Äidinmaidon oligosakkaridien biosynteettinen tuotanto

Äidinmaidon oligosakkaridien (HMO) biosynteesi fermentaation tai entsymaattisten reaktioiden avulla on monimutkainen, resursseja kuluttava ja usein saannoltaan alhainen prosessi. Ultraäänikäsittely lisää aineensiirtoa substraatin ja solutehtaiden välillä sekä stimuloi solujen kasvua ja aineenvaihduntaa. Näin ultraäänikäsittely tehostaa fermentaatiota ja biokemiallisia prosesseja, mikä nopeuttaa HMO-yhdisteiden tuotantoa ja parantaa sen tehokkuutta.

Äidinmaidon oligosakkaridit

Äidinmaidon oligosakkaridit (HMO), joita kutsutaan myös äidinmaidon glykaaneiksi, ovat oligosakkaridien ryhmään kuuluvia sokerimolekyylejä. Merkittäviä esimerkkejä HMO-yhdisteistä ovat 2’-fukosyylilaktoosi (2′-FL), lakto-N-neotetraoosi (LNnT), 3’-galaktosyylilaktoosi (3′-GL) ja difukosyylilaktoosi (DFL).
Vaikka ihmisen rintamaito sisältää yli 150 erilaista HMO-rakennetta, tällä hetkellä vain 2′-fukosyylilaktoosia (2′-FL) ja lakto-N-neotetraoosia (LNnT) tuotetaan kaupallisessa mittakaavassa ja käytetään äidinmaidonkorvikkeiden ravitsemuksellisina lisäaineina.
Äidinmaidon oligosakkaridit (HMO) tunnetaan merkityksestään vauvojen ravitsemuksessa. Äidinmaidon oligosakkaridit ovat ainutlaatuinen ravintoaineryhmä, joka toimii vauvan suolistossa prebiootteina, kiinnittymistä estävinä antimikrobisina aineina ja immuunivasteen säätelijöinä sekä edistää merkittävästi aivojen kehitystä. HMO-yhdisteitä esiintyy yksinomaan ihmisen rintamaidossa; muiden nisäkkäiden maidot (esim. lehmän, vuohen, lampaan, kamelin jne.) eivät sisällä näitä tiettyjä oligosakkaridimuotoja.
Äidinmaidon oligosakkaridit ovat ihmisen maidon kolmanneksi runsain kiinteä ainesosa, joka voi esiintyä veteen liuenneena, emulgoituneena tai suspendoituneena. Laktoosi ja rasvahapot ovat ihmisen maidon runsaimmat kiinteät aineet. HMO-yhdisteiden pitoisuus on 0,35–0,88 unssia (9,9–24,9 g)/ L. Rakenteeltaan erilaisia äidinmaidon oligosakkarideja tunnetaan noin 200. Kaikista naisista 80%:lla vallitseva oligosakkaridi on 2′-fukosyylilaktoosi, jonka pitoisuus ihmisen rintamaidossa on noin 2,5 g/ L.
Koska HMO-yhdisteet eivät pilkkoudu ruoansulatuksessa, ne eivät tuo ravintoon kaloreita. Sulamattomina hiilihydraatteina ne toimivat prebiootteina, ja suoliston hyödyllinen mikrobisto, erityisesti bifidobakteerit, fermentoi niitä valikoivasti.

Äidinmaidon oligosakkaridien biosynteesi

Solutehtaat ja entsymaattiset / kemoentsymaattiset järjestelmät ovat nykyisiä HMO-yhdisteiden synteesissä käytettäviä teknologioita. Mikrobisolutehtaiden fermentaatio, biokemiallinen synteesi ja erilaiset entsymaattiset reaktiot ovat toteuttamiskelpoisia menetelmiä HMO-yhdisteiden biotuotantoon teollisessa mittakaavassa. Taloudellisista syistä mikrobisolutehtaiden avulla toteutettava biosynteesi on tällä hetkellä ainoa HMO-yhdisteiden teollisessa tuotannossa käytettävä tekniikka.

