Ultraääniproteiinin uuttaminen kudos- ja soluviljelmistä
- Proteiiniuutto on olennainen näytteenvalmistusvaihe proteomiikassa.
- Proteiinit voidaan uuttaa kasvi- ja eläinkudoksesta, hiivoista ja mikro-organismeista.
- Sonikaatio on luotettava ja tehokas proteiiniuuttomenetelmä, joka antaa korkeat proteiinisaannot lyhyessä uuttoajassa.
Proteiinien uuttaminen kudoksista ja soluista
Proteiinien uuttaminen kudoksista ja viljellyistä soluista on olennainen näytteenvalmistusvaihe, joka suoritetaan monien biokemiallisten ja analyyttisten tekniikoiden, kuten ELISA, PAGE, Western blotting, massaspektrometria tai proteiinien puhdistus, aikana. Ultraäänisolujen häiriöt, lyysi ja uuttaminen on tarkasti hallittavissa, ei-terminen tekniikka, jolla varmistetaan proteiinien korkea saanto.
Proteiinien uuttaminen soluista, joissa on ultraäänianturi UP200St
- Nopea
- korkeat saannot
- Erittäin tehokas
- Parametrien tarkka hallinta
- Toistettavat tulokset
- lineaarinen skaalautuvuus
Yleiset ohjeet ultraäänilyysiin ja proteiinien uuttamiseen
- Lämpötilan säätö: Korkean proteiinisaannon varmistamiseksi ilman termistä denaturointia lämpötilaa uuttamisen aikana on valvottava. Hielscherin huipputekniset ultraäänihomogenisaattorit – Kutsutaan myös ultraäänihajotajaksi tai ultraäänipuhdistimeksi – ovat tarkasti hallittavissa. Niiden mukana tulee kytkettävä lämpötila-anturi. Ultraäänihomogenisaattorin asetusvaihtoehdoissa voidaan asettaa maksimilämpötila. Kun tämä maksimilämpötila saavutetaan, ultraäänilaite pysähtyy automaattisesti, kunnes näyte on jäähtynyt.
- Puskuri: Sopivan puskurin ja oikean puskurimäärän valinta vaihtelee kudoksesta toiseen, ja se on selvitettävä yrityksen ja erehdyksen avulla.
- Eristäminen / puhdistus: Proteiinilysaatit voivat sisältää ylimäärän biomolekyylejä, kuten DNA:ta tai hiilihydraatteja, jotka voidaan poistaa proteiinisaostuksella (deoksikolaatti-trikloorietikkahappo) tai puskurinvaihdolla.
Chittapalo ja Noomhorm (2009) raportoivat tutkimuksessaan, että proteiinin saanto kasvoi sonikaatiolla ja että ultraäänikudoksen homogenisointi- ja lyysiprosessi voi parantaa olemassa olevia uuttoprosesseja merkittävästi – uusien kaupallisten louhintamahdollisuuksien mahdollistaminen.
Ultraääni CupHorn useiden näytteiden samanaikaiseen, erittäin tehokkaaseen näytteen valmisteluun samoissa olosuhteissa proteiinien eristämiseksi ja DNA:n pirstoutumiseksi.
Proteiinien uuttaminen eläinkudoksesta
Kokonaisen kudoksen (esim. munuaiset, sydän, keuhkot, lihakset jne.) valmistamiseksi kudos on leikattava hyvin pieniksi paloiksi puhtailla työkaluilla, mieluiten jäällä ja mahdollisimman nopeasti, jotta estetään proteaasien aiheuttama hajoaminen (esim. lyysipuskuri, kuten RIPA tai hypotoninen lyysipuskuri, joka sisältää proteaasia ja fosfataasi-inhibiittoricocktailia). Leikkaamisen jälkeen näyte upotetaan nestemäiseen typpeen pikajäädytystä varten. Näyte voidaan säilyttää -80 °C:ssa myöhempää käyttöä varten tai se voidaan säilyttää jäällä välitöntä homogenointia varten. Välittömästi ennen ultraääniuuttoa näyteputkeen lisätään nopeasti jääkylmälyysipuskuria (proteaasi-inhibiittoreilla DTT, leupeptiini ja aprotiniini) (suositellaan ~ 10 mg kudosta n. ~ 600 μl puskuria). Kudosta suositellaan noin 20-60 mg näyteputkea kohti.
