Kiinteän faasin peptidisynteesi – tehokkaampi ultraäänikäsittelyllä
Kiinteän faasin peptidisynteesi (SPPS) on yleinen peptidien synteesimenetelmä. Ultraäänikäsittely on luotettava keino tehostaa kiinteän faasin peptidisynteesiä, mikä johtaa suurempiin saantoihin, parempaan puhtauteen, rasemisoitumisen puuttumiseen ja huomattavasti nopeampaan reaktioon. Hielscher Ultrasonics tarjoaa erilaisia ultraääniratkaisuja peptidien synteesiin, irrottamiseen ja liuottamiseen.
Ultraääniavusteinen kiinteän faasin peptidisynteesi
Ultraäänikäsittelyä käytetään jo laajasti orgaanisen synteesin tehostamismenetelmänä, ja se tunnetaan hyvin eduistaan, kuten huomattavasti lyhyemmistä reaktioajoista, suuremmista saannoista, vähäisemmästä sivutuotteiden muodostumisesta, sellaisten reaktioreittien käynnistämisestä, joita ei voitaisi toteuttaa muilla tavoin, ja/tai paremmasta selektiivisyydestä. Merkittäviä etuja voidaan saavuttaa myös kohdistamalla ultraäänikäsittely peptidien synteesireaktioihin. Tutkimustulokset ovat osoittaneet, että ultraääniavusteisessa peptidisynteesissä saavutetaan optimoitu saanto erittäin puhtaita peptidejä ilman rasemisoitumista lyhyessä reaktioajassa.
- Suuret peptidisaannot
- Huomattavasti nopeampi synteesi
- Peptidien parempi puhtaus
- Ei rasemisoitumista
- Eri peptidien rinnakkainen synteesi
- Skaalattavissa mihin tahansa tilavuuteen
Ultraäänikäyttöinen CupHorn useiden reaktioastioiden tasaiseen ultraäänikäsittelyyn peptidisynteesin parantamiseksi.
Merrifieldin kiinteän faasin peptidisynteesiä havainnollistava kuva. Ultraäänikäsittelyä käytetään synteesireaktion edistämiseen ja tehostamiseen sekä syntetisoitujen peptidien irrottamiseen hartsista.
Kuva: ©Conejos-Sanchez et al., 2014)
| Tutkimus | Tutkitut peptidit | Reaktioaika (perinteinen menetelmä vs. US-SPPS) | Raakatuotteen puhtaus (perinteinen menetelmä vs. US-SPPS) | Rasemisoituminen ja sivureaktiot | Keskeiset havainnot |
|---|---|---|---|---|---|
| Wołczański et al. (2019) | Met-enkefaliini, UB33-43-OCam, TAT48-60-NH2, B2m58-69-NH2, ACP65-74-NH2, β-endorfiini | 600–1 920 min → 48–284 min | 24,2–71,3% → 60,6–89,9% | Ei havaittu Cys/His-aminohapoilla edes 70°C:ssa | Noin 7–12 kertaa nopeampi synteesi; huomattavia parannuksia puhtaudessa, erityisesti aggregoitumisalttiilla sekvensseillä, kuten TAT. |
| Silva et al. (2021) | Pep1 (12-meeri), Pep2 (9-meeri), Pep3 (25-meeri) | >3 515/365 min → ~250/85 min (Pep1/Pep2); Pep3: 347 min (vain US) | 73–84% → 72–82% (Pep1/Pep2) | Ei testattu; Pep2:n puhtauden havaittiin heikentyneen hieman | Pep1:n synteesiaika lyheni 14-kertaisesti; raakatuotteiden saannot kasvoivat merkittävästi. |
| Merlino et al. (2019) | Mallipentapeptidit, jopa 44-meeriset peptidit, ”vaikeat sekvenssit” (Aβ 1-42, ACP 65-74) | 60 min → 30 min (malli) | 84% → 93% (malli); huomattavasti suurempi kuin lämpökuumennuksessa (~45°C) | Ei merkittävää lisääntymistä Cys/His-enantiomeereissa | Erittäin tehokas vaikeille ja aggregoitumisalttiille sekvensseille; mahdollistaa pienemmän reagenssiylimäärän säilyttäen korkean puhtauden. |
Ultraäänellä parannettu kiinteän faasin peptidisynteesi
Kiinteän faasin peptidisynteesi (SPPS) on kemiallinen reaktio, joka mahdollistaa peptidiketjun kokoamisen aminohappojohdannaisten peräkkäisillä reaktioilla liukenemattomalla huokoisella kantajalla. Perinteinen kiinteän faasin peptidisynteesi on kuitenkin suhteellisen tehoton ja hidas prosessi. Siksi peptidisynteesin tehostaminen ultraäänellä on arvostettu keino syntetisoida peptidejä tehokkaammin ja nopeammin.
