Sonikaatioavusteinen proteiinien uuttaminen kasvainkudoksesta – Protokolla

Tässä protokollassa kuvataan ultraäänihoitoavusteinen proteiinien uuttomenetelmä kasvainkudokselle, joka kehittää tavanomaista CPTAC-urealyysiä lisäämällä siihen kudoksen hajoamisen aikana hallitun koettimen ultraäänihoitovaiheen. Tämä muutos perustuu vakiintuneeseen syvän mittakaavan CPTAC-proteomi- ja fosfoproteomipreparaatiostrategiaan, ja se parantaa solu- ja alisolurakenteiden hajoamista, vähentää näytteen viskositeettia ja tehostaa sellaisten proteiinien vapautumista, joita on tyypillisesti vaikeampi saada talteen pelkällä urealyysillä, erityisesti kalvoihin sitoutuneiden ja DNA:ta sitovien tai tumaan liittyvien proteiinien osalta. Taustalla olevassa tutkimuksessa sonikaatioavusteinen työnkulku lisäsi sekä proteiinien että fosfopeptidien havaitsemista säilyttäen samalla yhteensopivuuden jatkojalostuksen CPTAC-tyylisen pilkkomisen, TMT-merkinnän, fraktioinnin, fosfopeptidirikastuksen ja LC-MS/MS-analyysiputken kanssa.

Sonikaatioavusteinen proteiinien uuttaminen kasvainkudoksesta syvää proteomista ja fosfoproteomista analyysia varten

The following protocol is optimized for extraction of proteins from cryopulverized tumor tissue in 8 M urea lysis buffer: An added probe-type sonication step improves the recovery of difficult protein classes, especially membrane-associated and DNA-/nucleus-associated proteins, before digestion and downstream LC-MS/MS analysis. In the underlying study by Li et al. (2025), adding sonication increased detection of membrane and nucleus-associated proteins and supported deep-scale coverage of >12,000 proteins and >25,000 phosphopeptides under their workflow.

Pöytäkirjan sovellusalue

Käytä tätä menettelyä:

• tuore pakastettu, kryopulverisoitu kasvainkudos
• solupelletit tai muut biologiset näytteet, joissa ureapohjainen uuttaminen on jo vakiintunut.
• globaalit proteomiikka- ja fosfoproteomiikka-työnkulut, joissa käytetään tryptistä pilkkomista ja valinnaista TMT-merkintää.

Li et al. (2025) toteavat tutkimuksessaan, että työnkulku on sovellettavissa myös muihin näytetyyppeihin, kuten solulinjoihin, vereen ja virtsaan, mutta näytetyypeittäin voi olla tarpeen optimoida.

Optimoitu näytteenvalmistuksen työnkulku, jossa on toteutettu sonikointivaihe. Optimoitu työnkulku ja koesuunnitelma perustuvat CPTAC-näytteenvalmistusprotokollaan globaalia proteomi- ja fosfoproteomianalyysiä varten.
Tutkimus ja järjestelmä: ©Li et al., 2025.

Toimintaperiaate

Alkuperäisessä tutkimuksessa lisättiin sonikaatio CPTAC-urealyysin standardityövaiheeseen ja havaittiin, että kalvoihin ja tumaan liittyvien proteiinien havaitseminen parani. Kirjoittajat toteavat, että sonikaatioparametrit on hienosäädettävä näytteen koon/pitoisuuden suhteen. – valitsemalla sonotrodin koko, energian syöttö ja pulssin ajoitus.

Esimerkiksi Hielscher UP200Ht ja UP200St -laitteissa tämä tarkoittaa:

• käyttää amplitudia ja pulssitilaa tärkeimpinä säätömuuttujina.
• näytteet on pidettävä kylmänä koko ajan (esim. jäässä).
• aloittaa konservatiivisilla asetuksilla
• optimoida näytteen selkeyttä, lämpötilaa, proteiinien saantoa ja peptidien laatua myöhemmässä vaiheessa

 
Molemmat Hielscherin 200 watin ultraäänihomogenisaattorimallit UP200Ht ja UP200St on suunniteltu pienille ja keskisuurille näytemäärille, ja niissä on säädettävät amplitudi- ja pulssiasetukset; molemmissa ultraäänihomogenisaattoreissa on digitaalinen kosketusnäytön ohjaus parametrien tarkkaa säätöä varten, automaattinen tietojen tallennus, kytkettävä lämpötila-anturi, kauko-ohjaus ja näytteen valaistus.
 

