Peptidien kiinnevaiheinen synteesi – Tehokkaampaa ultraäänikäsittelyllä
Kiinteän faasin peptidisynteesi (SPPS) on yleinen peptidisynteesimenetelmä. Ultrasonication on luotettava työkalu kiinteän faasin peptidisynteesin tehostamiseen, mikä johtaa suurempiin saantoihin, parempaan puhtauteen, ei rasemisointiin ja merkittävästi nopeutettuun reaktionopeuteen. Hielscher Ultrasonics tarjoaa erilaisia ultraääniratkaisuja peptidisynteesiin, pilkkomiseen ja liuottamiseen.
Peptidien ultraäänipohjainen kiinteävaiheinen synteesi
Ultrasonicationia käytetään jo laajalti tehostavana menetelmänä orgaanisessa synteesissä, ja se on tunnettu eduistaan, kuten huomattavasti lyhentyneistä reaktioajoista, korkeammista saannoista, vähemmän sivutuotteista, reittien aloittamisesta, joita ei voitu saavuttaa muilla tavoilla, ja / tai paremmasta selektiivisyydestä. Suuria etuja voidaan saada myös, kun sonikaatio kytketään peptidisynteesireaktioihin. Tutkimustulokset ovat osoittaneet, että ultraäänellä avustettu peptidisynteesi saavuttaa optimoidun saannon peptideistä, joilla on korkea puhtaus, ilman rasemisointia lyhyessä reaktioajassa.
- Korkea peptidisaanto
- Huomattavasti nopeampi synteesi
- Korkeampi peptidipuhtaus
- Ei racemisoitumista
- Eri peptidien rinnakkainen synteesi
- Skaalautuu mihin tahansa volyymiin
Ultraäänikuppi useiden reaktoriastioiden yhtenäiseen sonikaatioon peptidisynteesin parantamiseksi.
Kuva, joka havainnollistaa Merrifieldin kiinteävaiheista peptidisynteesiä. Ultraäänikäsittelyä käytetään synteesireaktion edistämiseen ja tehostamiseen sekä syntetisoitujen peptidien irrottamiseen hartsista.
Grafiikka: ©Conejos-Sanchez et ai., 2014)
| Tutkimus | Tutkittuja peptidejä | Reaktioaika (klassinen vs. US-SPPS) | Raakaöljyn puhtaus (klassinen menetelmä vs. US-SPPS) | Rasemisaatio ja sivureaktiot | Tärkeimmät kohdat |
|---|---|---|---|---|---|
| Wołczański ym. (2019) | Met-enkefalini, UB33-43-OCam, TAT48-60-NH2, B2m58-69-NH2, ACP65-74-NH2, β-endorfiini | 600–1920 min → 48–284 min | 24,2–71,3 % → 60,6–89,9 % | Cys/His:n osalta ei havaittu mitään, edes 70 °C:ssa | ~7–12-kertainen synteesinopeus; merkittävä puhtauden parannus, erityisesti TAT:n kaltaisissa aggregaatioherkissä sekvensseissä. |
| Silva ym. (2021) | Pep1 (12-mer), Pep2 (9-mer), Pep3 (25-mer) | >3515/365 min → ~250/85 min (Pep1/Pep2); Pep3: 347 min (vain Yhdysvalloissa) | 73–84 % → 72–82 % (Pep1/Pep2) | Ei testattu; Pep2:ssa havaittiin lievä puhtauden lasku | Pep1:n käsittelyaika lyheni 14-kertaisesti; raakasaannot kasvoivat merkittävästi. |
| Merlino ym. (2019) | Mallipentapeptidit, jopa 44-meriset peptidit, “vaikeat jaksot” (Aβ 1–42, ACP 65–74) | 60 min → 30 min (malli) | 84 % → 93 % (malli); huomattavasti korkeampi kuin lämpölämmityksellä (~45 °C) | Cys/His-enantiomeerien pitoisuuksissa ei havaittu merkittävää nousua | Erittäin tehokas vaikeiden tai aggregaatioherkkien sekvenssien käsittelyssä; mahdollistaa reagenssien ylimäärän vähentämisen samalla kun korkea puhtausaste säilyy. |
Kiinteän faasin peptidisynteesiä parannettu ultraäänellä
Kiinteän faasin peptidisynteesi (SPPS) on kemiallinen reaktio, joka mahdollistaa peptidiketjun kokoamisen aminohappojohdannaisten peräkkäisten reaktioiden kautta liukenemattomaan huokoiseen tukeen. Perinteinen kiinteän faasin peptidisynteesi on kuitenkin suhteellisen tehoton ja hidas prosessi. Siksi peptidisynteesin ultraäänitehostus on arvostettu työkalu peptidien tehokkaampaan ja nopeampaan synteesiin.
Silva ym. (2021) vertasivat “klassinen” fluorenyylimetoksikarbonyyli (Fmoc)-kiinteävaiheinen peptidisynteesi (SPPS) ultraäänellä (US)-avusteinen SPPS, joka perustuu kolmen peptidin valmistukseen, nimittäin fibroblastikasvutekijän reseptori 3:n (FGFR3) spesifisen peptidin Pep1 (VSPPLTLGQLLS-NH2) sekä uusien peptidien Pep2 (RQMATADEA-NH2) ja Pep3 (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2).
Yhdysvaltojen tuella toteutettu SPPS-menetelmä lyhensi peptidien muodostumisaikaa 14-kertaisesti (Pep1) ja 4-kertaisesti (Pep2) verrattuna “klassinen” menetelmä. Mielenkiintoista on, että ultraäänellä avustetulla SPPS-menetelmällä saatiin Pep1:tä, jonka puhtausaste oli korkeampi (82 %) kuin “klassinen” SPPS (73 %). Merkittävä ajan säästö yhdistettynä saavutettuun korkeaan raakapeptidin puhtauteen sai tutkimusryhmän soveltamaan ultraäänellä avustettua SPPS-menetelmää suureen Pep3-peptidiin, jossa on runsaasti hydrofobisia aminohappoja ja homooligosekvenssejä. Merkittävää on, että tämän 25-merisen peptidin synteesi saatiin aikaan alle 6 tunnissa (347 min) kohtuullisella puhtaudella (noin 49 %).
Nopeampi peptidisynteesi kiinteän faasin peptidisynteesin kautta ultraäänisekoituksella.
(Tutkimus ja analyysi: Wołczański et ai., 2019)
Myös Merlino ym. (2019) tekivät kattavan tutkimuksen ultraäänen vaikutuksista Fmoc-pohjaiseen kiinteävaiheiseen peptidisynteesiin, mikä mahdollisti erilaisten biologisesti aktiivisten peptidien (jopa 44-mer) synteesin ja toi mukanaan huomattavia säästöjä materiaalin kulutuksessa ja reaktioajassa. He osoittivat, että ultraäänikäsittely ei pahentanut tärkeimpiä sivureaktioita ja paransi sellaisten peptidien synteesiä, joilla oli “vaikeat jaksot”, sijoittamalla ultraäänellä edistetyn kiinteän faasin peptidisynteesin (US-SPPS) nykyisten erittäin tehokkaiden peptidisynteettisten strategioiden joukkoon.
Korkean suorituskyvyn järjestelmien saatavuus peptidien ultraääni- (sonical) synteesiin mahdollistaa merkittävästi parantuneet synteesinopeudet ja raakatuotteiden puhtauden lisäämisen. (vrt. Wołczański et al., 2019)
Rasemisaation tutkimus. Manuaalisesti syntetisoitujen peptidien merkittävien 1H NMR-spektrien vertailu klassisella lähestymistavalla huoneenlämpötilassa vs. ultraäänimenetelmä korotetussa lämpötilassa. Hänen ja Cysin kemialliset muutokset α-protonien ja Acm: n metyleeniryhmän (vasemmat paneelit), Valin ɣ-metyyliprotonit (oikeat paneelit) osoittavat, että sonikaatio 70 ° C: ssa ei aiheuta rasemisoitumista.
(Tutkimus ja analyysi: Wołczański et ai., 2019)
Peptidien ultraääni pilkkominen
Kiinteän faasin peptidisynteesin (SPPS) jälkeen synteettiset peptidit on pilkottava polymeerihartseista. Tätä vaihetta kutsutaan myös suojauksen poistoksi. Kun verrataan tavallista ravistelua ja ultrasonicationia peptidipilkkomiseen hartsista, ravistelumenetelmä vaatii noin 1 tunnin, kun taas ultraäänipilkkominen voidaan suorittaa 15-20 minuutissa. Ultraäänipeptidipilkkoa voidaan soveltaa suojattujen aminohappojen ja peptidien pilkkomiseen, jotka liittyvät polystyreenihartseihin bentsyyliesterisidosten kautta.
Peptidien ultraäänipilkkominen polystyreenihartsista antaa korkean saannon peptidejä erittäin puhtaasti, ilman rasemisointia, nopeassa menettelyssä.
(tutkimus ja grafiikka: ©Anuradha ja Ravindranath, 1995)
Ultraäänellä kiihtynyt reaktori parantaa ja nopeuttaa peptidisynteesiä. Kuvassa näkyy ultraäänilaite UP200St sekoitetussa lasireaktorissa.
Korkean suorituskyvyn ultraäänilaitteet peptidisynteesiin
Hielscher Ultrasonics tarjoaa erilaisia ultraääniratkaisuja suoraan ja epäsuoraan sonikaatioon. Tehokkaat ja tarkasti ohjattavat ultraääniprosessorit toimittavat täsmälleen oikean määrän ultraäänienergiaa reaktioastiaan. Käytätpä ruiskuja, putkia, monikuoppalevyjä tai lasireaktoreita synteesiastiana, Hielscher Ultrasonics tarjoaa sopivimman ultraäänilaitteen peptidisovellukseesi.
- Räätälöidyt peptidit
- Laajamittainen peptidituotanto
- peptidikirjastot
Monet peptidisynteesit suoritetaan ruiskuissa (esim. fritted ruiskureaktorit). Hielscherin ultraääniruiskusekoitin sonikoi peptidiliuoksen kytkemällä ultraääniaallot ruiskun seinämän läpi nesteeseen. Ultraääniruiskusekoitin on yksi suosituimmista ultraääniliuoksista peptidien ultraäänellä avustettuun synteesiin.
Ultraäänikuppi on sopiva työkalu jopa 5 reaktoriastian sonikoimiseen, kun taas VialTweeter voi pitää jopa kymmenen reaktioputkea ja lisäksi viisi suurempaa astiaa kiinnitystarvikkeen kautta.
Muille reaktorityypeille, kuten Merrifield- tai Kamysz-kiinteävaiheisille reaktoreille sekä muille polypropeeni- tai borosilikaattisäiliöille ja -reaktoreille, Hielscher tarjoaa ultraäänilaitteita epäsuoraan ja suoraan ultraäänikäsittelyyn, joissa on räätälöity kiinnityspidike tai laippa.
Tietenkin suuremmat sekoitetut lasireaktorit, esimerkiksi liuosseossynteesiin tarkoitetut, voidaan helposti varustaa minkä kokoisilla tahansa ultraäänisondilla (eli sonotrodeilla tai ultraäänitorvilla).
- erilaisia ultraäänilaitetyyppejä
- suora ja epäsuora sonikaatio
- tarkka voimakkuuden säätö
- tarkka lämpötilan säätö
- jatkuva tai pulssi ultraääni
- Älykkäät ominaisuudet, ohjelmoitavat laitteet
- Saatavana kaikille taltioille
- lineaarinen skaalautuvuus
UIP400MTP on ihanteellinen laite kiinteän faasin peptidisynteesiin monikuoppalevyillä tai mikrotitrauslevyillä. Ultraäänikavitaatio välittyy epäsuorasti ja tasaisesti lukuisille näytekuopille, mikä takaa erinomaisen massansiirron ja synteesireaktion. Katso alla oleva video nähdäksesi, miten UIP400MTP-mikrolevyultraäänilaite toiminnassa!