Ultraäänihomogenointi, lyysi ja uuttaminen suoritetaan ultraäänihomogenisaattorilla, kuten UP100H tai UP200Ht, joka on varustettu mikrokärjen sonotrodilla. Sonikaatioaika on 60-90 sekuntia. ultraäänisyklitilassa 15 sekuntia. sonikaatio ja 10 sekuntia. lepoaika. Näyte on pidettävä jäissä koko ajan.
Ultraäänihomogenoinnin / uuttamisen jälkeen lysaattia sentrifugoidaan 27 000 g: ssa noin 20 minuutin ajan. Tämän jälkeen supernatentti kerätään, jotta proteiinipitoisuus voidaan määrittää proteiinimäärityksellä, kuten Pierce-proteiinimäärityksellä BCA.
Proteiinin uuttaminen veren seerumista
Seerumin ja fosfaattipuskurin homogeeniselle seokselle näyte pyörretään ensin ennen ultraäänisolulyysiä. Ultraäänilyysiä varten näyte sonikoidaan ultraäänilaboratoriohomogenisaattorilla, kuten UP100H: lla 8 sykliä 20%: n amplitudilla, kunkin 5 sekunnin jaksojen aikana päälle ja 15 sekuntia pois. Proteiiniuutto suoritetaan sonikoimalla sykleissä (pulsaatiotila) ja asettamalla näyte jäälle siten, että näytteen ylikuumeneminen ja lämpöhajoaminen vältetään. Koska seerumi sisältää suuren molekyylipainon proteiineja (kuten albumiinia, a1-antitrypsiiniä, transferriinia, haptoglobuliinia, immunoglobuliini G: tä ja immunoglobuliini A: ta), jotka häiritsevät pienimolekyylipainoisten proteiinien erottumista IEF: n aikana, on suositeltavaa poistaa ne seerumista tyhjennyspylväällä.
Proteiinien uuttaminen kasvikudoksesta
Tuore, pehmeä kasvikudos, esim. sammal jne., Voidaan helposti häiritä yksinkertaisesti asettamalla hienonnettu näytemateriaali lyysipuskuriin sonikaatiota varten. Sitkeät, puumaiset kasvikudokset, kuten siemenet, kuusen neulaset jne., Tulee jauhaa kuivaksi. Jotkut kovat, puumaiset kasvimateriaalit on jäädytettävä ja jauhettava nestemäisessä typessä ennen kuin ne uutetaan sonikaatiolla. Kasvisoluviljelysuspensioissa 30–150 sekunnin ultraäänikäsittely lyysipuskurissa on enimmäkseen riittävä. Kovempi materiaali, kuten kurpitsansiemenet, vaatii voimakkaampaa sonikaatiota, kuten alla on kuvattu.
