
- Erittäin tehokas
- Parametrien tarkka hallinta
- Toistettavat tulokset
- Lineaarinen skaalautuvuus
Yleiset ohjeet ultraäänilyysiin ja proteiinien ultraääniuuttoon
- Lämpötilan hallinta: Suuren proteiinisaannon varmistamiseksi ilman lämpödenaturaatiota lämpötilaa on hallittava uuton aikana. Hielscherin uusinta tekniikkaa edustavat ultraäänihomogenisaattorit – joita kutsutaan myös ultraäänihajottimiksi tai ultraäänikäsittelylaitteiksi – ovat tarkasti hallittavissa. Niiden mukana toimitetaan liitettävä lämpötila-anturi. Ultraäänihomogenisaattorin asetuksissa voidaan määrittää enimmäislämpötila. Kun tämä enimmäislämpötila saavutetaan, ultraäänilaite pysähtyy automaattisesti, kunnes näyte on jäähtynyt.
- Puskuri: Sopivan puskurin valinta ja oikea puskuritilavuus vaihtelevat kudoksen mukaan, ja ne on määritettävä kokeilemalla.
- Eristys / puhdistus: Proteiinilysaatit voivat sisältää liikaa biomolekyylejä, kuten DNA:ta tai hiilihydraatteja, jotka voidaan poistaa proteiinien saostuksella (deoksikolaatti–trikloorietikkahappo) tai puskurinvaihdolla.
Chittapalo ja Noomhorm (2009) raportoivat tutkimuksessaan, että proteiinisaanto kasvoi ultraäänikäsittelyä käytettäessä ja että kudosten ultraäänihomogenointi ja lyysi voivat tehostaa nykyisiä uuttoprosesseja merkittävästi – mahdollistaen uusia kaupallisia uuttosovelluksia.
Ultraäänilaite CupHorn useiden näytteiden samanaikaiseen, erittäin tehokkaaseen käsittelyyn samoissa olosuhteissa proteiinien eristystä ja DNA:n fragmentointia varten.
Proteiinien uutto eläinkudoksesta
Kokonaisen kudoksen (esim. munuaisen, sydämen, keuhkon tai lihaksen) käsittelyä varten kudos tulee pilkkoa hyvin pieniksi paloiksi puhtailla välineillä, mieluiten jäällä ja mahdollisimman nopeasti proteaasien aiheuttaman hajoamisen estämiseksi (esim. lyysipuskuri, kuten RIPA, tai hypotoninen lyysipuskuri, joka sisältää proteaasi- ja fosfataasi-inhibiittoriseoksen). Pilkkomisen jälkeen näyte upotetaan nestemäiseen typpeen pikajäädytystä varten. Näytettä voidaan säilyttää -80°C:ssa myöhempää käyttöä varten tai pitää jäällä välitöntä homogenointia varten. Välittömästi ennen ultraääniuuttoa näyteputkeen lisätään nopeasti jääkylmää lyysipuskuria (joka sisältää proteaasi-inhibiittoreina DTT:tä, leupeptiiniä ja aprotiniinia) (noin ~10 mg:aa kudosta kohti suositellaan noin ~600 μL puskuria). Näyteputkea kohti suositellaan noin 20–60 mg kudosta.
Ultraäänihomogenointi, lyysi ja uutto tehdään ultraäänihomogenisaattorilla, kuten UP100H:lla tai UP200Ht:lla, joka on varustettu mikrokärkisellä sonotrodilla. Ultraäänikäsittelyn kesto on 60–90 s jaksotetussa tilassa, jossa ultraäänikäsittely kestää 15 s ja tauko 10 s. Näyte tulee pitää jäässä koko ajan.
Ultraäänihomogenoinnin / uuton jälkeen lysaattia sentrifugoidaan 27 000g:n voimalla noin 20 min. Tämän jälkeen supernatantti kerätään, jotta proteiinipitoisuus voidaan määrittää proteiinimäärityksellä, kuten Piercen BCA-proteiinimäärityksellä.
