Bioteknisesti muokattujen solujen ultraäänilyysi teollisessa tuotannossa

Bioteknisesti muokattuja bakteerilajeja, kuten E. coli, sekä geneettisesti muokattuja nisäkkäiden ja kasvien solutyyppejä käytetään laajalti biotekniikassa molekyylien ilmentämiseen. Näiden syntetisoitujen biomolekyylien vapauttamiseen tarvitaan luotettava solujen hajotusmenetelmä. Suuritehoinen ultraäänikäsittely on hyväksi havaittu menetelmä tehokkaaseen ja luotettavaan solulyysiin – se on helposti skaalattavissa suuriin käsittelymääriin. Hielscher Ultrasonics tarjoaa suuritehoisia ultraäänilaitteita tehokkaaseen solulyysiin, jonka avulla voidaan tuottaa suuria määriä korkealaatuisia biomolekyylejä.

Molekyylien uuttaminen solutehtaista

Monenlaisten biomolekyylien tuotannossa mikrobisolutehtaina voidaan käyttää erilaisia muokattuja mikrobeja ja kasvisoluja, kuten Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, syanobakteerit, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana ja levät sekä monet muut. Nämä solutehtaat voivat tuottaa proteiineja, lipidejä, biokemikaaleja, polymeerejä, biopolttoaineita ja oleokemikaaleja, joita käytetään elintarvikkeina tai teollisten sovellusten raaka-aineina. Solutehtaina käytettäviä soluja kasvatetaan suljetuissa bioreaktoreissa, joissa ne voivat saavuttaa suuren tehokkuuden ja spesifisyyden sekä pienen energiantarpeen.
Kohdemolekyylien eristämiseksi bioteknisesti muokatuista soluviljelmistä solut on hajotettava, jotta solunsisäinen materiaali vapautuu. Ultraäänisoluhajottimet ovat vakiintunut, erittäin luotettava ja tehokas ratkaisu solujen hajottamiseen ja yhdisteiden vapauttamiseen.

Mikrobisolutehtaat ovat aineenvaihdunnaltaan muokattuja soluja, joita käytetään erilaisten arvokkaiden yhdisteiden synteesiin. Solujen hajotus ultraäänellä on tehokas ja luotettava menetelmä arvokkaiden yhdisteiden vapauttamiseen solujen sisältä.
tutkimus ja kuva: ©Villaverde, 2010.

Ultraäänisoluhajottimien edut

Ultraäänisoluhajottimia käytetään laboratorioissa ja teollisuudessa solujen lyysiin ja korkealaatuisten uutteiden tuottamiseen, esimerkiksi molekyylien eristämiseen solutehtaista. Menetelmä on ei-terminen ja hellävarainen mutta erittäin tehokas.