Protokolla albumiinin ultraääniuuttoon kurpitsansiemenistä
Albumiinin ultraääniproteiiniuuttoon hienoksi jauhetusta kurpitsansiemenjauheesta lisätään 10 g rasvatonta kurpitsansiemenjauhetta ja 100 ml deionisoitua vettä liuottimena 250 ml: aan lasilasia. Proteiiniuutto koostuu kahdesta vaiheesta: Ensinnäkin näyte sonikoidaan koetintyyppinen ultraäänilaite UP400St (400W, 24kHz), joka on varustettu sonotrode S24d7: llä. Lasinen dekantterilasi asetetaan kylmään vesihauteeseen ultraäänihomogenoinnin aikana. Ultrasonicator UP400St: n kytkettävä lämpötila-anturi ja lämpötilan säätöasetukset varmistavat, että näytteen lämpötila pidetään aina alle 30 ° C: ssa. Tarkalla lämpötilan säädöllä sonikoinnin aikana vältetään albumiinin denaturoituminen. Toiseksi uuttaminen suoritettiin sekoittimella nopeudella 200 rpm ja nopeudella 30 °C. Tämän jälkeen dekantterilasi siirretään termostaattiseen ravistelijaan. Globuliini poistuu dialyysissä tislatulla vedellä. Globuliinin poiston jälkeen proteiiniuutteesta voidaan ottaa näytteitä albumiiniprofiilin määrittämiseksi, minkä jälkeen se säädetään arvoon pI = 3,0 käyttäen 0,1 M HCl:aa albumiinin hyytymiseen. Kiinteä faasi erotetaan sentrifugoimalla 5000 g:ssa 20 °C:ssa ja liuotetaan uudelleen deionisoituun veteen. Albumiinin hyytyminen suoritetaan kahdesti albumiinikonsentraatin proteiinisuhteen lisäämiseksi.
Ultraäänialkalinen proteiiniuutto proteiinikonsentraatin valmistamiseksi riisileseistä osoittaa, että ultraäänikäsittely johtaa suurempaan proteiinisaantoon huomattavasti lyhyemmässä uuttoajassa – verrattuna perinteisiin uuttomenetelmiin.
Näytteen valmistusprotokolla funktionaaliselle iNOS-entsyymille
Täysin toimivan iNOS-entsyymin saamiseksi (esim. lääkeseulontaan) suositellaan seuraavaa protokollaa: Solususpensio tulee asettaa jäälle ja se sonikoidaan UP100H: lla 10 μm: n amplitudilla syklitilassa 5 sekunnin sonikaatio ja 25 sekunnin lepo jäällä. Toimenpide tulee toistaa noin 3 kertaa. Sonikaatiosyklien välinen lepoaika vähentää lämpötilan nousua ja vähentää siten denaturoitumisen riskiä.
ultraääniproteiinin liukoisuus
Sonikaatio voi nopeuttaa proteiinin liukoisuusprosessia, joka yleensä vaatii useita tunteja. Jotta näytettä ei ylikuumenisi ja estettäisiin proteiinien hajoaminen ja muutokset ureaa sisältävissä liuoksissa, ultraäänipurskeet eivät saisi kestää kauemmin kuin muutama sekunti.
Ultraäänilaite UP200Ht 2 mm: n mikrokärjellä S26d2 pienten näytteiden sonikointiin.
Ultraäänilaitteet proteiinien uuttamiseen
Hielscher Ultrasonics tarjoaa laajan valikoiman ultraäänihomogenisaattoreita solujen, kudosten, bakteerien, mikro-organismien, hiivan ja itiöiden hajoamiseen.
Hielscher-laboratorion ultraäänilaitteet ovat tehokkaita ja helppokäyttöisiä. Ne on rakennettu 24/7-käyttöön, ja ne on suunniteltu kestäviksi ja tehokkaiksi laboratorio- ja pöytälaitteiksi. Kaikkien laitteiden energiantuottoa ja amplitudia voidaan ohjata tarkasti. Laaja lisävarustevalikoima avaa lisää asennusvaihtoehtoja. Digitaalisissa ultraäänilaitteissa, kuten VialTweeter, UP200Ht, UP200St ja UP400St, on integroitu lämpötilan säätö ja sisäänrakennettu SD-kortti automaattista tietojen tallennusta varten.
Useiden näytteiden epäsuoraan, ristikontaminaatiovapaaseen ja samanaikaiseen sonikaatioon tarjoamme VialTweeterin tai ultraääni CupHornin.