Proteiinien uutto veriseerumista
Seerumin ja fosfaattipuskurin homogeenisen seoksen aikaansaamiseksi näyte sekoitetaan ensin vorteksisekoittimella ennen solujen ultraäänilyysiä. Ultraäänilyysiä varten näytettä käsitellään laboratorion ultraäänihomogenisaattorilla, kuten UP100H:lla, 8 jakson ajan 20%:n amplitudilla siten, että kussakin jaksossa käsittely kestää 5 sekuntia ja tauko 15 sekuntia. Proteiinien uutto tehdään jaksotetulla ultraäänikäsittelyllä (pulssitilassa) ja pitämällä näyte jäällä, jotta näytteen ylikuumeneminen ja lämpöhajoaminen vältetään. Koska seerumi sisältää suuren määrän suuren molekyylipainon proteiineja (kuten albumiinia, α1-antitrypsiiniä, transferriinia, haptoglobuliinia, immunoglobuliini G:tä ja immunoglobuliini A:ta), jotka häiritsevät pienen molekyylipainon proteiinien erottamista IEF:n aikana, ne suositellaan poistamaan seerumista poistokolonnilla.
Proteiinien uutto kasvikudoksesta
Tuore, pehmeä kasvikudos, kuten sammal, voidaan hajottaa helposti sijoittamalla pilkottu näytemateriaali lyysipuskuriin ultraäänikäsittelyä varten. Sitkeät, puutuneet kasvikudokset, kuten siemenet ja pihtojen neulaset, tulee jauhaa kuivina. Jotkin kovat, puumaiset kasvimateriaalit on jäädytettävä ja jauhettava nestemäisessä typessä ennen ultraääniuuttoa. Kasvisoluviljelmien suspensioille 30–150 sekunnin ultraäänikäsittely lyysipuskurissa on useimmiten riittävä. Sitkeämpi materiaali, kuten kurpitsansiemenet, vaatii voimakkaamman ultraäänikäsittelyn jäljempänä kuvatulla tavalla.
Menettely albumiinin ultraääniuuttoon kurpitsansiemenistä
Albumiinin ultraääniuuttoa varten hienoksi jauhetusta kurpitsansiemenjauheesta lisätään 250 mL:n lasiseen dekantterilasiin 10 g rasvatonta kurpitsansiemenjauhetta ja liuottimeksi 100 mL deionisoitua vettä. Proteiinien uutto koostuu kahdesta vaiheesta: ensin näytettä käsitellään anturityyppisellä ultraäänilaitteella UP400St (400W, 24kHz), joka on varustettu sonotrodilla S24d7. Lasinen dekantterilasi asetetaan kylmään vesihauteeseen ultraäänihomogenoinnin ajaksi. Ultraäänilaitteen UP400St liitettävä lämpötila-anturi ja lämpötilan hallinta-asetukset varmistavat, että näytteen lämpötila pidetään aina alle 30°C:ssa. Lämpötilan tarkka hallinta ultraäänikäsittelyn aikana estää albumiinin denaturaation. Toisessa vaiheessa uutto tehtiin sekoittimella nopeudella 200 rpm ja lämpötilassa 30°C. Tämän jälkeen dekantterilasi siirretään termostaattiohjattuun ravistelijaan. Globuliini poistetaan dialyysillä tislattua vettä käyttäen. Globuliinin poistamisen jälkeen proteiiniuutteesta voidaan ottaa näyte albumiiniprofiilin määritystä varten, minkä jälkeen se säädetään arvoon pI=3,0 käyttäen 0,1 M HCl:ää albumiinin koaguloimiseksi. Kiinteä faasi erotetaan sentrifugoimalla 5000g:n voimalla 20°C:ssa ja liuotetaan uudelleen deionisoituun veteen. Albumiinin koagulointi tehdään kahdesti proteiinien osuuden lisäämiseksi albumiinikonsentraatissa.
Riisileseistä valmistettavan proteiinikonsentraatin emäksinen ultraääniuutto osoittaa, että ultraäänikäsittely tuottaa suuremman proteiinisaannon merkittävästi lyhyemmässä uuttoajassa – verrattuna tavanomaisiin uuttomenetelmiin.
Näytteenkäsittelymenettely toiminnalliselle iNOS-entsyymille
Täysin toiminnallisen iNOS-entsyymin saamiseksi (esim. lääkeseulontaan) suositellaan seuraavaa menettelyä: solususpensio tulee asettaa jäälle ja käsitellä UP100H:lla 10µm:n amplitudilla jaksotetussa tilassa, jossa ultraäänikäsittely kestää 5 s ja tauko jäällä 25 s. Menettely tulee toistaa noin 3 kertaa. Ultraäänikäsittelyjaksojen välinen tauko vähentää lämpötilan nousua ja siten denaturaation riskiä.
Proteiinien liukoistaminen ultraäänellä
Ultraäänikäsittely voi nopeuttaa proteiinien liukoistumista, joka kestää tavallisesti useita tunteja. Näytteen ylikuumenemisen sekä proteiinien hajoamisen ja muuntumisen estämiseksi ureaa sisältävissä liuoksissa ultraäänipulssien tulee kestää enintään muutaman sekunnin.