Tehoultraääni mikrobisolutehtaiden tehokkaaseen hajotukseen

Ultraäänisoluhajottimien toimintamekanismi ja vaikutukset:
Solujen hajotus ultraäänellä hyödyntää ultraääniaaltojen tehoa. Ultraäänihomogenisaattori / soluhajotin on varustettu titaaniseoksesta valmistetulla anturilla eli sonotrodilla, joka värähtelee suurella, noin 20 kHz:n taajuudella. Tämä tarkoittaa, että ultraäänianturi kytkee ultraäänikäsiteltävään nesteeseen 20 000 värähdystä sekunnissa. Nesteeseen kytkeytyville ultraääniaalloille ovat ominaisia vuorottelevat korkean ja matalan paineen jaksot. Matalan paineen jakson aikana neste laajenee ja siihen muodostuu pieniä tyhjiökuplia. Nämä hyvin pienet kuplat kasvavat useiden vuorottelevien painejaksojen aikana, kunnes ne eivät enää pysty vastaanottamaan lisää energiaa. Tällöin kavitaatiokuplat luhistuvat voimakkaasti ja synnyttävät paikallisesti poikkeuksellisen energiatiheän ympäristön. Ilmiö tunnetaan akustisena kavitaationa, ja sille ovat ominaisia paikallisesti erittäin korkeat lämpötilat, erittäin suuret paineet ja leikkausvoimat. Nämä leikkausjännitykset rikkovat tehokkaasti soluseinämiä ja lisäävät aineensiirtoa solun sisäosan ja ympäröivän liuottimen välillä. Ultraäänellä tuotettuja leikkausvoimia käytetään laajalti puhtaasti mekaanisena menetelmänä, ja niitä suositellaan bakteerisolujen hajotukseen sekä proteiinien eristämiseen. Yksinkertaisena ja nopeana solujen hajotusmenetelmänä ultraäänikäsittely soveltuu ihanteellisesti eristämiseen pienistä, keskisuurista ja suurista tilavuuksista. Hielscherin digitaalisissa ultraäänilaitteissa on selkeä asetusvalikko ultraäänikäsittelyn tarkkaa hallintaa varten. Kaikki ultraäänikäsittelyn tiedot tallennetaan automaattisesti sisäänrakennetulle SD-kortille, ja ne ovat helposti saatavilla. Kehittyneet lämmönpoistovaihtoehdot, kuten ulkoinen jäähdytys ja pulssitilassa tehtävä ultraäänikäsittely, varmistavat ultraäänihajotuksen aikana ihanteellisen prosessilämpötilan säilymisen ja siten uutettujen lämpöherkkien yhdisteiden eheyden.

Tutkimus korostaa ultraäänellä tehtävän solujen hajotuksen ja uuton vahvuuksia

Professori Chemat et al. (2017) toteavat tutkimuksessaan yhteenvetona, että ”ultraääniavusteinen uutto on ympäristöystävällinen ja taloudellisesti kannattava vaihtoehto perinteisille elintarvikkeiden ja luonnontuotteiden käsittelymenetelmille. Tärkeimmät hyödyt ovat uutto- ja käsittelyajan, käytetyn energian ja liuottimien määrän, yksikköoperaatioiden sekä CO₂ -päästöjen väheneminen.”
Gabig-Ciminska et al. (2014) käyttivät tutkimuksessaan korkeapainehomogenisaattoria ja ultraäänisoluhajotinta itiöiden lyysiin DNA:n vapauttamiseksi. Verratessaan näitä kahta solujen hajotusmenetelmää tutkimusryhmä toteaa itiöiden DNA:n eristämiseen tähtäävästä solulyysistä seuraavaa: ”Analyysi tehtiin käyttämällä korkeapainehomogenoinnilla saatuja solulysaatteja. Myöhemmin havaitsimme, että solujen hajotuksella ultraäänellä on tähän tarkoitukseen erinomaisia etuja. Se on melko nopea ja soveltuu pienten näytetilavuuksien käsittelyyn.” (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Solutehtaiden biomolekyylit elintarviketuotannossa

Mikrobisolutehtaat ovat toimiva ja tehokas tuotantomenetelmä, jossa mikrobiorganismeja käytetään tuottamaan suuria saantoja luontaisista ja ei-luontaisista metaboliiteista muokkaamalla bioteknisesti mikro-organismien, kuten bakteerien, hiivojen ja sienten, aineenvaihduntaa. Esimerkiksi suurina määrinä tuotettavia entsyymejä valmistetaan mikro-organismien, kuten Aspergillus oryzaen, sienten ja bakteerien, avulla. Näitä entsyymejä käytetään elintarvikkeiden ja juomien tuotannossa sekä maataloudessa, bioenergian tuotannossa ja kodinhoidossa.
Tietyt bakteerit, kuten Acetobacter xylinum ja Gluconacetobacter xylinus, tuottavat selluloosaa fermentaatioprosessissa, jossa nanokuidut syntetisoituvat pienistä rakenneosista suuremmiksi rakenteiksi. Bakteeriselluloosa eli mikrobiselluloosa vastaa kemiallisesti kasviselluloosaa, mutta sen kiteisyysaste ja puhtaus ovat korkeat: se ei sisällä ligniiniä, hemiselluloosaa, pektiiniä eikä muita biogeenisiä komponentteja. Lisäksi sillä on ainutlaatuinen selluloosananokuiduista punoutunut kolmiulotteinen (3D) verkkorakenne. (cf. Zhong, 2020) Kasviperäiseen selluloosaan verrattuna bakteeriselluloosa on kestävämpi vaihtoehto, ja tuotettu selluloosa on puhdasta eikä vaadi monimutkaisia puhdistusvaiheita. Ultraäänikäsittely ja liuotinuutto NaOH:lla tai SDS:llä (natriumdodekyylisulfaatti) ovat erittäin tehokkaita menetelmiä bakteeriselluloosan eristämiseen bakteerisoluista.

