Bioteknisten solujen ultraäänilyysi teollisessa tuotannossa

Biomuokattuja bakteerilajeja, kuten E. colia, sekä geneettisesti muunnettuja nisäkäs- ja kasvisolutyyppejä käytetään laajalti biotekniikassa molekyylien ilmentämiseen. Näiden syntetisoitujen biomolekyylien vapauttamiseksi tarvitaan luotettava solujen häiriötekniikka. Korkean suorituskyvyn ultrasonication on todistettu menetelmä tehokkaalle ja luotettavalle solulyysille – helposti skaalattavissa suuriin tuotantomääriin. Hielscher Ultrasonics tarjoaa sinulle korkean suorituskyvyn ultraäänilaitteita tehokkaaseen solulyysiin, jotta voidaan tuottaa suuria määriä korkealaatuisia biomolekyylejä.

Molekyylien uuttaminen solutehtaista

Monenlaisten biomolekyylien tuottamiseen voidaan käyttää erilaisia muokattuja mikrobeja ja kasvisoluja mikrobisolutehtaina, mukaan lukien Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, syanobakteerit, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana ja levät. Nämä solutehtaat voivat tuottaa proteiineja, lipidejä, biokemikaaleja, polymeerejä, biopolttoaineita ja öljykemikaaleja, joita käytetään elintarvikkeina tai raaka-aineina teollisissa sovelluksissa. Solutehtaina käytettäviä soluja viljellään suljetuissa bioreaktoreissa, joissa niillä voidaan saavuttaa korkea hyötysuhde, spesifisyys ja alhainen energiantarve.
Kohdemolekyylien eristämiseksi biomuokatuista soluviljelmistä solut on hajotettava niin, että solunsisäinen materiaali vapautuu. Ultraäänisolujen häiritsijät ovat vakiintuneita erittäin luotettavana ja tehokkaana tekniikkana solujen hajoamiseen ja yhdisteiden vapautumiseen.

Mikrobisolutehtaat ovat metabolisesti muokattuja soluja, joita käytetään erilaisten arvokkaiden yhdisteiden synteesiin. Ultraäänisolujen häiriöt ovat tehokas ja luotettava menetelmä arvokkaiden yhdisteiden vapauttamiseksi solun sisätiloista.
tutkimus ja grafiikka: ©Villaverde, 2010.

Ultraäänisolujen häiritsijöiden edut

Ei-lämpöisenä, lievänä, mutta erittäin tehokkaana teknologiana ultraäänihäiritsijöitä käytetään laboratoriossa ja teollisuudessa solujen hajottamiseen ja korkealaatuisten uutteiden tuottamiseen, esimerkiksi molekyylien eristämiseen solutehtaista.

Teho-ultraääni mikrobisolutehtaiden tehokkaaseen hajottamiseen

Ultraäänisolujen häiritsijöiden mekanismi ja vaikutukset:
Ultraäänisolujen häiriöt käyttivät ultraääniaaltojen voimaa. Ultraäänihomogenisaattori / soluhäiritsijä on varustettu titaaniseoksesta valmistetulla anturilla (alias sonotrode), joka värähtelee korkealla taajuudella noin 20 kHz. Tämä tarkoittaa, että ultraäänianturi yhdistää 20 000 tärinää sekunnissa sonikoituun nesteeseen. Nesteeseen kytketyille ultraääniaalloille on tunnusomaista vuorottelevat korkeapaine- / matalapainesyklit. Matalapainejakson aikana neste laajenee ja syntyy pieniä tyhjiökuplia. Nämä hyvin pienet kuplat kasvavat useiden vuorottelevien painesyklien aikana, kunnes ne eivät pysty absorboimaan enempää energiaa. Tässä vaiheessa kavitaatiokuplat luhistuvat rajusti ja luovat paikallisesti poikkeuksellisen energiatiheän ympäristön. Tätä ilmiötä kutsutaan akustiseksi kavitaatioksi, ja sille on ominaista paikallisesti erittäin korkeat lämpötilat, erittäin korkeat paineet ja leikkausvoimat. Nämä leikkausjännitykset rikkovat tehokkaasti soluseinät ja lisäävät massansiirtoa solun sisäosan ja ympäröivän liuottimen välillä. Puhtaasti mekaanisena tekniikkana ultraäänellä tuotettuja leikkausvoimia käytetään laajalti ja suositeltua menettelyä bakteerisolujen häiriöihin sekä proteiinien eristämiseen. Yksinkertaisena ja nopeana solujen häiriömenetelmänä sonikaatio on ihanteellinen pienten, keskisuurten ja suurten määrien eristämiseen. Hielscherin digitaaliset ultraäänilaitteet on varustettu selkeällä asetusvalikolla tarkkaa sonikaatiota varten. Kaikki sonikaatiotiedot tallennetaan automaattisesti sisäänrakennetulle SD-kortille ja ovat yksinkertaisesti käytettävissä. Kehittyneet lämmöntuottovaihtoehdot, kuten ulkoinen jäähdytys, sonikaatio pulssitilassa jne., Ultraäänihajoamisprosessin aikana varmistavat ihanteellisen prosessilämpötilan säilymisen ja siten uutettujen lämpöherkkien yhdisteiden eheyden.