Silva et al. (2021) vertasivat ”perinteistä” fluorenyylimetoksikarbonyyliin (Fmoc) perustuvaa kiinteän faasin peptidisynteesiä (SPPS) ultraääniavusteiseen (US) SPPS:ään valmistamalla kolme peptidiä: fibroblastikasvutekijäreseptori 3:lle (FGFR3) spesifisen peptidin Pep1 (VSPPLTLGQLLS-NH2) sekä uudet peptidit Pep2 (RQMATADEA-NH2) ja Pep3 (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2).
Ultraääniavusteinen SPPS lyhensi peptidien kokoamisaikaa 14-kertaisesti (Pep1) ja 4-kertaisesti (Pep2) ”perinteiseen” menetelmään verrattuna. Kiinnostavaa kyllä, ultraääniavusteisella SPPS:llä saatiin puhtaampaa Pep1:tä (82%) kuin ”perinteisellä” SPPS:llä (73%). Ajan merkittävä lyheneminen yhdessä saavutetun raakapeptidin korkean puhtauden kanssa sai tutkimusryhmän soveltamaan ultraääniavusteista SPPS:ää suureen Pep3-peptidiin, jossa on runsaasti hydrofobisia aminohappoja ja homooligomeerisiä sekvenssejä. Huomionarvoista on, että tämän 25-meerisen peptidin synteesi onnistui alle 6 tunnissa (347 min) kohtalaisella puhtaudella (noin 49%).
Nopeampi peptidisynteesi kiinteän faasin menetelmällä ultraäänisekoitusta käyttäen.
(Tutkimus ja analyysi: Wołczański et al., 2019)
Merlino et al. (2019) tekivät myös kattavan tutkimuksen ultraäänen vaikutuksista Fmoc-pohjaiseen kiinteän faasin peptidisynteesiin. Menetelmä mahdollisti erilaisten biologisesti aktiivisten peptidien (jopa 44-meerien) synteesin ja huomattavat säästöt materiaalissa ja reaktioajassa. He osoittivat, että ultraäänikäsittely ei pahentanut keskeisiä sivureaktioita ja paransi ”vaikeita sekvenssejä” sisältävien peptidien synteesiä. Näin ultraäänellä edistetty kiinteän faasin peptidisynteesi (US-SPPS) sijoittuu nykyisten erittäin tehokkaiden peptidisynteesistrategioiden joukkoon.
Tehokkaiden järjestelmien saatavuus peptidien ultraäänisynteesiin mahdollistaa huomattavasti suuremmat synteesinopeudet ja raakatuotteiden puhtauden paranemisen. (vrt. Wołczański et al., 2019)
Rasemisoitumisen tutkimus. Merkittävien 1H-NMR-spektrien vertailu mallipeptideistä, jotka on syntetisoitu käsin perinteisellä menetelmällä huoneenlämmössä tai ultraäänimenetelmällä korotetussa lämpötilassa. His- ja Cys-aminohappojen α-protonien sekä Acm:n metyleeniryhmän kemialliset siirtymät (vasemmanpuoleiset paneelit) ja Val-aminohapon ɣ-metyyliprotonien kemialliset siirtymät (oikeanpuoleiset paneelit) osoittavat, että ultraäänikäsittely 70°C:ssa ei aiheuta rasemisoitumista.
(Tutkimus ja analyysi: Wołczański et al., 2019)
Peptidien ultraääniavusteinen irrottaminen
Kiinteän faasin peptidisynteesin (SPPS) jälkeen syntetisoidut peptidit on irrotettava polymeerihartseista. Tätä vaihetta kutsutaan myös suojaryhmien poistoksi. Kun verrataan tavallista ravistelua ja ultraäänikäsittelyä peptidien irrottamiseksi hartsista, ravistelumenetelmä vaatii noin 1 tunnin, kun taas ultraääniavusteinen irrottaminen voidaan suorittaa 15–20 minuutissa. Ultraääniavusteista peptidien irrottamista voidaan soveltaa suojattujen aminohappojen ja peptidien irrottamiseen polystyreenihartseista, joihin ne on kiinnitetty bentsyyliesterisidoksilla.
Peptidien ultraääniavusteinen irrottaminen polystyreenihartsista tuottaa suuret saannot erittäin puhtaita peptidejä ilman rasemisoitumista nopealla menetelmällä.
(tutkimus ja kuva: ©Anuradha ja Ravindranath, 1995)
Ultraäänellä sekoitettava reaktori parannettuun ja nopeutettuun peptidisynteesiin. Kuvassa on ultraäänilaite UP200St sekoitettavassa lasireaktorissa.
Tehokkaat ultraäänilaitteet peptidisynteesiin
Hielscher Ultrasonics tarjoaa erilaisia ultraääniratkaisuja suoraan ja epäsuoraan ultraäänikäsittelyyn. Tehokkaat ja tarkasti säädettävät ultraääniprosessorit tuottavat reaktioastiaan juuri oikean määrän ultraäänienergiaa. Käytitpä synteesiastioina ruiskuja, putkia, monikuoppalevyjä tai lasireaktoreita, Hielscher Ultrasonics tarjoaa peptidisovellukseesi parhaiten soveltuvan ultraäänilaitteen.
- räätälöidyt peptidit
- peptidien laajamittainen tuotanto
- peptidikirjastot
Monet peptidisynteesit suoritetaan ruiskuissa (esim. sintterisuodattimella varustetuissa ruiskureaktoreissa). Ultraäänikäyttöinen ruiskusekoitin (Hielscher) käsittelee peptidiliuosta ultraäänellä kytkemällä ultraääniaallot ruiskun seinämän läpi nesteeseen. Ultraäänikäyttöinen ruiskusekoitin on yksi suosituimmista ultraääniratkaisuista peptidien ultraääniavusteiseen synteesiin.
Ultraäänikäyttöinen CupHorn on sopiva väline jopa 5 reaktioastian ultraäänikäsittelyyn, kun taas VialTweeter voi pitää paikoillaan jopa kymmenen reaktioputkea ja lisäksi viisi suurempaa astiaa puristinkiinnitteisen lisävarusteen avulla.
Muille reaktorityypeille, kuten Merrifieldin tai Kamyszin kiinteän faasin reaktoreille sekä muille polypropeeni- tai borosilikaattiastioille ja -reaktoreille, Hielscher tarjoaa epäsuoraan ja suoraan ultraäänikäsittelyyn tarkoitettuja ultraäänilaitteita, joissa on räätälöity puristinkiinnitys tai laippa.
Myös suuremmat sekoitettavat lasireaktorit, esimerkiksi liuosfaasisynteesiin tarkoitetut, voidaan helposti varustaa minkä tahansa kokoisilla ultraäänisauvoilla (joita kutsutaan myös sonotrodeiksi tai ultraäänitorviksi).
- erilaiset ultraäänilaitetyypit
- suora ja epäsuora ultraäänikäsittely
- tarkka intensiteetin säätö
- tarkka lämpötilan säätö
- jatkuva tai pulssitettu ultraääni
- älykkäät ominaisuudet, ohjelmoitavat laitteet
- saatavilla mihin tahansa tilavuuteen
- lineaarinen skaalattavuus
UIP400MTP on ihanteellinen laite kiinteän faasin peptidisynteesiin monikuoppa- ja mikrotiitterilevyillä. Ultraäänikavitaatio kytketään epäsuorasti ja tasaisesti lukuisiin näytekuoppiin ylivertaisen aineensiirron ja synteesireaktion saavuttamiseksi. Katso alla olevasta videosta mikrolevyjen ultraäänilaite UIP400MTP toiminnassa!
Ota yhteyttä! / Kysy meiltä!
Hielscher Ultrasonics valmistaa tehokkaita ultraäänihomogenisaattoreita sekoitussovelluksiin, dispergointiin, emulgointiin ja uuttamiseen laboratorio-, pilotti- ja teollisessa mittakaavassa.
Hyödyllistä tietoa ultraääniavusteisesta peptidisynteesistä
Mitä peptidit ovat?
Peptidit ovat yhdisteitä, joissa useita aminohappoja on liitetty toisiinsa amidisidoksilla eli niin kutsutuilla peptidisidoksilla. Kun ne ovat sitoutuneet monimutkaisiksi rakenteiksi – jotka koostuvat tyypillisesti vähintään 50 aminohaposta – näitä suuria peptidirakenteita kutsutaan proteiineiksi. Peptidit ovat elämän keskeisiä rakennusosia ja hoitavat lukuisia tehtäviä elimistössä.
Miten peptidisynteesi toimii?
Orgaanisessa kemiassa, molekyylibiologiassa ja biotieteissä peptidisynteesi on peptidien valmistusprosessi. Peptidejä syntetisoidaan kemiallisesti kondensaatioreaktiolla, jossa yhden aminohapon karboksyyliryhmä reagoi toisen aminohapon aminoryhmän kanssa. Suojaryhmiin perustuvia strategioita käytetään yleensä estämään ei-toivotut sivureaktiot aminohappojen erilaisten sivuketjujen kanssa.
Kemiallinen (in vitro) peptidisynteesi alkaa useimmiten liittämällä lisättävän aminohapon karboksyyliryhmä (C-terminus) kasvavan peptidiketjun N-terminukseen. Tästä C-terminuksesta N-terminukseen etenevästä synteesistä poiketen pitkien peptidien luonnollinen proteiinibiosynteesi elävissä organismeissa tapahtuu vastakkaiseen suuntaan. Tämä tarkoittaa, että biosynteesissä lisättävän aminohapon N-terminus liitetään proteiiniketjun C-terminukseen (N-terminuksesta C-terminukseen).
Useimmat peptidisynteesin tutkimus- ja kehitysmenettelyt perustuvat kiinteän faasin menetelmiin, kun taas liuosfaasisynteesimenetelmiä käytetään peptidien laajamittaisessa teollisessa tuotannossa.
Mikä on peptidisynteesin nykyinen tekninen kehitystaso?
SUS-SPPS (kestävä ultraääniavusteinen SPPS) on osoitettu menetelmäksi, joka vähentää prosessin vain kahteen vaiheeseen kierrosta kohden (yhdistetty kytkentä/pääteryhmien sulkeminen/suojaryhmien poisto + yksi pesu) ja vähentää merkittävästi liuottimen kulutusta ja tarvittavaa aikaa. (vrt. Mottola et al., 2025)
Ultraääniavusteinen TAPS on kehittyvä yhdistelmä, jonka onnistunut käyttö totaalisynteeseissä (esim. lipobactin) on osoitettu ja jota sopimuskehitys- ja valmistusorganisaatiot (CDMO) tutkivat lääkeaineiden (API) valmistusta varten.
Tutustu ultraääniavusteisen TAGGING-peptidisynteesin etuihin!
Jatkuvatoimista prosessointia tutkitaan lisäparannuksena – silyloituihin tunnisteryhmiin perustuvia jatkuvatoimisia yhden astian synteesialustoja on kuvattu.
Ala on siirtymässä kohti vihreän kemian periaatteita, ja sekä ultraääni että TAPS edistävät liuottimien käytön vähentämistä, pienempien reagenssimäärien käyttöä ja parempaa kestävyyttä.
Kirjallisuus / Lähteet
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
- Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.
Hielscher Ultrasonics valmistaa tehokkaita ultraäänihomogenisaattoreita laboratoriokoosta aina teolliseen kokoon asti.