Solutehtaiden biomolekyylit lääkkeiden ja rokotteiden tuotannossa

Yksi merkittävimmistä solutehtaissa tuotetuista lääkevalmisteista on ihmisen insuliini. Insuliinin bioteknisessä tuotannossa käytetään pääasiassa E. colia ja Saccharomyces cerevisiaeta. Koska biosyntetisoidut nanokokoiset molekyylit ovat hyvin bioyhteensopivia, biologiset nanohiukkaset, kuten ferritiini, ovat hyödyllisiä monissa biologisen valmistuksen sovelluksissa. Lisäksi tuotanto aineenvaihdunnaltaan muokatuissa mikrobeissa on usein huomattavasti tehokkaampaa saavutettujen saantojen kannalta. Esimerkiksi artemisiinihapon, resveratrolin ja lykopeenin tuotanto on kasvanut kymmenkertaisesta useisiin satoihin kertoihin, ja teollisen mittakaavan tuotanto on jo vakiintunutta tai sitä kehitetään parhaillaan. (cf. Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
Esimerkiksi proteiinipohjaiset nanokokoiset biomolekyylit, joilla on itsejärjestymisominaisuuksia, kuten ferritiini ja viruksen kaltaiset partikkelit, ovat erityisen kiinnostavia rokotekehityksessä. Ne jäljittelevät sekä taudinaiheuttajien kokoa että rakennetta, ja niiden pintaan voidaan konjugoida antigeenejä edistämään vuorovaikutusta immuunisolujen kanssa. Tällaisia molekyylejä ilmennetään niin sanotuissa solutehtaissa (esimerkiksi muokatuissa E. coli -kannoissa), jotka tuottavat tiettyä kohdemolekyyliä.

E. coli BL21:n ultraäänilyysin protokolla ferritiinin vapauttamiseen

Ferritiini on proteiini, jonka ensisijainen tehtävä on raudan varastointi. Ferritiinillä on lupaavia ominaisuuksia itsejärjestyvinä nanohiukkasina rokotteissa, joissa sitä käytetään rokotteen kuljetusvälineenä (esimerkiksi SARS-Cov-2:n piikkiproteiineille). Sun et. al. (2016) osoittavat tieteellisessä tutkimuksessaan, että rekombinantti ferritiini voidaan vapauttaa liukoisessa muodossa Escherichia colista pienillä NaCl-pitoisuuksilla (≤50 mmol/L). Ferritiinin ilmentämiseen E. coli BL21:ssä ja sen vapauttamiseen käytettiin onnistuneesti seuraavaa protokollaa. Rekombinantti pET-28a/ferritiini-plasmidi transformoitiin E coli BL21 (DE3) -kantaan. Ferritiiniä tuottavia E coli BL21 (DE3) -soluja kasvatettiin LB-kasvatusalustassa, joka sisälsi 0,5% kanamysiiniä, 37°C:ssa. Ilmentäminen indusoitiin OD600-arvossa 0,6 käyttämällä 0,4% isopropyyli-β-D-tiogalaktopyranosidia 3 tunnin ajan 37°C:ssa. Lopullinen viljelmä kerättiin sitten sentrifugoimalla 8 000g:n voimalla 10 minuutin ajan 4°C:ssa, ja pelletti otettiin talteen. Tämän jälkeen pelletti suspendoitiin uudelleen LB-alustaan (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% hiivauute)/lyysipuskuriin (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) ja NaCl-liuoksiin, joiden pitoisuudet olivat vastaavasti 0, 50, 100, 170 ja 300 mmol/L. Bakteerisolujen lyysissä käytettiin ultraäänikäsittelyä pulssitilassa: esimerkiksi käyttäen ultraäänilaitetta UP400St 100%:n amplitudilla ja käyttöjaksolla, jossa laite oli 5 sekuntia päällä ja 10 sekuntia pois päältä, yhteensä 40 jakson ajan), minkä jälkeen sentrifugoitiin 10 000g:n voimalla 15 minuutin ajan 4°C:ssa. Supernatantti ja saostuma analysoitiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE). Kaikki natriumdodekyylisulfaatilla värjätyt geelit skannattiin korkean erotuskyvyn skannerilla. Geelikuvat analysoitiin Magic Chemi 1D -ohjelmistolla. Proteiinivyöhykkeet havaittiin säätämällä parametreja parhaan mahdollisen selkeyden saavuttamiseksi. Vyöhykkeiden tiedot tuotettiin kolmesta teknisestä rinnakkaisnäytteestä. (cf. Sun et al., 2016)

