• Western blot on analyysimenetelmä spesifisten proteiinien havaitsemiseksi kudos- homogenaatti- tai soluuutteessa.
• Western-blottauksen suorittamiseksi tai entsyymiaktiivisuuden mittaamiseksi monet määritykset vaativat pääsyä soluihin suljetuille materiaaleille (esim. Proteiinit, DNA: n, solunsisäiset fragmentit).
• Sonication on luotettava ja helppokäyttöinen menetelmä kontrolloituun solujen häiriöön ja hajotukseen.

Ultraääni-soluhäiriö

Proteiinin uuttaminen kudoksista ja viljellyistä soluista on ensimmäinen vaihe monille biologisille, biokemiallisille ja analyyttisille tekniikoille (PAGE, Western blotting, ELISA, massaspektrometria jne.) Tai proteiinin puhdistus. Suuri proteiinin saannin aikaansaamiseksi solumateriaali ja kudos täytyy tehokkaasti hajottaa / hajottaa. Onko kasvien solu tai eläinkudos, sonikointi on menetelmä solulysatesi valmistamiseksi helppoa ja nopeaa.

Sonication edut

• Nopeasti & tehokas
• helppokäyttöinen
• korkea proteiinin saanto
• toistettavissa / toistettavissa
• tarkasti ohjattu
• skaalautuva

Immunoprecipitationprotokolla Western Immunoblottingille

A. Reagenssit

Liuosten valmistuksessa käytetään puhdistettua vettä kuten Milli-Q.

• 1X fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS)
• 1 x solu-lyysipuskuri: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM natriumpyrofosfaatti, 1 mM P-glyserofosfaatti, 1 mM Na3VO4, ml Leupeptin
  Tärkeää: Lisää 1 mM PMSF välittömästi ennen käyttöä.
• 15 μl Proteiini A + 15 μl Proteiini G on riittävä IP: lle, mutta se voi riippua ensisijaisesta vasta-aineesta ja näytteen tilavuudesta. Voit myös käyttää pre-sekoitettua proteiini-A / G-agaroosia (esim. Proteiini A kanin IgG: n alaspäin ja proteiini G hiiren IgG: n vetämiseksi alaspäin)
• 3 x SDS-näytepuskuria: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 25 ° C: ssa), 6% paino / tilavuus SDS, 30% glyseroli, 150 mM DTT, 0,03% w / v bromofenolisininen

B. Solulyssaattien valmistus

• Korjaa solut. Solujen keräämiseen ei-ilmentämisolosuhteissa poista väliaine ja huuhtele solut jääkylmällä PBS: llä.
• Poista PBS ja lisää 0,5 ml jääkylmää 1X solujen lyysauspuskuria kuhunkin levyyn (10 cm) ja inkuboi levyjä jäillä 5 minuutin ajan.
• Kaavi solut pois levyiltä ja siirrä mikrocentrifugiputkiin. Pysy jäällä.
• Sonikaarisesti kahdesti 10 sekunnin ajan jääkylmää immunopresipuspuskuria (IP-puskuri: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 ja proteaasi-inhibiittorisekoitus). Sonication osalta VialTweeter tai koettimen ultrasonicator, kuten UP100H tai Uf200 ः t ovat sopivimpia.
• Sentrifugoidaan lysaatit 15 000 g: llä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa.
• Siirrä supernatantti uuteen putkeen. (Tarvittaessa lysaattia voidaan säilyttää -80 ° C: ssa.)
• Lisää ensisijainen vasta-aine supernatanttiin. Primaarisen vasta-aineen supernatanttia inkuboidaan 1 tunti 4 ° C: ssa kevyellä sekoituksella. Ensisijaista vasta-ainetta lisätään tyypillisesti määränä, joka on 10 kertaa väkevämpää kuin mitä käytetään Western blottauksessa. (Voit aloittaa 1 μg / 100 μL.)
• Supernatanttia inkuboidaan tämän jälkeen lisää seosta, jossa on yhtä suuri määrä proteiini-A-agaroosia (Invitrogen) ja proteiini-G-agaroosia, vielä yhden tunnin ajan.
• Pese agaroosipelletit kolme kertaa IP-puskurilla. Sen jälkeen uutetaan sitoutuneet proteiinit SDS-PAGE-latauspuskurilla kuumentamalla 95 ° C: ssa 5 minuutin ajan.

C. Immunosaostus

• Ota 200 μl solulysaattia ja lisää primäärivasta-ainetta. Inkuboidaan hellällä keinutuella yön yli 4 ° C: ssa.
• Lisää joko proteiini A- tai G-agaroosipalloja (20 pl 50-prosenttista helmilieteestä). Inkuboidaan hellällä keinulla 1-3 tunnin ajan 4 ° C: ssa.
• Mikrosentrifugoidaan 30 sekuntia 4 ° C: ssa. Pese pelletti viisi kertaa 500 pl: lla 1 x solujen hajotuspuskuria. Pidä jäätä pesujen aikana.
• Pylväs suspendoidaan uudelleen 20 pl: lla 3 x SDS-näytepuskuria. Vortex, sitten mikrocentrifugoidaan 30 sekuntia.
• Kuumenna näyte 95-100 ° C: seen 2-5 minuutin ajan ja mikrocentrifugoidaan 1 minuutin ajan 14 000 x g: llä.
• Lataa näyte (15-30 μl) SDS-PAGE-geelillä (12 - 15%).
• Analysoi näyte Western-blottauksella.

Western Blot -analyysi ultraäänilaitteella UP50H

Seuraavan protokollan avulla käytettiin Kriebisch et al. (2011):
Kokonaisproteiini eristettiin MC3T3-E1-soluista, joita käsiteltiin 1,25 (OH)₂D₃ (10^-8 M) tai ajoneuvoon. Solut hajotettiin puskurilla, joka sisälsi 50 mM Tris-HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% natriumdodekyylisulfaattia (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) ja 0,5% natriumdeoksikolaattia (Merck). Solulysaattia sonikoitiin 2 x 10 s: lla syklin 1 kohdalla ja amplitudi 80 kanssa UP50H Ultraääniprosessori (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Saksa). Tämän jälkeen materiaalia sentrifugoitiin 10 minuutin ajan nopeudella 14 000 rpm ja supernatanttia käytettiin Western blottaukseen. Kaksikymmentäviisi mikrogrammaa proteiinia keitettiin näytepuskurissa ja pelkistävässä aineessa (Invitrogen) ja erotettiin sen jälkeen SDS-PAGE: lla käyttäen 4 - 12% polyakryyliamidigeelejä (Invitrogen) ja siirrettiin nitroselluloosamembraanille (GE-hoito). Membraania estettiin 1 tunnin ajan TBS: llä (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl), joka sisälsi 1% kaseiinia (Sigma-Aldrich) ja 1% Tris (1 M). Estämisen jälkeen membraania inkuboitiin hieman sekoittaen yön yli 4 ° C: ssa primaarisella vasta-aineella (kanin anti-humaani CBS 1/500, kehitetty Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA) laboratoriossa. Inkubointi piparjuuriperoksidaasilla (HPR) -konjugoitu sekundaarinen vasta-aine (Dako) suoritettiin 1 h huoneenlämpötilassa. Kaikki blotit kehitettiin tehostetulla kemiluminesenssilla (Perkin Elmer).

Kirjallisuus / Referenssit