Tutkimus korostaa ultraäänisolujen häiriöiden ja uuttamisen vahvuuksia

(2017) jatkaa tutkimuksessaan, että "ultraääniavusteinen uuttaminen on vihreä ja taloudellisesti kannattava vaihtoehto tavanomaisille elintarvikkeiden ja luonnontuotteiden tekniikoille. Tärkeimmät edut ovat uutto- ja käsittelyajan lyheneminen, käytetyn energian ja liuottimien määrä, yksikkötoiminnot ja CO₂ päästöjä."
(2014) käytti tutkimuksessaan korkeapainehomogenisaattoria ja ultraäänisolujen dsintegraattoria itiöiden hajottamiseksi DNA: n vapauttamiseksi. Vertaamalla molempia solun häiriömenetelmiä tutkimusryhmä päättelee, että itiö-DNA: n solulyysin osalta "analyysi on tehty käyttämällä solulysaatteja korkeapainehomogenisoinnista. Jälkeenpäin tajusimme, että ultraäänisolujen häiriöllä on erinomaiset edut tähän tarkoitukseen. Se on melko nopea ja sitä voidaan käsitellä pienillä näytemäärillä." (Gabig-Ciminska et ai., 2014)

Solutehtaiden biomolekyylejä ruoantuotantoon

Mikrobisolutehtaat ovat toteuttamiskelpoinen ja tehokas tuotantomenetelmä, jossa käytetään mikrobiorganismeja tuottamaan suuria natiivien ja ei-kotoperäisten metaboliittien saantoja mikrobien mikro-organismien, kuten bakteerien, hiivojen, sienien jne., metabolisen biotekniikan avulla. Bulkkientsyymejä tuotetaan esimerkiksi käyttämällä mikro-organismeja, kuten Aspergillus oryzae, sieniä ja bakteereja. Näitä irtoentsyymejä käytetään elintarvikkeiden ja juomien tuotannossa sekä maataloudessa, bioenergiassa ja kodinhoidossa.
Tietyt bakteerit, kuten Acetobacter xylinum ja Gluconacetobacter xylinus, tuottavat selluloosaa käymisprosessin aikana, jossa nanokuidut syntetisoidaan alhaalta ylöspäin suuntautuvassa prosessissa. Bakteeriselluloosa (tunnetaan myös nimellä mikrobiselluloosa) vastaa kemiallisesti kasviselluloosaa, mutta sillä on korkea kiteisyysaste ja korkea puhtaus (vapaa ligniinistä, hemiselluloosasta, pektiinistä ja muista biogeenisistä komponenteista) sekä ainutlaatuinen rakenne selluloosa-nanokuitukudotusta kolmiulotteisesta (3D) verkkoverkosta. (vrt. Zhong, 2020) Kasviperäiseen selluloosaan verrattuna bakteeriselluloosa on kestävämpää ja tuotettu selluloosa on puhdasta eikä vaadi monimutkaisia puhdistusvaiheita. Ultrasonication ja liuottimen uuttaminen käyttämällä NaOH: ta tai SDS: ää (natriumdodekyylisulfaatti) ovat erittäin tehokkaita bakteeriselluloosan eristämiseksi bakteerisoluista.

Solutehtaiden biomolekyylejä lääke- ja rokotetuotantoon

Yksi merkittävimmistä solutehtaista peräisin olevista farmaseuttisista tuotteista on ihmisinsuliini. Biomuokatun insuliinin tuotannossa käytetään pääasiassa E. colia ja Saccharomyces cerevisiaeta. Koska biosyntetisoidut nanokokoiset molekyylit tarjoavat korkean biologisen yhteensopivuuden, biologiset nanohiukkaset, kuten ferritiini, ovat edullisia lukuisissa biovalmistussovelluksissa. Lisäksi metabolisesti muokattujen mikrobien tuotanto on usein huomattavasti tehokkaampaa saaduissa saannoissa. Esimerkiksi artemisiinihapon, resveratrolin ja lykopeenin tuotanto on kymmenkertaistunut useisiin satoihin, ja se on jo vakiintunut tai kehitteillä teollisen mittakaavan tuotantoon. (vrt. Liu et al.; Mikrobi. Solun tosiasia. 2017)
Esimerkiksi proteiinipohjaiset nanokokoiset biomolekyylit, joilla on itsejärjestäytyviä ominaisuuksia, kuten ferritiini ja viruksen kaltaiset hiukkaset, ovat erityisen mielenkiintoisia rokotteiden kehittämisen kannalta, koska ne jäljittelevät sekä patogeenien kokoa että rakennetta ja ovat alttiita antigeenien pintakonjugaatiolle vuorovaikutuksen edistämiseksi immuunisolujen kanssa. Tällaiset molekyylit ilmentyvät niin sanotuissa solutehtaissa (esim. muokatut E. coli -kannat), jotka tuottavat tietyn kohdemolekyylin.

Protokolla ultraäänilyysille ja E. coli BL21 ferritiinin vapautumiselle

Ferritiini on proteiini, jonka ensisijainen tehtävä on raudan varastointi. Ferritiinillä on lupaavia ominaisuuksia itsejärjestäytyvinä nanohiukkasina rokotteissa, joissa sitä käytetään rokotteiden annosteluvälineenä (esim. SARS-Cov-2-piikkiproteiinit). Tieteellinen tutkimus Sun et. (2016) osoittaa, että rekombinantti ferritiini voidaan vapauttaa liukoisena muotona Escherichia colista alhaisilla NaCl-pitoisuuksilla (≤50 mmol/l). Ferritiinin ilmentämiseksi E. coli BL21: ssä ja ferrtiinin vapauttamiseksi seuraavaa protokollaa sovellettiin onnistuneesti. Rekombinantti pET-28a/ferritiiniplasmidi muunnettiin E coli BL21 (DE3) -kannaksi. Ferritiini E coli BL21 (DE3) -soluja viljeltiin LB-kasvualustassa 0,5-prosenttisella kanamysiinillä 37 °C:ssa ja indusoitiin OD600-arvolla 0,6 0,4-prosenttisella isopropyyli-β-D-tiogalaktopyranosidilla 3 tunnin ajan 37 °C:ssa. Lopullinen viljelmä kerättiin sitten sentrifugoimalla 8000 g:ssa 10 minuutin ajan 4 °C:ssa, ja pelletti kerättiin. Sitten pelletti suspendoitiin uudelleen LB-väliaineeseen (1% NaCl, 1% typone, 0,5% hiivauute) / lyysipuskuriin (20 mmol/l Tris, 50 mmol/l NaCl, 1 mmol/l EDTA, pH 7,6) ja eri pitoisuuksiin NaCl-liuosta (0, 50, 100, 170 ja 300 mmol/l). Bakteerisolujen lyysiä varten sonikaatiota sovellettiin pulssitilassa: esimerkiksi käyttämällä Ultraäänilaite UP400St 100 %:n amplitudilla käyttösuhteen ollessa 5 sekuntia päällä, 10 sekuntia pois päältä, 40 syklin ajan) ja sentrifugoidaan sitten 10 000 g:ssa 15 minuutin ajan 4 °C:ssa. Supernatantti ja sakka analysoitiin natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE). Kaikki natriumdodekyylisulfaatilla värjätyt geelit skannattiin korkean resoluution skannerilla. Geelikuvat analysoitiin Magic Chemi 1D -ohjelmistolla. Optimaalisen selkeyden saavuttamiseksi proteiininauhat havaittiin säätämällä parametreja. Kaistojen tiedot tuotettiin teknisistä kolmosista. (vrt. Sun et al., 2016)

Ultraäänisolujen häiritsijät solutehtaiden teolliseen lyysiin

Ultraäänilyysi ja uuttaminen on luotettava ja mukava menetelmä metaboliittien vapauttamiseksi solutehtaista, mikä auttaa kohdemolekyylien tehokasta tuotantoa. Ultraäänisolujen häiritsijöitä on saatavana laboratoriosta teolliseen kokoon ja prosessit voidaan skaalata täysin lineaarisiksi.
Hielscher Ultrasonics on pätevä kumppanisi korkean suorituskyvyn ultraäänihäiriöille ja sillä on pitkäaikainen kokemus ultraäänijärjestelmien istuttamisesta penkki- ja teollisuusympäristöissä.
Mitä tulee hienostuneisiin laitteistoihin ja ohjelmistoihin, Hielscher Ultrasonics -solujen häiriöjärjestelmät täyttävät kaikki optimaalisen prosessinohjauksen, helpon käytön ja käyttäjäystävällisyyden vaatimukset. Hielscher-ultraäänilaitteiden asiakkaat ja käyttäjät arvostavat Hielscherin ultraäänisolujen häiritsijöiden ja uuttimien tarjoamaa hyötyä prosessin tarkasta seurannasta ja ohjauksesta – digitaalisen kosketusnäytön ja selaimen kaukosäätimen kautta. Kaikki tärkeät sonikaatiotiedot (esim. nettoenergia, kokonaisenergia, amplitudi, kesto, lämpötila, paine) tallennetaan automaattisesti CSV-tiedostona integroidulle SD-kortille. Tämä auttaa saamaan toistettavia ja toistettavia tuloksia ja helpottaa prosessien standardointia sekä hyvien tuotantotapojen (cGMP) noudattamista.
Tietenkin, Hielscherin ultraääniprosessorit on rakennettu 24/7 toimintaan täydellä kuormituksella, ja siksi niitä voidaan käyttää luotettavasti teollisessa tuotannossa. Korkean kestävyyden ja vähäisen huollon vuoksi ultraäänilaitteiden seisokit ovat todella alhaiset. CIP (clean-in-place) ja SIP (steriloi-in-place) -ominaisuudet minimoivat työlään puhdistuksen, varsinkin kun kaikki märkäosat ovat sileitä metallipintoja (ei piilotettuja aukkoja tai suuttimia).

Alla oleva taulukko antaa sinulle viitteitä ultraäänilaitteidemme likimääräisestä käsittelykapasiteetista: