Ultraäänilyysi länsimaiseen blottingiin

• Western blot on analyyttinen menetelmä spesifisten proteiinien havaitsemiseksi kudoshomogenaatti- tai soluuutenäytteestä.
• Western blotin suorittamiseksi tai entsyymiaktiivisuuden mittaamiseksi monet määritykset edellyttävät pääsyä soluun loukkuun jääneisiin materiaaleihin (esim. proteiineihin, DNA:han, solunsisäisiin fragmentteihin).
• Sonikaatio on luotettava ja helposti käsiteltävä menetelmä kontrolloituun solujen häiriöön ja lyysiin.

Ultraäänisolujen häiriöt

Proteiinien uuttaminen kudoksista ja viljellyistä soluista on ensimmäinen askel monille biologisille, biokemiallisille ja analyyttisille tekniikoille (PAGE, Western blotting, ELISA, massaspektrometria jne.) tai proteiinien puhdistukselle. Korkean proteiinisaannon saavuttamiseksi solumateriaali ja kudos on hajotettava? lysoitava tehokkaasti. Olipa kasvisolu tai eläinkudos, sonikaatio on menetelmä solulysaatin valmistamiseksi helposti ja nopeasti.

Sonikoinnin edut

• Nopea & Tehokas
• helppo käyttää
• korkea proteiinisaanto
• toistettava/toistettavissa
• tarkasti valvottu
• Skaalautuva

Immunosaostusprotokolla länsimaiselle immunoblottaukselle

A. Reagenssit

Käytä liuosten valmistukseen puhdistettua vettä, kuten Milli-Q.

• 1X fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS)
• 1X solulyysipuskuri: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM natriumpyrofosfaatti, 1 mM β-glyserofosfaatti, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml leupeptiini
  Tärkeää: Lisää 1 mM PMSF juuri ennen käyttöä.
• 15 μl proteiinia A+15 μl Proteiini G riittää IP:lle, mutta se voi riippua ensisijaisesta vasta-aineestasi ja näytteen tilavuudesta. Voit myös käyttää valmiiksi sekoitettua proteiinia A/G agaroosia (esim. proteiini A kanin IgG-leuanvetoon ja proteiini G hiiren IgG-alasvetoon)
• 3X SDS-näytepuskuri: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 25 °C:ssa), 6% w? v SDS, 30% glyseroli, 150 mM DTT, 0,03% w? v bromofenolisininen

B. Solulysaattien valmistus

• Kerää solut. Jos haluat kerätä soluja denaturoimattomissa olosuhteissa, poista väliaineet ja huuhtele solut kerran jääkylmällä PBS: llä.
• PBS poistetaan ja kuhunkin levyyn lisätään 0,5 ml jääkylmää 1X-solulyysipuskuria (10 cm) ja levyjä inkuboidaan jäällä 5 minuutin ajan.
• Kaavi solut levyiltä ja siirrä mikrosentrifugiputkiin. Pidä jäällä.
• Sonikoidaan kahdesti 10 sekunnin ajan jääkylmässä immunosaostuspuskurissa (IP-puskuri: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 ja proteaasi-inhibiittoriseos). Sonikaatiota varten VialTweeter tai anturin ultraäänilaite, kuten UP100H tai UP200Ht ovat sopivimpia.
• Sentrifugoidaan lysaatteja 15 000 g:ssa 10 minuutin ajan 4 °C:ssa.
• Supernatantti siirretään uuteen putkeen. (Tarvittaessa lysaattia voidaan säilyttää –80 °C:ssa.)
• Lisää ensisijainen vasta-aine supernatanttiin. Supernatanttia, jolla on ensisijainen vasta-aine, inkuboidaan 1 tunnin ajan 4 °C:ssa kevyesti ravistellen. Primaarivasta-ainetta lisätään tyypillisesti 10 kertaa väkevämpi määrä kuin länsiblottauksessa. (Voit aloittaa 1μg? 100μl.)
• Supernatanttia inkuboidaan edelleen seoksella, jossa on yhtä suuret määrät proteiini A-agaroosia (Invitrogeeni) ja proteiini G:n agaroosia vielä 1 tunnin ajan.
• Pese agaroosipelletit kolme kertaa IP-puskurilla. Tämän jälkeen uutetaan sitoutuneet proteiinit SDS-PAGE-latauspuskurilla kuumentamalla 95 °C:ssa 5 minuuttia.

C. Immunosaostus

• Otetaan 200 μl solulysaattia ja lisätään primaarinen vasta-aine. Inkuboidaan kevyesti keinuttaen yön yli 4 °C:ssa.
• Lisätään joko proteiini A- tai G-agaroosihelmiä (20 μl 50-prosenttista helmilietettä). Inkuboidaan kevyesti keinuen 1–3 tuntia 4 °C:ssa.
• Mikrosentrifugoidaan 30 sekunnin ajan 4 °C:ssa. Pelletti pestään viisi kertaa 500 μl:lla 1X-solulyysipuskuria. Pidä jäällä pesun aikana.
• Suspendoidaan sakka uudelleen 20 μl 3X SDS -näytepuskurilla. Pyörre, sitten mikrosentrifugoidaan 30 sekunnin ajan.
• Näytettä kuumennetaan 95–100 °C:seen 2–5 minuutiksi ja mikrosentrifugoidaan 1 minuutti 14 000 x g:ssa.
• Näyte (15–30 μl) asetetaan SDS-PAGE-geeliin (12–15 %).
• Analysoi näyte länsimaisella blottauksella.

Western Blot -analyysi Sonicator UP50H: lla

Seuraava protokolla, jossa käytettiin koetintyyppistä sonikaattoria, UP50H: ta käytettiin tutkimuksessa Kriebisch et ai. (2011):
Kokonaisproteiini eristettiin MC3T3-E1-soluista, joita käsiteltiin 1,25(OH):lla₂D₃ (10⁻⁸ M) tai ajoneuvo. Solut liuotettiin puskurilla, joka sisälsi 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% natriumdodekyylisulfaattia (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) ja 0,5% natriumdeoksikolaatti (Merck). Solulysaattia sonikoitiin 2 × 10 sekunnin ajan syklissä 1 ja amplitudilla 80 UP50H-ultraääniprosessori (Hielscher, ultraäänitekniikka, Teltow, Saksa). Sen jälkeen materiaalia sentrifugoitiin 10 minuutin ajan nopeudella 14 000 rpm ja supernatanttia käytettiin Western blottingissa. Kaksikymmentäviisi μg proteiinia keitettiin näytepuskurissa ja pelkistimessä (Invitrogen) ja erotettiin SDS-PAGE:lla käyttäen 4–12-prosenttisia polyakryyliamidigeelejä (Invitrogen) ja siirrettiin nitroselluloosakalvoon (GE terveydenhuolto). Kalvo oli tukossa 1 tunnin ajan TBS:llä (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl), joka sisälsi 1 % kaseiinia (Sigma-Aldrich) ja 1 % Trisiä (1 M). Estämisen jälkeen kalvoa inkuboitiin lievästi kiihtyen yön yli 4 °C:ssa primaarisella vasta-aineella (kanin anti-inhimillinen CBS 1/500, kehitetty professori R. Banerjeen laboratoriossa, Ann Arbor, MI, USA). Inkubointia piparjuuriperoksidaasi (HPR) -konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineella (Dako) suoritettiin 1 tunnin ajan huoneenlämmössä. Kaikki blotit kehitettiin tehostetulla kemiluminesenssilla (Perkin Elmer).
 

Klikkaa tästä lukeaksesi lisää ultraäänisolujen lyysin ja uuttamisen parhaista käytännöistä, lysaatin valmistuksesta ja suosituksista prosessin parantamiseksi!
 
Alla oleva taulukko antaa sinulle viitteitä laboratoriokokoisten ultraäänilaitteiden likimääräisestä käsittelykapasiteetista:

Kirjallisuus? Viitteet