Ota yhteyttä! / Kysy meiltä!
Hielscher Ultrasonics valmistaa korkean suorituskyvyn ultraäänihomogenisaattoreita sekoitussovelluksiin, dispersioon, emulgointiin ja uuttamiseen laboratorio-, pilotti- ja teollisessa mittakaavassa.
Hyödyllistä tietoa ultraäänipohjaisesta peptidisynteesistä
Mitä peptidit ovat?
Peptidit ovat yhdisteitä, joissa useat aminohapot ovat sitoutuneet amidisidosten, niin sanottujen peptidisidosten, kautta. Kun sidottu monimutkaisiin rakenteisiin – Tyypillisesti koostuen 50 tai useammasta aminohaposta -, näitä suuria peptidirakenteita kutsutaan proteiineiksi. Peptidit ovat olennainen osa elämää ja niillä on lukuisia tehtäviä kehossa.
Miten peptidisynteesi toimii?
Orgaanisessa kemiassa, molekyylibiologiassa ja biotieteissä peptidisynteesi on peptidien valmistusprosessi. Peptidit syntetisoidaan kemiallisesti yhden aminohapon karboksyyliryhmän kondensaatioreaktiolla toisen aminohapon aminohapporyhmään. Ryhmien (myös suojaavien ryhmien) strategioita käytetään yleensä välttämään ei-toivottuja sivureaktioita eri aminohappojen sivuketjujen kanssa.
Kemiallinen (in vitro) peptidisynteesi alkaa useimmiten kytkemällä saapuvan aminohapon karboksyyliryhmä (C-pääte) kasvavan peptidiketjun N-päähän. Toisin kuin tämä C-N-synteesi, pitkien peptidien luonnollinen proteiinibiosynteesi elävissä organismeissa tapahtuu vastakkaiseen suuntaan. Tämä tarkoittaa, että biosynteesissä saapuvan aminohapon N-pääte on sidottu proteiiniketjun C-päähän (N-to-C).
Useimmat peptidisynteesin tutkimus- ja kehitysprotokollat perustuvat kiinteän faasin menetelmiin, kun taas liuosfaasisynteesimenetelmiä löytyy peptidien laajamittaisesta teollisesta tuotannosta.
Mikä on peptidisynteesin nykyinen kehitystaso?
SUS-SPPS (kestävä ultraäänitukea hyödyntävä SPPS) On osoitettu, että menetelmä lyhentää prosessin vain kahteen vaiheeseen sykliä kohti (yhdistetty kytkentä/korkitus/suojaryhmän poisto + yksi pesu), mikä vähentää merkittävästi liuottimen kulutusta ja kestoa. (ks. Mottola ym., 2025)
Ultraäänellä avustettu TAPS-menettely on kehitteillä oleva yhdistelmä, jonka tehokkuus on osoitettu kokonaissynteeseissä (esim. lipobaktiini), ja jota CDMO-yritykset tutkivat aktiivisten lääkeaineiden (API) valmistusta varten.
Tutustu ultraäänellä tuetun TAGGING-peptidisynteesin etuihin!
jatkuva käsittely sitä tutkitaan mahdollisena lisäparannuksena – On kuvattu silyloitujen tunnisteiden avulla toteutettuja jatkuvia yhden astian synteesialustoja.
Ala on siirtymässä kohti vihreän kemian periaatteita, ja sekä ultraääni että TAPS edistävät liuottimien käytön vähentämistä, reagenssimäärien pienentämistä ja kestävän kehityksen parantamista.
Kirjallisuus / Viitteet
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
- Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.
Hielscher Ultrasonics valmistaa korkean suorituskyvyn ultraäänihomogenisaattoreita laboratorio jotta Teollisuuden koko.