Ultraäänisoluhajottimet solutehtaiden teolliseen lyysiin

Ultraäänilyysi ja -uutto ovat luotettava ja vaivaton menetelmä metaboliittien vapauttamiseen solutehtaista, mikä tukee kohdemolekyylien tehokasta tuotantoa. Ultraäänisoluhajottimia on saatavilla laboratoriokoosta teolliseen kokoluokkaan, ja prosessit voidaan skaalata täysin lineaarisesti.
Hielscher Ultrasonics on asiantunteva kumppanisi suuritehoisten ultraäänisoluhajottimien alalla, ja sillä on pitkä kokemus ultraäänijärjestelmien asentamisesta pöytälaitteistoihin ja teollisiin ympäristöihin.
Kehittyneiden laitteistojen ja ohjelmistojen osalta Hielscher Ultrasonicsin solujen hajotusjärjestelmät täyttävät kaikki optimaalisen prosessinhallinnan, helpon käytön ja käyttäjäystävällisyyden vaatimukset. Hielscherin ultraäänilaitteiden asiakkaat ja käyttäjät arvostavat sitä, että Hielscherin ultraäänisoluhajottimet ja -uuttolaitteet mahdollistavat prosessin tarkan seurannan ja hallinnan – digitaalisen kosketusnäytön ja selaimella käytettävän etäohjauksen avulla. Kaikki tärkeät ultraäänikäsittelyn tiedot (esimerkiksi nettoenergia, kokonaisenergia, amplitudi, kesto, lämpötila ja paine) tallennetaan automaattisesti CSV-tiedostona sisäänrakennetulle SD-kortille. Tämä auttaa saavuttamaan uusittavia ja toistettavia tuloksia sekä helpottaa prosessin standardointia ja hyvien tuotantotapojen (cGMP) noudattamista.
Hielscherin ultraääniprosessorit on luonnollisesti suunniteltu toimimaan täydellä kuormalla 24/7, joten niitä voidaan käyttää luotettavasti teollisissa tuotantoympäristöissä. Erittäin kestävän rakenteen ja vähäisen huoltotarpeen ansiosta ultraäänilaitteiden seisokkiaika on todella lyhyt. CIP-ominaisuudet (paikallaan puhdistus) ja SIP-ominaisuudet (paikallaan sterilointi) vähentävät työlästä puhdistusta erityisesti siksi, että kaikki nesteen kanssa kosketuksiin joutuvat osat ovat sileitä metallipintoja (ei piilossa olevia aukkoja tai suuttimia).

Alla oleva taulukko antaa suuntaa ultraäänilaitteidemme likimääräisestä käsittelykapasiteetista: