Ultraäänilyysi Western blot -analyysiä varten

• Western blot on analyysimenetelmä, jolla havaitaan tiettyjä proteiineja kudoshomogenaatti- tai solu-uuttenäytteestä.
• Western blot -analyysin tekeminen tai entsyymiaktiivisuuden mittaaminen edellyttää monissa määrityksissä pääsyä solun sisään jääneisiin aineisiin (esim. proteiineihin, DNA:han ja solunsisäisiin fragmentteihin).
• Ultraäänikäsittely on luotettava ja helppokäyttöinen menetelmä hallittuun solujen hajotukseen ja lyysiin.

Solujen hajotus ultraäänellä

Proteiinien uuttaminen kudoksista ja viljellyistä soluista on ensimmäinen vaihe monissa biologisissa, biokemiallisissa ja analyyttisissä menetelmissä (PAGE, Western blot, ELISA, massaspektrometria jne.) tai proteiinien puhdistuksessa. Suuren proteiinisaannon saavuttamiseksi solumateriaali ja kudos on hajotettava tehokkaasti. Olipa kyseessä kasvisolu tai eläinkudos, ultraäänikäsittely on menetelmä, jolla valmistat solulysaattisi helposti ja nopeasti.

Ultraäänikäsittelyn edut

• nopea ja tehokas
• helppokäyttöinen
• suuri proteiinisaanto
• uusittava/ toistettava
• tarkasti hallittava
• skaalattava

Immunosaostusprotokolla Western-immunoblottaukseen

A. Reagenssit

Käytä liuosten valmistamiseen puhdistettua vettä, kuten Milli-Q-vettä.

• 1X fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS)
• 1X solulyysipuskuri: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM natriumpyrofosfaatti, 1 mM β-glyserofosfaatti, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml leupeptiini
  Tärkeää: Lisää 1 mM PMSF välittömästi ennen käyttöä.
• 15 μl proteiini A:ta + 15 μl proteiini G:tä riittää immunosaostukseen (IP), mutta riittävyys voi riippua primaarivasta-aineesta ja näytetilavuudesta. Voit käyttää myös valmiiksi sekoitettua proteiini A/ G -agaroosia (esim. proteiini A:ta kanin IgG:n affiniteettisaostukseen ja proteiini G:tä hiiren IgG:n affiniteettisaostukseen)
• 3X SDS-näytepuskuri: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 lämpötilassa 25°C), 6% w/v SDS, 30% glyseroli, 150 mM DTT, 0,03% w/v bromifenolisininen

B. Solulysaattien valmistaminen

• Kerää solut. Kun keräät soluja denaturoimattomissa olosuhteissa, poista kasvatusväliaine ja huuhtele solut kerran jääkylmällä PBS:llä.
• Poista PBS, lisää jokaiselle maljalle (10 cm) 0,5 ml jääkylmää 1X solulyysipuskuria ja inkuboi maljoja jäällä 5 minuuttia.
• Kaavi solut irti maljoilta ja siirrä ne mikrosentrifugiputkiin. Pidä jäällä.
• Ultraäänikäsittele kahdesti 10 sekunnin ajan jääkylmässä immunosaostuspuskurissa (IP-puskuri: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 ja proteaasi-inhibiittoriseos). Ultraäänikäsittelyyn soveltuvat parhaiten VialTweeter tai anturityyppinen ultraäänilaite, kuten UP100H tai UP200Ht .
• Sentrifugoi lysaatteja kiihtyvyydellä 15 000 g 10 minuutin ajan lämpötilassa 4°C.
• Siirrä supernatantti uuteen putkeen. (Tarvittaessa lysaattia voidaan säilyttää lämpötilassa –80°C.)
• Lisää primaarivasta-aine supernatanttiin. Primaarivasta-ainetta sisältävää supernatanttia inkuboidaan 1 h lämpötilassa 4°C kevyesti sekoittaen. Primaarivasta-ainetta lisätään tyypillisesti niin, että sen pitoisuus on 10x suurempi kuin Western blot -analyysissä käytetty pitoisuus. (Voit aloittaa määrällä 1μg / 100μL.)
• Supernatantin inkubointia jatketaan sitten vielä 1 h seoksessa, joka sisältää yhtä suuret määrät proteiini A -agaroosia (Invitrogen) ja proteiini G -agaroosia.
• Pese agaroosipelletit kolme kertaa IP-puskurilla. Uuta sen jälkeen sitoutuneet proteiinit SDS-PAGE-latauspuskurilla kuumentamalla lämpötilassa 95°C 5 minuuttia.

C. Immunosaostus

• Ota 200 μl solulysaattia ja lisää primaarivasta-aine. Inkuboi yön yli lämpötilassa 4°C kevyesti keinuttaen.
• Lisää joko proteiini A- tai proteiini G -agaroosihelmiä (20 μl 50%:n helmisuspensiota). Inkuboi 1–3 tuntia lämpötilassa 4°C kevyesti keinuttaen.
• Mikrosentrifugoi 30 sekuntia lämpötilassa 4°C. Pese pelletti viisi kertaa 500 µl:lla 1X solulyysipuskuria. Pidä jäällä pesujen aikana.
• Suspendoi pelletti uudelleen 20 μl:aan 3X SDS-näytepuskuria. Sekoita vorteksisekoittimella ja mikrosentrifugoi sitten 30 sekuntia.
• Kuumenna näytettä lämpötilassa 95–100°C 2–5 minuuttia ja mikrosentrifugoi 1 minuutti kiihtyvyydellä 14 000 X g.
• Lataa näyte (15–30 μl) SDS-PAGE-geelille (12–15%).
• Analysoi näyte Western blot -menetelmällä.

Western blot -analyysi ultraäänilaitteella UP50H

Seuraavaa protokollaa, jossa käytetään anturityyppistä ultraäänilaitetta UP50H, käytettiin Kriebischin ym. (2011) tutkimuksessa:
Kokonaisproteiini eristettiin MC3T3-E1-soluista, jotka oli käsitelty yhdisteellä 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) tai kantaja-aineella. Solut lysoitiin puskurilla, joka sisälsi 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% natriumdodekyylisulfaattia (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) ja 0,5% natriumdeoksikolaattia (Merck). Solulysaattia ultraäänikäsiteltiin 2 × 10 s syklinasetuksella 1 ja amplitudilla 80 käyttäen ultraääniprosessoria UP50H (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Saksa). Tämän jälkeen materiaalia sentrifugoitiin 10 min nopeudella 14 000 rpm, ja supernatanttia käytettiin Western blot -analyysiin. Kaksikymmentäviisi μg proteiinia keitettiin näytepuskurissa ja pelkistysaineessa (Invitrogen), erotettiin sen jälkeen SDS-PAGE-menetelmällä käyttäen 4–12%:n polyakryyliamidigeelejä (Invitrogen) ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle (GE health care). Kalvon epäspesifiset sitoutumiskohdat blokattiin 1 h ajan TBS:llä (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl), joka sisälsi 1% kaseiinia (Sigma-Aldrich) ja 1% Tris-liuosta (1 M). Blokkauksen jälkeen kalvoa inkuboitiin kevyesti sekoittaen yön yli lämpötilassa 4°C primaarivasta-aineen kanssa (kanissa tuotettu ihmisen CBS:ää tunnistava vasta-aine 1/500, kehitetty prof. R. Banerjeen laboratoriossa, Ann Arbor, MI, USA). Inkubointi piparjuuriperoksidaasiin (HPR) konjugoidun sekundaarivasta-aineen (Dako) kanssa suoritettiin 1 h ajan huoneenlämmössä. Kaikki blotit kehitettiin tehostetulla kemiluminesenssilla (Perkin Elmer).
 

Napsauta tästä ja lue lisää solujen ultraäänilyysin ja uuttamisen parhaista käytännöistä, lysaattien valmistamisesta sekä prosessin parantamiseen liittyvistä suosituksista!
 
Alla oleva taulukko antaa käsityksen laboratoriokokoisten ultraäänilaitteidemme likimääräisestä käsittelykapasiteetista:

Kirjallisuus / Lähteet

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.