Alla oleva taulukko antaa sinulle yleiskatsauksen ultraäänilaitteistamme näytteen valmisteluun, solujen häiriöihin ja uuttamiseen. Napsauta laitetyyppiä saadaksesi lisätietoja jokaisesta ultraäänihomogenisaattorista. Hyvin koulutettu ja pitkäaikainen tekninen henkilökuntamme auttaa mielellään valitsemaan sopivimman ultraäänilaitteen näytteen valmisteluun!
| Erän tilavuus | Virtausnopeus | Suositellut laitteet |
|---|---|---|
| enintään 10 injektiopulloa tai tuubia | n.a. | VialTweeter |
| Multiwell / mikrotiitterilevyt | n.a. | UIP400MTP |
| useita putkia / astioita | n.a. | CupHorn |
| 1 - 500 ml | 10 - 200 ml / min | UP100H |
| 10 - 1000ml | 20–200 ml/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 - 2000ml | 20–400 ml/min | UP400St |
Sovelluksesta, materiaalista ja näytemäärästä riippuen suosittelemme sopivinta asennusta näytteen valmisteluun. Ota yhteyttä jo tänään!
Ota yhteyttä! / Kysy meiltä!
Hielscherin digitaalisissa ultraäänilaitteissa on selaimen kaukosäädin ja automaattinen dataprotokolla integroidulla SD-kortilla.
VialTweeter epäsuoraan sonikaatioon.
Faktoja, jotka kannattaa tietää
proteomiikka
Proteomiikka on tutkimusala, joka tutkii proteiineja ja proteomia. Proteiinit täyttävät laajan valikoiman elintärkeitä toimintoja organismeissa. Proteomi on koko joukko proteiineja, joita genomi, solu, kudos tai organismi ilmaisee tiettynä ajankohtana. Proteomi vaihtelee ajan ja erilaisten vaatimusten tai rasitusten mukaan, joita solu tai organismi käy läpi. Tarkemmin sanottuna se on ilmentyneiden proteiinien joukko tietyntyyppisessä solussa tai organismissa tiettynä ajankohtana määritellyissä olosuhteissa. Termi on sekoitus proteiineja ja genomia. Proteomiikka on proteomin tutkimus.
proteiini
Proteiinit ovat suuria biomolekyylejä, niin sanottuja makromolekyylejä – jotka koostuvat yhdestä tai useammasta pitkästä aminohappotähteiden ketjusta. Proteiineja on kaikissa sekä kasviperäisissä että eläinperäisissä organismeissa, ja ne ovat ratkaisevan tärkeitä useimmille biologisille toiminnoille. Koska proteiinit sisältävät paljon biologista informaatiota, ne uutetaan analyyttisiin tarkoituksiin, esimerkiksi proteomiikkatutkimukseen. Proteiinien tärkeimpiä tehtäviä ovat metabolisten reaktioiden katalyysi, DNA: n replikaatio, vaste ärsykkeille ja molekyylien kuljetus paikasta toiseen. Proteiinit eroavat toisistaan pääasiassa aminohapposekvenssissään, jonka sanelee niiden geenien nukleotidisekvenssi ja joka yleensä johtaa proteiinin laskostumiseen tiettyyn kolmiulotteiseen rakenteeseen, joka määrittää sen aktiivisuuden. Proteiinit ovat – peptidien lisäksi – Yksi elintarvikkeiden keskeisistä komponenteista. Siksi proteomiikka on tehokas työkalu elintarviketieteessä prosessien, elintarviketurvallisuuden ja ravitsemuksellisen arvioinnin optimoimiseksi.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction on esianalyyttinen menetelmä analyyttien erottamiseksi ja esihyväksymiseksi. Yhdessä ultrasonicationin kanssa pilvipisteiden uuttamista voidaan tehostaa, mikä tekee prosessista tehokkaamman, nopeamman ja ympäristöystävällisemmän. Ultraäänellä pilvipisteen uuttaminen on huomattavasti tehokkaampi menetelmä analyyttien valmistukseen. Lue lisää ultraäänellä avustetusta pilvipisteen uuttamisesta!Geelin elektroforeesi
Geelielektroforeesi on tärkein menetelmä makromolekyylien, kuten DNA: n, RNA: n ja proteiinien sekä niiden fragmenttien erottamiseksi ja analysoimiseksi niiden koon ja varauksen perusteella. Sitä käytetään kliinisessä kemiassa proteiinien erottamiseen varauksen ja/tai koon mukaan (IEF-agaroosi, olennaisesti koosta riippumaton) ja biokemiassa, molekyylibiologiassa ja proteomiikassa DNA- ja RNA-fragmenttien sekapopulaation erottamiseksi pituuden mukaan, DNA- ja RNA-fragmenttien koon arvioimiseksi tai proteiinien erottamiseksi varauksen avulla.