Ultraäänilaite UP200Ht varustettuna 2 mm:n S26d2-mikrokärjellä pienten näytteiden ultraäänikäsittelyyn.
Ultraäänilaitteet proteiinien uuttoon
Hielscher Ultrasonics tarjoaa laajan valikoiman ultraäänihomogenisaattoreita solujen, kudosten, bakteerien, mikro-organismien, hiivojen ja itiöiden hajottamiseen.
Hielscherin laboratorioiden ultraäänilaitteet ovat tehokkaita ja helppokäyttöisiä. Ne on rakennettu 24/7-käyttöön ja suunniteltu kestäviksi ja tehokkaiksi laboratorio- ja pöytälaitteiksi. Kaikkien laitteiden energian tuottoa ja amplitudia voidaan säätää tarkasti. Laaja lisävarustevalikoima tarjoaa lisää kokoonpanovaihtoehtoja. Digitaalisissa ultraäänilaitteissa, kuten VialTweeter, UP200Ht, UP200St ja UP400St, on integroitu lämpötilan hallinta ja sisäänrakennettu SD-kortti automaattista tietojen tallennusta varten.
Useiden näytteiden epäsuoraan, ristikontaminaatiottomaan ja samanaikaiseen ultraäänikäsittelyyn tarjoamme laitteen VialTweeter tai ultraäänilaitteen CupHorn.
Alla oleva taulukko antaa yleiskuvan ultraäänilaitteistamme näytteenkäsittelyyn, solujen hajotukseen ja uuttoon. Napsauta laitetyyppiä saadaksesi lisätietoja kustakin ultraäänihomogenisaattorista. Hyvin koulutettu ja pitkän kokemuksen omaava tekninen henkilökuntamme auttaa mielellään valitsemaan näytteenkäsittelyysi parhaiten soveltuvan ultraäänilaitteen!
| Erätilavuus | Tilavuusvirta | Suositellut laitteet |
|---|---|---|
| jopa 10 näytepulloa tai putkea | n.a. | VialTweeter |
| monikuoppalevyt / mikrotiitterilevyt | n.a. | UIP400MTP |
| useita putkia / astioita | n.a. | CupHorn |
| 1–500 mL | 10–200 mL/min | UP100H |
| 10–1000 mL | 20–200 mL/min | UP200Ht, UP200St |
| 10–2000 mL | 20–400 mL/min | UP400St |
Suosittelemme näytteenkäsittelyysi parhaiten soveltuvaa kokoonpanoa sovelluksesi, materiaalisi ja näytetilavuutesi perusteella. Ota yhteyttä jo tänään!
Ota yhteyttä! / Kysy meiltä!
Hielscherin digitaalisissa ultraäänilaitteissa on selainpohjainen etäohjaus ja automaattinen tietojen kirjaus integroidulle SD-kortille.
VialTweeter epäsuoraan ultraäänikäsittelyyn.
Hyödyllistä tietoa
Proteomiikka
Proteomiikka on proteiineja ja proteomia tutkiva tutkimusala. Proteiinit hoitavat eliöissä lukuisia elintärkeitä tehtäviä. Proteomi on kaikkien genomin, solun, kudoksen tai eliön tiettynä ajankohtana ilmentämien proteiinien kokonaisuus. Proteomi vaihtelee ajan sekä soluun tai eliöön kohdistuvien erilaisten vaatimusten tai stressitekijöiden mukaan. Tarkemmin määriteltynä se on tietyssä solu- tai eliötyypissä tiettynä ajankohtana määritellyissä olosuhteissa ilmentyvien proteiinien kokonaisuus. Termi on muodostettu yhdistämällä sanat proteiini ja genomi. Proteomiikka on proteomin tutkimusta.
Proteiini
Proteiinit ovat suuria biomolekyylejä eli makromolekyylejä – jotka koostuvat yhdestä tai useammasta pitkästä aminohappotähteiden ketjusta. Proteiineja esiintyy kaikissa kasvi- ja eläinperäisissä eliöissä, ja ne ovat ratkaisevan tärkeitä useimmille biologisille toiminnoille. Koska proteiinit sisältävät paljon biologista tietoa, niitä uutetaan analyysitarkoituksiin, esimerkiksi proteomiikan tutkimukseen. Proteiinien tärkeimpiin tehtäviin kuuluvat aineenvaihduntareaktioiden katalysointi, DNA:n replikaatio, ärsykkeisiin reagointi ja molekyylien kuljettaminen paikasta toiseen. Proteiinit eroavat toisistaan ensisijaisesti aminohappojärjestyksensä perusteella. Sen määrää niiden geenien nukleotidijärjestys, ja se johtaa tavallisesti proteiinin laskostumiseen tiettyyn kolmiulotteiseen rakenteeseen, joka määrää sen aktiivisuuden. Proteiinit ovat – peptidien ohella – yksi ruoan keskeisistä ainesosista. Siksi proteomiikka on elintarviketieteessä tehokas työkalu prosessien, elintarviketurvallisuuden ja ravitsemuksellisen arvioinnin optimointiin.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction on esianalyyttinen menetelmä analyyttien erottamiseen ja esikonsentrointiin. Ultraäänikäsittelyyn yhdistettynä samepisteuuttoa voidaan tehostaa, jolloin prosessista tulee tehokkaampi, nopeampi ja ympäristöystävällisempi. Ultraäänikäsittelyn avulla samepisteuutto on merkittävästi tehokkaampi analyyttien käsittelymenetelmä. Lue lisää ultraääniavusteisesta samepisteuutosta!
Geelielektroforeesi
Geelielektroforeesi on tärkein menetelmä makromolekyylien, kuten DNA:n, RNA:n ja proteiinien sekä niiden fragmenttien, erottamiseen ja analysointiin niiden koon ja varauksen perusteella. Sitä käytetään kliinisessä kemiassa proteiinien erottamiseen varauksen ja/tai koon perusteella (IEF agaroosissa, pääosin koosta riippumaton) sekä biokemiassa, molekyylibiologiassa ja proteomiikassa DNA- ja RNA-fragmenttien sekapopulaation erottamiseen pituuden perusteella, DNA- ja RNA-fragmenttien koon arviointiin tai proteiinien erottamiseen varauksen perusteella.
Soluviljelmät
Soluviljely on hallittu kasvatusprosessi, jossa soluja viljellään valvotuissa olosuhteissa. Soluviljelyn olosuhteet vaihtelevat solutyypin mukaan. Yleensä soluviljelmän ympäristö koostuu sopivasta astiasta (esim. petrimaljasta) ja alustasta tai väliaineesta, joka tarjoaa välttämättömät ravintoaineet (aminohapot, hiilihydraatit, vitamiinit, kivennäisaineet), kasvutekijät, hormonit ja kaasut (CO2, O2) sekä säätelee fysikaalis-kemiallista ympäristöä (pH-puskuri, osmoottinen paine, lämpötila). Useimmat solut tarvitsevat pinnan tai keinotekoisen alustan, kun taas muita soluviljelmiä voidaan kasvattaa vapaasti viljelyväliaineessa kelluvina (suspensioviljelmä, solususpensio).
Eläinsolulinjojen massaviljelmiä käytetään virusrokotteiden ja muiden bioteknologisesti valmistettujen tuotteiden teolliseen tuotantoon. Ihmisen kantasoluja viljellään solumäärän lisäämiseksi ja solujen erilaistamiseksi erilaisiksi somaattisiksi solutyypeiksi siirtotarkoituksiin.
Kudosnäytteet
Termi kudos kuvaa solutason välirakennetta, jossa solumateriaali on järjestäytymistasoltaan solujen ja kokonaisen elimen välissä. Kudoksessa samankaltaiset, samaa alkuperää olevat solut muodostavat kokonaisuuden, joka hoitaa tiettyä tehtävää. Useiden kudosten toiminnallinen ryhmittyminen muodostaa elinten monimutkaiset rakenteet.
Kudosnäytteitä otetaan biologian, histologian/histopatologian, parasitologian, biokemian ja immunohistokemian tutkimukseen sekä kudosten viljelyyn ja DNA:n uuttoon. Kudokset voidaan jakaa eläinkudoksiin (alaryhmä: nisäkkäiden kudokset) ja kasvikudoksiin. Eläinkudokset jaetaan neljään perustyyppiin: side-, lihas-, hermo- ja epiteelikudokseen. Kasvikudos jaetaan seuraaviin kolmeen kudosjärjestelmään: pintasolukkoon, perussolukkoon ja johtosolukkoon.
Kudosnäytteitä voidaan valmistaa eläinten tai kasvien osista, kuten luusta, lihaksesta ja lehdistä.