HMO-yhdisteiden fermentaatio mikrobisolutehtaiden avulla

E.coli, Saccharomyces cerevisiae ja Lactococcus lactis ovat yleisesti käytettyjä solutehtaita biologisten molekyylien, kuten HMO-yhdisteiden, biotuotannossa. Fermentaatio on biokemiallinen prosessi, jossa mikro-organismit muuntavat substraatin halutuiksi biologisiksi molekyyleiksi. Mikrobisolutehtaat käyttävät substraattina yksinkertaisia sokereita, jotka ne muuntavat HMO-yhdisteiksi. Koska yksinkertaiset sokerit (esim. laktoosi) ovat runsain määrin saatavilla oleva ja halpa substraatti, biosynteesiprosessi pysyy kustannustehokkaana.
Kasvuun ja biokonversion nopeuteen vaikuttaa pääasiassa ravintoaineiden (substraatin) aineensiirto mikro-organismeihin. Aineensiirtonopeus on keskeinen tekijä, joka vaikuttaa tuotteen synteesiin fermentaation aikana. Ultraäänikäsittelyn tiedetään edistävän aineensiirtoa.
Fermentaation aikana bioreaktorin olosuhteita on seurattava ja säädettävä jatkuvasti, jotta solut voivat kasvaa mahdollisimman nopeasti ja tuottaa sen jälkeen haluttuja biomolekyylejä (esim. oligosakkarideja, kuten HMO-yhdisteitä; insuliinia; rekombinanttiproteiineja). Teoriassa tuotteen muodostuminen alkaa heti, kun soluviljelmä alkaa kasvaa. Erityisesti geneettisesti muunnelluissa soluissa, kuten muokatuissa mikro-organismeissa, se kuitenkin yleensä indusoidaan myöhemmin lisäämällä substraattiin kemiallista ainetta, joka lisää halutun biomolekyylin ilmentymistä. Ultraäänibioreaktoreita (sonobioreaktoreita) voidaan ohjata tarkasti, ja ne mahdollistavat mikrobien kohdennetun stimuloinnin. Tämä nopeuttaa biosynteesiä ja suurentaa saantoja.
Ultraäänilyysi ja -uutto: monimutkaisten HMO-yhdisteiden fermentaatiota saattavat rajoittaa alhaiset fermentaatiotitterit ja tuotteiden jääminen solujen sisään. Ultraäänilyysiä ja -uuttoa käytetään solunsisäisen materiaalin vapauttamiseen ennen puhdistusta ja jatkokäsittelyprosesseja.

Ultraäänellä edistetty fermentaatio

Mikrobien, kuten Escherichia colin, muokatun E.colin, Saccharomyces cerevisiaen ja Lactococcus lactisin, kasvua voidaan nopeuttaa lisäämällä aineensiirtonopeutta ja soluseinän läpäisevyyttä hallitulla matalataajuisella ultraäänikäsittelyllä. Hellävaraisena, ei-termisenä käsittelytekniikkana ultraäänikäsittely kohdistaa fermentaatioliemeen puhtaasti mekaanisia voimia.
Akustinen kavitaatio: ultraäänikäsittelyn toimintaperiaate perustuu akustiseen kavitaatioon. Ultraäänisondi (sonotrodi) kytkee matalataajuisia ultraääniaaltoja väliaineeseen. Ultraääniaallot kulkevat nesteen läpi ja synnyttävät vuorottelevia korkean paineen (puristus) / matalan paineen (harvennus) jaksoja. Nesteen vuorottainen puristuminen ja venyminen synnyttää hyvin pieniä tyhjiökuplia. Nämä pienet tyhjiökuplat kasvavat useiden jaksojen aikana, kunnes ne saavuttavat koon, jossa ne eivät enää pysty absorboimaan lisää energiaa. Tässä suurimman kasvun vaiheessa tyhjiökupla luhistuu rajusti ja synnyttää paikallisesti äärimmäiset olosuhteet, jotka tunnetaan kavitaatioilmiönä. Kavitaation ”kuumassa pisteessä” voidaan havaita suuria paine- ja lämpötilaeroja sekä voimakkaita leikkausvoimia ja nestesuihkuja, joiden nopeus on jopa 280m/sec. Näillä kavitaatiovaikutuksilla saavutetaan perusteellinen aineensiirto ja sonoporaatio (soluseinien ja solukalvojen rei’ittyminen). Substraatin ravintoaineet kulkeutuvat eläviin kokonaisiin soluihin ja niiden sisään, jolloin solutehtaat saavat optimaalisesti ravintoa ja sekä kasvu että konversio nopeutuvat. Ultraäänibioreaktorit ovat yksinkertainen mutta erittäin tehokas tapa käsitellä biomassaa yhdessä reaktioastiassa toteutettavassa biosynteesiprosessissa.
Tarkasti hallitun, hellävaraisen ultraäänikäsittelyn tiedetään tehostavan fermentaatioprosesseja.
Ultraäänikäsittely parantaa ”monien eläviä soluja hyödyntävien bioprosessien tuottavuutta tehostamalla substraatin ottoa, lisäämällä tuotantoa tai kasvua solujen huokoisuutta lisäämällä sekä mahdollisesti tehostamalla solukomponenttien vapautumista.” (Naveena et al. 2015)
Lue lisää ultraääniavusteisesta fermentaatiosta!

Naveena et al. (2015) havaitsivat, että ultraäänellä tehostaminen tarjoaa bioprosessoinnissa useita etuja, kuten alhaiset käyttökustannukset muihin tehostaviin käsittelyvaihtoehtoihin verrattuna, käytön yksinkertaisuuden ja vähäisen tehontarpeen.

Suorituskykyiset ultraäänifermentaatioreaktorit

Fermentaatioprosesseissa käytetään eläviä mikro-organismeja, kuten bakteereja tai hiivoja, jotka toimivat solutehtaina. Kun ultraäänikäsittelyllä edistetään aineensiirtoa ja lisätään mikro-organismien kasvua ja konversionopeutta, ultraäänen voimakkuuden tarkka hallinta on ratkaisevan tärkeää solutehtaiden tuhoutumisen välttämiseksi.
Hielscher Ultrasonics on erikoistunut suorituskykyisten ultraäänilaitteiden suunnitteluun, valmistukseen ja jakeluun. Näitä laitteita voidaan ohjata ja valvoa tarkasti erinomaisten fermentaatiosaantojen varmistamiseksi.

Prosessinhallinta on välttämätöntä suurten saantojen ja erinomaisen laadun saavuttamiseksi, ja se mahdollistaa myös tulosten toistamisen ja uusintamisen. Erityisesti solutehtaita stimuloitaessa ultraäänikäsittelyparametrien solukohtainen mukauttaminen on välttämätöntä suurten saantojen saavuttamiseksi ja solujen hajoamisen estämiseksi. Siksi Hielscherin ultraäänilaitteiden kaikki digitaaliset mallit on varustettu älykkäällä ohjelmistolla, jonka avulla voit säätää, seurata ja muuttaa ultraäänikäsittelyparametreja. Ultraääniprosessin parametrit, kuten amplitudi, lämpötila, paine, ultraäänikäsittelyn kesto, pulssisuhteet ja syötetty energia, ovat olennaisia HMO-yhdisteiden fermentaatiotuotannon edistämisessä.
Hielscherin ultraäänilaitteiden älykäs ohjelmisto tallentaa automaattisesti kaikki tärkeät prosessiparametrit integroituun SD-korttiin. Ultraäänikäsittelyprosessin tietojen automaattinen tallennus muodostaa perustan prosessin standardoinnille ja uusittavuudelle / toistettavuudelle, joita hyvät tuotantotavat (GMP) edellyttävät.

Ultraäänirehtorit fermentaatioon

Hielscher tarjoaa erikokoisia, eripituisia ja geometrialtaan erilaisia ultraäänisondeja, joita voidaan käyttää sekä eräkäsittelyyn että jatkuvaan läpivirtauskäsittelyyn. Ultraäänireaktoreita, joita kutsutaan myös sonobioreaktoreiksi, on saatavilla kaikille tilavuuksille kattaen ultraäänellä toteutettavan bioprosessoinnin pienistä laboratorionäytteistä pilottimittakaavaan ja täysimittaiseen kaupalliseen tuotantoon.
Ultraäänisonotrodin sijainnin reaktioastiassa tiedetään vaikuttavan kavitaation ja mikrovirtausten jakautumiseen väliaineessa. Sonotrodi ja ultraäänireaktori on valittava soluliemen käsittelytilavuuden mukaan. Vaikka ultraäänikäsittely voidaan toteuttaa sekä eräprosessina että jatkuvatoimisesti, suurille tuotantomäärille suositellaan jatkuvavirtauslaitteistoa. Ultraäänivirtauskennon läpi kulkiessaan koko soluviljelyväliaine altistuu täsmälleen samalle ultraäänikäsittelylle, mikä varmistaa tehokkaimman käsittelyn. Hielscher Ultrasonicsin laaja ultraäänisondien ja virtauskennoreaktorien valikoima mahdollistaa ihanteellisen ultraäänibioprosessointilaitteiston kokoamisen.

Hielscher Ultrasonics – laboratoriosta pilotointiin ja tuotantoon

Hielscher Ultrasonics kattaa ultraäänilaitteiden koko kirjon tarjoamalla kompakteja käsikäyttöisiä ultraäänihomogenisaattoreita näytteiden valmisteluun, pöytä- ja pilottijärjestelmiä sekä tehokkaita teollisia ultraääniyksiköitä, jotka käsittelevät helposti kuorma-autolasteittain materiaalia tunnissa. Monipuolisten ja joustavien asennus- ja kiinnitysvaihtoehtojensa ansiosta Hielscherin ultraäänilaitteet voidaan helposti integroida kaikenlaisiin eräreaktoreihin, syöttöeräprosesseihin tai jatkuviin läpivirtauslaitteistoihin.
Erilaiset lisävarusteet ja räätälöidyt osat mahdollistavat ultraäänilaitteistosi ihanteellisen mukauttamisen prosessisi vaatimuksiin.
Hielscherin ultraääniprosessorit on rakennettu ympärivuorokautiseen 24/7-käyttöön täydellä kuormalla ja raskaaseen käyttöön vaativissa olosuhteissa. Ne ovat luotettavia ja vaativat vain vähän huoltoa.
Alla oleva taulukko antaa käsityksen ultraäänilaitteidemme likimääräisestä käsittelykapasiteetista: