Ultrasuurisen proteiinin uuttaminen kudoksista ja soluviljelmistä
- Proteiini uuttamalla on välttämätön näytteen valmistus askel proteomiikka.
- Proteiinit voidaan uuttaa kasvi- ja eläinkudoksesta, hiivat ja mikro-organismit.
- Sonikoimalla on luotettava, tehokas proteiini uuttamalla menetelmää, joka antaa korkea-proteiinin saannot lyhyen uuttoaika.
Proteiini uutto kudoksista ja soluista
Proteiini uuttamalla kudoksista ja viljellyistä soluista on olennainen näytteen valmistus vaihe, joka suoritetaan aikana monia biokemiallisia ja analyyttiset tekniikat, kuten ELISA, PAGE: lla, Länsi-blotting, Massaspektrometria, tai proteiinin puhdistusta. Ultraääni solujen häiriöitä, hajoamista ja uuttamalla on nimenomaan ohjattavissa tekniikka voidaan varmistaa korkea tuotto proteiineja.
Proteiini uuttamalla eläinkudoksesta
Täysikokoisen kudoksen (esim. Munuaisten, sydämen, keuhkojen, lihasten jne.) Valmistukseen kudos on leikattava hyvin pieniksi paloiksi puhtailla työkaluilla, jään päälle edullisesti ja mahdollisimman nopeasti estämään proteaasien hajoaminen (esim. lyysauspuskuria, kuten RIPA tai hypotoninen lyysipuskuri, joka sisältää proteaasi- ja fosfataasi-inhibiittori-cocktaattia). Hajotuksen jälkeen näyte upotetaan nestemäiseen typpeä pakastekuivaukseen. Näytettä voidaan säilyttää -80 ° C: ssa myöhempää käyttöä varten tai jättää jäätä välittömään homogenisointiin. Välittömästi ennen ultraäänimittausta, näyteputkiin lisätään nopeasti jääkylmää hajotuspuskuria (proteaasi-inhibiittoreita DTT, leupeptiini ja aprotiniini) (noin 10 mg kudosta suositellaan noin 600 μl puskuria). N. 20-60 mg kudosta suositellaan näyteliukua kohden.
Ultraääni homogenisointi, lyysi ja uuttaminen suoritetaan ultraäänihomogenisaattoriin kuten Uf200 ः t tai UP200St, Joka on varustettu mikro-kärki äänipää. Sonikoimalla kesto on 60-90 sekuntia. ultraäänitaajuudella sykli tila 15 sekuntia. sonikoimalla ja 10 sekuntia. lepoaikaa. Näyte on pidettävä jäissä koko ajan.
Heti ultraäänikäsittelyn jälkeen homogenoinnin / uutto, lysaatti sentrifugoidaan 27,000g n. 20 min. Tämän jälkeen supernatantti kerätään siten, että proteiinipitoisuus voidaan määrittää proteiinin, kuten määritys, Pierce proteiinin määritys BCA.
Ultra ääni proteiinin uuttaminen soluista, joilla on UP200St
Proteiini uuttamalla veren seerumin
Seerumin ja fosfaattipuskurin homogeeniseen seokseen näyte sekoitetaan ensin ennen ultraäänikennolyysiä. Ultraäänisen lyysiä varten näytettä sonikoidaan ultraäänitutkimilla, kuten homogenisaattorilla UP100H 8 sykliä 20% amplitudi, ja syklistä kukin 5 sekunnin ja 15 sekunnin pois. Sonocation suoritetaan sonicationg sykleissä ja sijoittamalla näyte jäällä siten, että ylikuumeneminen ja terminen hajoaminen vältetään näytteen. Koska seerumi sisältää suuren määrän korkean molekyylipainon proteiinit (kuten albumiini, α1-antitrypsiini, transferriini, haptoglobulin, immunoglobuliini G: n ja immunoglobuliini A), jotka häiritsevät erottaminen pienimolekyylipainoisten proteiinien aikana IEF, on suositeltavaa vähene seerumista käyttäen ehtyminen sarake.
Proteiini uuttamalla kasvikudoksen
Tuore, pehmeä kasvien kudos, esim. Sammal jne., Voidaan helposti hajottaa asettamalla hienonnettu näyteaine lyysipuskurille sonikoimalla. Kova, likaiset kasvikudokset, kuten siemenet, kuusen neulat jne., On kuivattava. Jotkut kova, puumaiset kasvimateriaalit on jäädytettävä ja jauhettava nestemäisessä työssä ennen niiden poistamista sonikaatiolla. Kasvinsoluviljelmäsuspensioiden tapauksessa ultraäänikäsittely 30 - 150 sekunnin ajan lyysipuskurissa on useimmiten riittävä. Tiukempi materiaali, kuten kurpitsansiemenet, vaatii voimakkaampaa sonikaatiota, kuten alla on kuvattu.
Pöytäkirja kurpitsan siemeniin kuuluvan albumiinin ultraäänimitteesta
Ja ultraääni-proteiinin uutto albumiinia käytetään hienoja kurpitsan siemenet jauhe, 10 g rasvatonta kurpitsan siemenet jauhe ja 100 ml: aan deionisoitua vettä liuottimena, lisätään 250 ml: n dekantterilasiin. Proteiini uuttamalla koostuu kahdessa vaiheessa: Ensin näyte äänikäsitellään-tyypin ultraäänilaitteen UP400St (400W, 24 kHz) asennettu sonotrode S24d7. Lasidekantterissa laitetaan kylmään vesihauteeseen aikana ultraääni homogenoinnin. The asetus ultraäänilaitteen UP400St kun tulolämpötila-anturi varmisti, että näytteen lämpötila pysyy aina alle 30 ° C: ssa. Tarkka lämpötilan säätö sonikaation aikana vältetään albumiinin denaturointi. Toiseksi uutto suoritettiin sekoittimella nopeudella 200 rpm ja 30 ° C: ssa. Tämän jälkeen dekantterilasi siirretään termostaattiseen ravistimeen. Globuliini poistetaan dialyysillä tislatulla vedellä. Globiinin poiston jälkeen proteiiniuute voidaan ottaa näytteestä albumiiniprofiilin määrittämiseksi ja sen jälkeen säädetään pI = 3,0 käyttämällä 0,1 M HCl: ää albumiinikoagulaatiolle. Kiinteä faasi erotetaan sentrifugoimalla 5000 g: ssä, 20 ° C: ssa ja liuotetaan uudelleen deionisoituun veteen. Albumiinin koagulaatio suoritetaan kahdesti proteiinin suhteen lisäämiseksi albumiinikonsentraatissa.
Ultraääni emäksinen proteiini uuttamalla valmistamiseksi proteiinikonsentraatista riisinleseistä osoittaa, että ultraäänikäsittely johtaa suurempaan proteiini saannolla huomattavasti lyhyempi ekstraktioajalla – verrattuna tavanomaisiin uuttomenetelmät.
VialTweeter epäsuoran sonication.
- nopea
- korkeat saannot
- erittäin tehokas
- Tarkan kontrollin parametrit
- toistettavia tuloksia
- lineaarinen skaalautuvuus
Näytteen valmistus protokolla toiminnallinen iNOS-entsyymin
Saada täysin toimiva iNOS-entsyymin (esim. Lääkeaineen seulonta), seuraava menettely on suositeltava: Solususpensio olisi sijoitettiin jäille ja käsitellään ultraäänellä, jossa on UP100H on 10 um amplitudia sykli tilassa 5 sekunnin. sonikoimalla ja 25 sekuntia. levätä jäällä. Menettely tulee toistaa noin. 3 kertaa. Lepää välinen aika sonikaatiosyklit vähentää lämpötilan nousu ja näin ollen vähentää denaturaatiota.
Ultraääni Proteiini solubilisointimenetelmä
Sonikoimalla voi kiihdyttää proteiini liukoiseksi prosessi, joka vaatii yleensä useita tunteja. Jotta ei ylikuumentaa näyte ja estää proteiinien hajoaminen ja muutokset ureaa sisältäviä liuoksia, ultraääni purskeet ei pitäisi kestää kauemmin kuin muutaman sekunnin.
Yleiset ohjeet
Lämpötilan säätö: Varmistaa korkea proteiinin tuotto ilman lämpödenaturaation, lämpötila uuton aikana on valvottava. Hielscher state-of-art ultraääni homogenoijia – kutsutaan myös ultraäänihienonninta tai sonificator – ovat juuri hallittavissa. Ne tulevat plugable lämpötila-anturi. Asettamisessa vaihtoehdot ultraäänihomogenisaattoriin, maksimilämpötila voidaan asettaa. Kun tämä lämpötila max on saavutettu, ultraäänilaitteen pysähtyy automaattisesti, kunnes näyte on jäähtynyt.
Puskuri: Valinta on sopivassa puskurissa ja oikean puskurin tilavuus vaihtelee kudoksesta kudoksen ja on keksin-out tutkimus-ja-erehdys testaus.
Eristäminen / puhdistus: Proteiinilysaattien voi sisältää ylimäärin biomolekyylien, kuten DNA: n tai hiilihydraattien, joka voidaan poistaa proteiinisaostuksen (deoksikolaatti-trikloorietikkahappo) tai puskurin vaihto.
Chittapalo ja Noomhorm (2009) raportoi, että proteiini saanto lisääntyi käyttämällä sonikoimalla ja että ultraääni kudoksen homogenisoinnin ja lyysi prosessi voi parantaa olemassa olevia uuttoprosesseissa merkittävästi – mahdollistaa uusia kaupallisia louhinta mahdollisuuksia.
Ultraäänikudoksen homogenisaattori UP200St proteiinin tehokasta uuttoa
Selaimen ohjaus tarkka toiminta ja seuranta sonikoimalla prosessin
Ultraääni Laitteet Proteiiniuutto
Hielscher Ultrasonics tarjoavat laajan valikoiman ultraääni homogenointilaitteet hajoamisen solujen, kudosten, bakteerit, mikro-organismit, hiiva, ja itiöt.
Hielscher lab ultrasonicators on tehokas ja helppo käyttää. Rakennettu 24/7 käyttöön, ne on suunniteltu luotettavia ja tehokkaita laboratorioon ja penkki-top-laitteiden. Kaikille laitteille, energian tuotannon ja amplitudi voidaan säädellä tarkasti. Laaja valikoima Lisätarvikkeet avaa lisää asetusvaihtoehtoja. Digitaalinen laitteet, kuten VialTweeter, Uf200 ः t, UP200Stja UP400St on integroitu lämpötilan valvonta ja sisäänrakennettu SD-kortin automaattista tietojen tallentamisen.
Epäsuoran, ristikontaminaation-vapaa ja samanaikainen sonikoimalla useiden näytteiden, tarjoamme VialTweeter tai ultraääni CupHorn.
Sovelluksesta riippuen, materiaali, ja näytteen tilavuus, suosittelemme sinulle sopivimman setup oman näytteen prep. Ota yhteyttä jo tänään!
Kirjallisuus / Viitteet
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultraääni avustaa alkaliuuttovaiheen proteiinia rasvattomasta riisin leseet ja proteiinin ominaisuuksia, tiivisteet. Int J Food Sei Technol 44: 1843-1849.
- Simoes, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joan.; Nunes, Ana M.; Gomes Sofia E.; Roberts, Peter M.; Lo, Adrian C.; D'Hooge, Rudi; Steer, Clifford J..; Thibodeau, Stephen C.; Borralho, Peter M.; Rodrigues, Cecilia M. P. (2013): tehokas proteiinin talteenotto monilähteistä jälkeen näytteet Trizol tai Trizol LS RNA: n uuttaminen ja pitkäaikaiseen varastointiin. BMC Genomics, 2013, 14: 181.
Tosiasiat, jotka kannattaa tietää
proteomiikka
Proteomiikassa on tutkimusala, joka tutkii proteiineja ja proteomiin. Proteiinit fullfil suuri joukko elintärkeiden toimintojen organismeja. Proteomin on koko joukko proteiinien ilmaistaan genomin, solu, kudos, tai organismi tietyllä hetkellä. Proteomin vaihtelee ajan myötä ja, tai korostaa, että solu tai organismi läpikäy. Tarkemmin, se on joukko ekspressoidut proteiinit tietyn tyyppisen solun tai organismin, tietyllä hetkellä, määrätyissä olosuhteissa. Termi on sekoitus proteiinien ja genomin. Proteomiikassa on tutkimuksen proteomin.
proteiini
Proteiinit ovat suuria biomolekyylien ns makromolekyylejä – jotka koostuvat yhdestä tai useammasta pitkäketjuisesta aminohappotähteestä. Proteiinit ovat läsnä kaikissa kasviperäisissä ja eläinperäisissä organismeissa, ja ne ovat ratkaisevia useimpien biologisten toimintojen kannalta. Koska proteiinit sisältävät paljon biologista tietoa, ne uutetaan analyyttisiin tarkoituksiin, esim. Proteomista tutkimusta varten. Tärkein proteiinien suorittama toiminto käsittää metabolisen reaktion, DNA: n replikaation, vastineen ärsykkeisiin liittyvän katalyysin ja molekyylien kuljettamisen paikasta toiseen. Proteiinit eroavat toisistaan ensisijaisesti niiden aminohappojen sekvenssissä, jonka geenien nukleotidisekvenssi määrää, ja joka yleensä johtaa proteiinin taittumiseen tiettyyn kolmiulotteiseen rakenteeseen, joka määrittää sen aktiivisuuden. Proteiinit ovat – lisäksi peptidit – yksi tärkeimmistä komponenteista ruokaa. Siksi proteomiikka on tehokas väline ravitsemustieteen prosessien optimoinnin, elintarviketurvallisuus ja ravitsemustilan arviointi.
Geelielektroforeesi
Geelielektroforeesi on suuri erotus- ja analyysi makromolekyylejä, kuten DNA, RNA ja proteiinit sekä niiden fragmentit, jotka perustuvat niiden koon ja varauksen. Sitä käytetään kliinisen kemian proteiinien erottamiseksi varauksen perusteella ja / tai koko (IEF agaroosi, olennaisesti koko riippumattomia) ja biokemian, molekyylibiologian ja proteomiikan erottaa sekapopulaatioon DNA- ja RNA-fragmenttien pituus, koon arvioimiseksi DNA- ja RNA-fragmenttien tai erottamiseksi proteiinien varauksen.
soluviljelmät
Soluviljelmässä on ohjattu kasvava prosessi, jossa soluja viljellään valvotuissa olosuhteissa. Soluviljelmässä olosuhteet vaihtelevat kunkin solutyypin. Yleisesti, ympäristön soluviljelmän koostuu sopivassa astiassa (esim. Petri-maljalle) substraatin tai välineellä, joka toimittaa välttämättömiä ravintoaineita (aminohappoja, hiilihydraatteja, vitamiineja, mineraaleja), kasvutekijät, hormonit ja kaasujen (CO2The2), Ja säätelee fysikaalis-kemiallinen ympäristö (pH: n puskuri, osmoottinen paine, lämpötila). Useimmat solut tarvitsevat pinnalle tai keinotekoinen substraatti, kun taas muut soluviljelmiä voidaan viljellä vapaasti kelluva viljelyväliaineessa (suspensioviljelmässä, solususpensiota).
Massa viljelmiä eläinsolulinjat käytetään teollisessa tuotannossa virus- rokotteiden ja muiden bioteknisesti johdettuja tuotteita. Ihmisen kantasoluja viljellään laajentaa solujen lukumäärä ja erottamaan solut eri somaattisten solujen tyypit transplantaation tarkoituksiin.
kudosnäytteet
Termi kudos on esitetty matkapuhelimen välituote, jossa solu materiaali on organisaatiotasolla solujen välillä ja yksi kokonainen elin. Kudoksen, samanlaisia soluja, samaa alkuperää, jotka yhdessä suorittamaan tietyn toiminnon, kootaan. Toiminnallisilla ryhmittely useita kudoksia, monimutkaisiin rakenteisiin elimet on muodostettu.
Kudos otetaan näyte tutkimusta biologian, histologia / histopatologia, parasitologia, biokemia, immunohistokemia sekä viljellä ja purkaa DNA: ta. Se voidaan erottaa välillä eläimen (osa-alue: nisäkäs kudosta) ja kasvin kudosta. Eläinkudokset ryhmitellään neljään ryhmään sidekudoksen, lihasten, hermoston, ja epiteelikudoksen. Kasvikudosjätteet jakautuu kolmeen kudoksen järjestelmiä: iho, jauhettua kudosta, ja vaskulaarikudoksessa.
Kudosnäytteitä voidaan valmistaa eläimen tai kasvin osia, esim. luu, lihas, lehtiä, jne
kehon nesteiden
Veri, seerumi, plasma, aivo-selkäydinnesteen, syljen ja nivelnesteessä ovat kehon nesteet, jotka tarjoavat suuri lähde diagnostisesti tarvittavat tiedot. Näin ollen, hienostunut valmiste kehon nesteen näytteiden analyysi on tärkeää. Ensimmäinen vaikeus liittyy laajan dynaamisen alueen komponenttien läsnä kehon nesteissä.
Proteiinipitoisuuden määrittämiseen
Bradfordin menetelmällä, Lowry-määritys ja bikinkoniinihappoa (BCA) -määrityksellä ovat yhteisiä määrityksiä määrittää proteiinien pitoisuus. Naudan seerumin albumiini (BSA) on yksi yleisimmin käytetty proteiinia standardina.
hajotuspuskuria
Lyysipuskuria on valinnut mukaisesti solun materiaalin tai kudoksen (kudosviljelmässä, kasvi, bakteerit, sienet, jne.), Ja onko solut ovat rakenteen ja rakenteen tyypistä. Laaja valikoima lyysin puskuroi varten Proteiinien uuttamiseksi, kalvot, ja soluelimiin on formuloitu yhden tai useamman pesuaineita. Pesuaine valitaan yleensä kautta tutkimus-ja-erehdys testejä tai – jos saatavilla – mukaan olemassa olevaan proteiiniin uuttomenettelyä. Pesuaine on oltava yhteensopiva kudoksen kanssa, lähde ja proteiinit. Yleisesti, lievin pesuainetta, joka toimii tietyn kudoksen / proteiini, valitaan säilyttämiseksi maksimaalisen toiminnallisuuden uutteesta. Lisäksi, kun kyseessä on uuttamalla kalvot ja soluelimiin mietoa pesuainetta pitää kalvon ehjänä. Yleisesti käytetty detergenttejä hajoamisen puskureita ovat enimmäkseen ei-ioniset tai kahtaisioniset, esim. CHAPS, deoksikolaatti, Triton ™ X-100, NP40, ja Tween 20: tä.
Esimerkiksi, kudokset kuten aivot, maksa, suoli, munuainen, perna jne. Voidaan yksinkertaisesti puskuroitu RIPA – kuitenkin proteaasi-inhibiittorit ja DTT: tä (esim. geelielektroforeesia) olisi sisällytettävä.
Hajotuspuskuria luustolihasvaurio (jääkylmää): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCI, 2,7 mM KCI, 1 mM MgCI2, 1% Triton X-100, 10% (paino / tilavuus) glyserolia, 1 mM EDTA , 1 mM ditiotreitolia, jota on täydennetty proteaasi-ja fosfataasi-inhibiittori cocktail
Taulukko yhteisen puskureita ja niiden pH-alueella. Yleensä näitä puskureita käytetään yleensä pitoisuuksina, jotka ovat 20-50 mM.
| Puskuri | pH-alue |
|---|---|
| Sitruunahappo – Naoh | 2,2 – 6,5 |
| Natriumsitraatti – Sitruunahappo | 3,0 – 6,2 |
| Natriumasetaattia – etikkahappo | 3,6 – 5,6 |
| Kakodyylihappo natriumsuola – HCl: | 5,0 – 7,4 |
| MY – Naoh | 5,6 – 6,8 |
| Natriumdivetyfosfaatti – dinatriumvetyfosfaattia | 5,8 – 8,0 |
| imidatsoli – HCl: | 6,2 – 7,8 |
| Mopit – Koh | 6,6 – 7,8 |
| trietanoliamiinihydrokloridia – Naoh | 6,8 – 8,8 |
| tris – HCl: | 7,0 – 9,0 |
| HEPES – Naoh | 7,2 – 8,2 |
| trisiini – Naoh | 7,6 – 8,6 |
| natriumtetraboraatiksi – boorihappo | 7,6 – 9,2 |
| bisiiniä – Naoh | 7,7 – 8,9 |
| glysiini – Naoh | 8,6 – 10,6 |
Useimmat puskurit osoittavat pH-riippuvuus lämpötila. Tämä pätee erityisesti Tris-puskureita. PKa muuttuu 8,06 25 ° C: ssa 8,85 0 ° C: ssa.
(PH: n ja pKa puskuria: pH mittaavat vetyionien vesiliuoksessa. PKa (= happodissosiaatiovakio) on siihen liittyvä, mutta tarkempia toimenpiteellä, että se auttaa ennustamaan, miten molekyyli toimii tietyllä PH arvo.)
TRIzolia
TRIzolia on kemiallinen liuos käytetään erottamaan RNA / DNA / proteiini aikana guanidiinitiosyanaatti-fenoli-kloroformiuutolla. Käyttö ultraäänellä avustaa TRIzolia uutto johtaa korkean DNA: n, RNA: n ja proteiinin saannot samasta näytteestä ja loistaa siten muita uuttomenetelmiä.