Kehon nesteet
Veri, seerumi, plasma, aivo-selkäydinneste, sylki ja nivelneste ovat kehon nesteitä, jotka tarjoavat runsaasti diagnostisesti merkityksellistä tietoa. Siksi kehon nestenäytteiden huolellinen käsittely analyysiä varten on tärkeää. Ensimmäinen vaikeus liittyy kehon nesteiden sisältämien komponenttien laajaan dynaamiseen vaihteluväliin.
Proteiinipitoisuuden määritys
Bradfordin määritys, Lowryn määritys ja bikinkoniinihappomääritys (BCA) ovat yleisiä proteiinipitoisuuden määritysmenetelmiä. Naudan seerumin albumiini (BSA) on yksi useimmin käytetyistä proteiinistandardeista.
Lyysipuskuri
Lyysipuskuri on valittava solumateriaalin tai kudoksen (kudosviljelmä, kasvi, bakteerit, sienet jne.) mukaan sekä sen perusteella, ovatko solut osana rakennetta ja millainen rakenne on kyseessä. Proteiinien, kalvojen ja soluelinten uuttoon on kehitetty laaja valikoima lyysipuskureita, jotka sisältävät yhtä tai useampaa detergenttiä. Detergentti valitaan yleensä kokeilemalla tai – jos saatavilla – olemassa olevan proteiinien uuttomenettelyn perusteella. Detergentin on oltava yhteensopiva kudoslähteen ja proteiinien kanssa. Yleensä valitaan miedoin tietylle kudokselle / proteiinille toimiva detergentti, jotta uutteen toiminnallisuus säilyy mahdollisimman suurena. Lisäksi kalvojen ja soluelinten uutossa mieto detergentti pitää kalvon ehjänä. Lyysipuskureissa yleisesti käytetyt detergentit ovat enimmäkseen ionittomia tai kahtaisionisia, esimerkiksi CHAPS, deoksikolaatti, Triton™ X-100, NP40 ja Tween 20.
Esimerkiksi aivojen, maksan, suoliston, munuaisten ja pernan kaltaiset kudokset voidaan yksinkertaisesti puskuroida RIPA:lla – mutta mukaan tulee lisätä proteaasi-inhibiittoreita ja DTT:tä (esim. geelielektroforeesia varten).
Lyysipuskuri luustolihaskudokselle (jääkylmä): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) glyseroli, 1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitoli täydennettynä proteaasi- ja fosfataasi-inhibiittoriseoksella
Taulukko yleisistä puskureista ja niiden pH-alueista. Näitä puskureita käytetään yleensä 20–50 mM:n pitoisuuksina.
| Puskuri | pH-alue |
|---|---|
| Sitruunahappo – NaOH | 2,2 – 6,5 |
| Natriumsitraatti – sitruunahappo | 3,0 – 6,2 |
| Natriumasetaatti – etikkahappo | 3,6 – 5,6 |
| Kakodyylihapon natriumsuola – HCl | 5,0 – 7,4 |
| MES – NaOH | 5,6 – 6,8 |
| Natriumdivetyfosfaatti – dinatriumvetyfosfaatti | 5,8 – 8,0 |
| Imidatsoli – HCl | 6,2 – 7,8 |
| MOPS – KOH | 6,6 – 7,8 |
| Trietanoliamiinihydrokloridi – NaOH | 6,8 – 8,8 |
| Tris – HCl | 7,0 – 9,0 |
| HEPES – NaOH | 7,2 – 8,2 |
| Trisiini – NaOH | 7,6 – 8,6 |
| Natriumtetraboraatti – boorihappo | 7,6 – 9,2 |
| Bisiini – NaOH | 7,7 – 8,9 |
| Glysiini – NaOH | 8,6 – 10,6 |
Useimpien puskurien pH riippuu lämpötilasta. Tämä pätee erityisesti Tris-puskureihin. pKa muuttuu arvosta 8,06 lämpötilassa 25°C arvoon 8,85 lämpötilassa 0°C.
(Puskurin pH ja pKa: pH mittaa vetyionien pitoisuutta vesiliuoksessa. pKa (= hapon dissosiaatiovakio) on tähän liittyvä mutta tarkempi mitta, sillä se auttaa ennustamaan, miten molekyyli käyttäytyy tietyssä pH-arvossa.)
TRIzol
TRIzol on kemiallinen liuos, jota käytetään RNA:n/DNA:n/proteiinien uuttoon guanidiniumtiosyanaatti–fenoli–kloroformiuutossa. Ultraääniavusteinen TRIzol-uutto tuottaa suuret DNA-, RNA- ja proteiinisaannot samasta näytteestä ja on siten muita uuttomenetelmiä parempi.
Kirjallisuus/Viitteet
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.