Sonikaatioavusteisen proteiinien uuttamisen reagenssit

Urea lyysipuskuri

Valmistetaan tuoreena välittömästi ennen käyttöä:

• 8 M urea
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0.
• 1 mM EDTA
• 2 µg/ml aprotiniinia
• 10 µg/ml leupeptiini
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Fosfataasi-inhibiittorikoktail 2, 1:100 (v/v)
• Fosfataasi-inhibiittorikoktail 3, 1:100 (v/v)

Urean on oltava täysin liuennut ennen lisäaineiden lisäämistä, inhibiittorit on lisättävä välittömästi ennen käyttöä, puskuria on säilytettävä jäässä ja lisäaineiden lisäämisen jälkeen suositellaan pikemminkin pyörittelyä kuin voimakasta vorteksointia.
 

Lisäreagenssit:

• BCA-proteiinimääritysreagenssit
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• Jodoasetamidi
• LysC
• trypsiini
• Muurahaishappo
• TMT-reagenssit, jos käytetään multipleksoitua kvantitatiivista proteomiikkaa.
• IMAC-reagenssit, jos tehdään fosfopeptidirikastusta.

Sonikaatioavusteisen proteiinien uuttamisen laitteet

Vaadittu

Suositeltu anturin valinta

Käytä noin 200-1000 µl:n näytteille halkaisijaltaan pientä sonotrodia, joka soveltuu pienten tilavuuksien suoraan korkean intensiteetin käsittelyyn. Hielscher tarjoaa useita sonotrodin halkaisijoita, ja pienemmillä kärjen halkaisijoilla saavutetaan suurempi intensiteetti kärjessä.

Käytännöllinen huomautus: Käytä pienintä anturia, joka mahdollistaa tehokkaan sekoituksen ilman liiallista vaahtoamista tai astian seinämän kosketusta.

Jos työskentelet useiden näytteiden kanssa samanaikaisesti, kannattaa harkita seuraavia vaihtoehtoja Multi-Tube Sonicator VialTweeter -mikrofoni tai Microplate Sonicator UIP400MTP!

Vaiheittaiset ohjeet: Menettely Sonikaatio-avusteinen proteiinien uuttaminen: Ohjeet: Sonikaatio-avusteinen proteiinien uuttaminen

A. Esijäähdytys ja valmistelu

1. Jäähdytä sentrifugi 4 °C:seen.
2. Valmista tuore urea lyysipuskuri ja pidä se jäässä.
3. Aseta UP200Ht tai UP200St jalustalle äänikotelon sisään.
4. Valmistele riittävän suuri jäähaute, jotta näyteputket pysyvät pystyssä ja vakaasti.

Tuoreen puskurin valmistelu ja kylmäkäsittely ovat kriittisiä.

B. Alkuperäinen virtsa-aineen uuttaminen

1. Pidä kryopulverisoitu kudos jäässä.
2. Lisätään 200 µl jäähdytettyä urealyysipuskuria 50 mg märkää kudosta kohti.
3. Vortex 5-10 s suurella nopeudella.
4. Inkuboidaan 15 minuuttia 4 °C:ssa.
5. Toista vortex-plus-inkubointivaihe vielä kerran.
6. Sentrifugoidaan 20 000 g:n kierrosnopeudella 10 minuutin ajan 4 °C:ssa.
7. Siirretään lysaatti/supernatantti puhtaaseen low-bind-putkeen.

C. Sonikointi UP200Ht:n tai UP200St:n avulla

Sonikaation aloitusolosuhteet

• Amplitudi: alku 20-30 %
• Pulssin pituus: 5 s ON
• Jäähdytys: 2 min jäässä pulssien välillä.
• Jaksojen määrä: syklit: 4 sykliä
• Aktiivisen sonikaation kokonaiskesto: 20 s
• Kokonaisprosessiaika jäähdytys mukaan luettuna: noin 8-10 min.

Sonikaatiovaiheet

1. Siirretään lysaatti sonikointiin soveltuvaan putkeen. Käytä kapeaa, ohutseinäistä putkea, joka mahdollistaa hyvän lämmönvaihdon ja anturin turvallisen upottamisen.
2. Aseta putki jäähauteeseen. Asiakirjassa todetaan, että jäähdytys sonikoinnin aikana on kriittinen tekijä lämpövaurioiden estämiseksi.
3. Upota anturin kärki näytteeseen. Pidä kärki riittävän syvällä, jotta kavitaatio pysyy vakaana, mutta älä anna sen koskettaa putken seinämää tai pohjaa.
4. Suorita yksi 5 sekunnin pulssi aloitusamplitudilla.
5. Palauta näyte välittömästi kokonaan jäähän 2 minuutiksi.
6. Toista, kunnes 4 sykliä on suoritettu.
7. Tarkasta lysaatti syklin jälkeen.
8. Jatka vain tarvittaessa käyttämällä yksi 5 sekunnin lisäpulssi kerrallaan, jonka jälkeen jäähdytetään aina kokonaan.
9. Lopeta, kun lysaatista tulee tasalaatuisempaa ja vähemmän sitkeää/viskoosia.
   Lopputuloksena on läpikuultavampi lysaatti, joka muodostaa pisaroita eikä jatkuvaa viskoosia virtausta.
10. Sentrifugoidaan noin 16 000 g:n kierrosnopeudella 15 minuutin ajan 4 °C:ssa.
11. Siirretään kirkastettu supernatantti uuteen putkeen ja mitataan proteiinipitoisuus.

Globaalin proteomiikan ja fosfoproteomiikan vertailu sonikoitujen ja sonikoimattomien näytteiden välillä.
a. Tunnistettujen proteiinien määrä (globaali proteomiikka) kaikissa PDX-kasvainkudoksissa, joissa on tai ei ole sonikointia. b. Tunnistettujen fosfopeptidien määrä (IMAC-rikastus) kaikissa PDX-kasvainkudoksissa, joissa on tai ei ole sonikointia. Laskettiin vain proteiinit ja fosfopeptidit, joiden runsaussuhde oli vähintään 25. persentiili. Runsaussuhde laskettiin samantyyppisten näytteiden välillä.
Tutkimus ja kuvaajat: ©Li et al., 2025

Jatkojalostus ja analyysi

Sonikaation ja selkeytyksen jälkeen edetään alkuperäisen CPTAC-tyylisen työnkulun mukaisesti:

1. Laimennetaan lysaatti 1:3 (v/v) 50 mM Tris-HCl pH 8,0:lla urean vähentämiseksi ureaan. <2 M.
2. Lisätään LysC:tä 1 mAU 50 µg proteiinia kohti ja inkuboidaan 2 tuntia 25 °C:ssa.
3. Lisätään trypsiiniä suhteessa 1:49 entsyymi:substraatti (w/w) ja digestoidaan yön yli 25 °C:ssa.
4. Sammutetaan muurahaishapolla 1 %:n loppukosteuteen.
5. Jatketaan suolanpoistoa, TMT-merkintää, fraktiointia, fosfopeptidirikastusta ja LC-MS/MS:ää tarpeen mukaan.

Fosfopeptidien differentiaalinen ilmentyminen TMT-merkityistä MS-tableteista.
a. Basaalinen alatyyppi, jossa korostetaan joitakin ihmisen fosfosfopeptidejä (proteiinisekvenssin alku ja loppu), jotka ovat nousseet ylöspäin sonikoiduissa näytteissä verrattuna nonsonikoituihin näytteisiin. b. Luminaalinen alatyyppi, jossa korostetaan joitakin ihmisen fosfosfopeptidejä (proteiinisekvenssin alku ja loppu), jotka ovat nousseet ylöspäin sonikoiduissa näytteissä verrattuna nonsonikoituihin näytteisiin. c. Rikastetut KEGG-reitit, jotka perustuvat proteiineihin, joiden fosfopeptidit ovat nousseet ylöspäin sonikoidussa basaalisessa alatyypissä. d. Rikastetut KEGG-reitit, jotka perustuvat proteiineihin, joiden fosfopeptidit ovat nousseet ylöspäin sonikoidussa luminaalisessa alatyypissä olevissa kasvaimissa.
Tutkimus ja kuvaajat: ©Li et al., 2025

Suunnittelu, valmistus ja konsultointi – Laatu valmistettu Saksassa

Hielscher-ultraääniastiat ovat tunnettuja korkeimmista laatu- ja suunnittelustandardeistaan. Kestävyys ja helppokäyttöisyys mahdollistavat ultraäänilaitteidemme sujuvan integroinnin teollisuuslaitoksiin. Hielscher-ultraäänilaitteet käsittelevät helposti karkeita olosuhteita ja vaativia ympäristöjä.

Hielscher Ultrasonics on ISO-sertifioitu yritys ja painottaa erityisesti korkean suorituskyvyn ultraäänilaitteita, joissa on huipputeknologia ja käyttäjäystävällisyys. Tietenkin, Hielscher-ultraäänilaitteet ovat CE-yhteensopivia ja täyttävät UL: n, CSA: n ja RoHs: n vaatimukset.

Kirjallisuus / Viitteet