soluviljelmät
Soluviljelmä on kontrolloitu kasvatusprosessi, jossa soluja viljellään kontrolloiduissa olosuhteissa. Soluviljelyolosuhteet vaihtelevat solutyypin mukaan. Yleensä soluviljelmän ympäristö koostuu sopivasta astiasta (esim. petrimalja), jossa on substraatti tai väliaine, josta saadaan välttämättömiä ravintoaineita (aminohappoja, hiilihydraatteja, vitamiineja, kivennäisaineita), kasvutekijöitä, hormoneja ja kaasuja (CO2, O2) ja säätelee fysiokemiallista ympäristöä (pH-puskuri, osmoottinen paine, lämpötila). Useimmat solut tarvitsevat pinnan tai keinotekoisen substraatin, kun taas muita soluviljelmiä voidaan viljellä vapaasti kelluen kasvatusväliaineessa (suspensioviljelmä, solususpensio).
Eläinsolulinjojen massaviljelmiä käytetään virusrokotteiden ja muiden bioteknologisesti johdettujen tuotteiden teollisessa tuotannossa. Ihmisen kantasoluja viljellään solujen määrän lisäämiseksi ja solujen erilaistamiseksi erilaisiksi somaattisiksi solutyypeiksi elinsiirtoa varten.
Kudosnäytteet
Kudos kuvaa solun välituotetta, jossa solumateriaali on organisaatiotasolla solujen ja kokonaisen elimen välissä. Kudoksessa kootaan samankaltaisia soluja, jotka ovat samaa alkuperää ja jotka yhdessä suorittavat tietyn toiminnon. Useiden kudosten funktionaalisen ryhmittelyn avulla muodostuu elinten monimutkaiset rakenteet.
Kudoksista otetaan näytteitä biologian, histologian/histopatologian, parasitologian, biokemian, immunohistokemian tutkimusta sekä DNA:n viljelyä ja uuttamista varten. Se voidaan erottaa eläinkudoksesta (osa-alue: nisäkäskudos) ja kasvikudoksesta. Eläinkudokset on ryhmitelty neljään side-, lihas-, hermo- ja epiteelikudoksen perustyyppiin. Kasvikudos on jaettu seuraaviin kolmeen kudosjärjestelmään: orvaskesi, maakudos ja verisuonikudos.
Kudosnäytteitä voidaan valmistaa eläimen tai kasvin osista, kuten luusta, lihaksesta, lehdistä jne.
Kehon nesteet
Veri, seerumi, plasma, aivo-selkäydinneste, sylki ja nivelneste ovat kehon nesteitä, jotka tarjoavat erinomaisen lähteen diagnostisesti merkitykselliselle tiedolle. Siksi kehon nestenäytteiden hienostunut valmistelu analysointia varten on tärkeää. Ensimmäinen vaikeus liittyy kehon nesteissä olevien komponenttien laajaan dynaamiseen alueeseen.
Proteiinipitoisuuden määrittäminen
Bradfordin määritys, Lowryn määritys ja bikinkoniinihapon (BCA) määritys ovat yleisiä määrityksiä proteiinipitoisuuden määrittämiseksi. Naudan seerumin albumiini (BSA) on yksi yleisimmin käytetyistä proteiinistandardeista.
Lysis-puskuri
Lyysipuskuri on valittava solumateriaalin tai kudoksen (kudosviljely, kasvi, bakteerit, sienet jne.) mukaan ja sen mukaan, ovatko solut rakenteessa ja rakennetyypin mukaan. Laaja valikoima lyysipuskureita proteiinien, kalvojen ja organellien uuttamiseksi on formuloitu yhdellä tai useammalla pesuaineella. Pesuaine valitaan yleensä yrityksen ja erehdyksen testeillä tai – jos saatavilla – olemassa olevan proteiiniuuttoprotokollan mukaisesti. Pesuaineen on oltava yhteensopiva kudoslähteen ja proteiinien kanssa. Yleensä valitaan miedoin pesuaine, joka toimii tietylle kudokselle / proteiinille, uutteen maksimaalisen toimivuuden ylläpitämiseksi. Lisäksi, jos kalvoja ja organelleja uutetaan, mieto pesuaine pitää kalvon ehjänä. Yleisesti käytetyt pesuaineet lysispuskureissa ovat enimmäkseen ionittomia tai zwitterionisia, esimerkiksi CHAPS, deoksikolaatti, Triton™ X-100, NP40 ja Tween 20.
Esimerkiksi kudokset, kuten aivot, maksa, suolisto, munuaiset, perna jne., Voidaan yksinkertaisesti puskuroida RIPA: lla – Proteaasi-inhibiittorit ja DTT (esim. geelielektroforeesi) on kuitenkin otettava mukaan.
Luustolihaskudoksen lyysipuskuri (jääkylmä): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) glyseroli, 1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitoli täydennettynä proteaasilla ja fosfataasi-inhibiittoricocktaililla
Taulukko yleisistä puskureista ja niiden pH-alueesta. Yleensä näitä puskureita käytetään yleensä pitoisuuksina 20-50 mM.
| puskuri | pH-alue |
|---|---|
| Sitruunahappo – NaOH | 2.2 – 6.5 |
| Natriumsitraatti – Sitruunahappo | 3.0 – 6.2 |
| Natriumasetaatti – etikkahappo | 3.6 – 5.6 |
| Kakodyylihapon natriumsuola – Hcl | 5.0 – 7.4 |
| MES – NaOH | 5.6 – 6.8 |
| Natriumdivetyfosfaatti – dinatriumvetyfosfaatti | 5.8 – 8.0 |
| imidatsoli – Hcl | 6.2 – 7.8 |
| MOPIT – KOH | 6.6 – 7.8 |
| Trietanoliamiinihydrokloridi – NaOH | 6.8 – 8.8 |
| Tris – Hcl | 7.0 – 9.0 |
| HEPES – NaOH | 7.2 – 8.2 |
| trisiini – NaOH | 7.6 – 8.6 |
| Natriumtetraboraatti – boorihappo | 7.6 – 9.2 |
| Bicine – NaOH | 7.7 – 8.9 |
| glysiini – NaOH | 8.6 – 10.6 |
Useimmat puskurit osoittavat pH-riippuvuutta lämpötilasta. Tämä pätee erityisesti Tris-puskureihin. pKa muuttuu 8,06:sta 25 °C:ssa 8,85:een 0 °C:ssa.
(puskurin pH ja pKa: pH mittaa vetyionien pitoisuutta vesiliuoksessa. pKa (= hapon dissosiaatiovakio) on siihen liittyvä, mutta tarkempi mitta, koska se auttaa ennustamaan, miten molekyyli toimii tietyllä pH-arvolla.)
TRIzol
TRIzol on kemiallinen liuos, jota käytetään RNA:n/DNA:n/proteiinin uuttamiseen guanidiniumtiosyanaattifenolikloroformin uuttamisen aikana. Ultraäänellä avustetun TRIzol-uuton käyttö johtaa korkeisiin DNA-, RNA- ja proteiinisaantoihin samasta näytteestä ja ylittää siten muut uuttomenetelmät.
Kirjallisuus/viitteet
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.