Ultraäänikäsittelyavusteinen proteiinien uutto kasvainkudoksesta – protokolla

Tämä protokolla kuvaa kasvainkudoksen ultraäänikäsittelyavusteisen proteiinien uuttomenetelmän, joka kehittää tavanomaista CPTAC urealyysityönkulkua lisäämällä kudoksen hajotukseen hallitun ultraäänisondilla tehtävän käsittelyvaiheen. Tämä vakiintuneeseen, kattavaan CPTAC proteomin ja fosfoproteomin valmistelustrategiaan perustuva muutos tehostaa solujen ja solunsisäisten rakenteiden hajotusta, vähentää näytteen viskositeettia ja parantaa sellaisten proteiinien vapautumista, joita on yleensä vaikeampi saada talteen pelkällä urealyysillä, erityisesti kalvoihin sitoutuneiden sekä DNA:han sitoutuvien tai tumaan liittyvien proteiinien. Taustalla olevassa tutkimuksessa ultraäänikäsittelyavusteinen työnkulku lisäsi sekä proteiinien että fosfopeptidien havaitsemista ja säilytti samalla yhteensopivuuden myöhempien CPTAC käytännön mukaisten pilkkomisen, TMT leimauksen, fraktioinnin, fosfopeptidien rikastuksen ja LC-MS/MS analyysin vaiheiden kanssa.

Ultraäänikäsittelyavusteinen proteiinien uutto kasvainkudoksesta kattavaa proteomiikka- ja fosfoproteomiikka-analyysiä varten

Seuraava protokolla on optimoitu proteiinien uuttamiseen kryojauhetusta kasvainkudoksesta 8 M urealyysipuskurissa: lisätty ultraäänisondilla tehtävä käsittelyvaihe parantaa vaikeasti uutettavien proteiiniluokkien, erityisesti kalvoihin sekä DNA:han tai tumaan liittyvien proteiinien, talteenottoa ennen pilkkomista ja myöhempää LC-MS/MS analyysiä. Taustalla olevassa Li et al. (2025) -tutkimuksessa ultraäänikäsittelyn lisääminen lisäsi kalvoihin ja tumaan liittyvien proteiinien havaitsemista ja mahdollisti heidän työnkulussaan kattavan analyysin, joka käsitti >12 000 proteiinia ja >25 000 fosfopeptidiä.

Protokollan käyttöalue

Käytä tätä menetelmää seuraaviin:

• tuoreena pakastettu, kryojauhettu kasvainkudos
• solupelletit tai muut biologiset näytteet, joiden ureapohjainen uutto on jo vakiintunut
• kokonaisproteomiikan ja -fosfoproteomiikan työnkulut, joissa käytetään trypsiinipilkkomista ja valinnaista TMT-leimausta

Li et al. (2025) -tutkimuksen mukaan työnkulku soveltuu myös muihin näytetyyppeihin, kuten solulinjoihin, vereen ja virtsaan, mutta näytetyypin mukainen optimointi voi olla tarpeen.

Optimoitu näytteenvalmistelun työnkulku, johon on lisätty ultraäänikäsittelyvaihe. Optimoitu työnkulku ja koeasetelma perustuvat kokonaisproteomiikan ja -fosfoproteomiikan analyysiin tarkoitettuun CPTAC-näytteenvalmisteluprotokollaan.
Tutkimus ja kaavio: ©Li et al., 2025

Toimintaperiaate

Alkuperäisessä tutkimuksessa tavanomaiseen CPTAC urealyysityönkulkuun lisättiin ultraäänikäsittely, ja kalvoihin ja tumiin liittyvien proteiinien havaitsemisen todettiin parantuneen. Kirjoittajat toteavat, että ultraäänikäsittelyn parametrit on hienosäädettävä näytteen koon ja pitoisuuden mukaan – valitsemalla sonotrodin koko, syötettävä energia ja pulssien ajoitus.

Esimerkiksi Hielscherin laitteiden UP200Ht ja UP200St kohdalla tämä tarkoittaa seuraavaa:

• käytä amplitudia ja pulssitilaa tärkeimpinä säätömuuttujina
• pidä näytteet kylminä koko ajan (eli jäillä)
• aloita varovaisilla asetuksilla
• optimoi näytteen kirkkauden, lämpötilan, proteiinisaannon ja myöhemmissä vaiheissa saatavien peptidien laadun perusteella

 
Molemmat Hielscherin 200 watin ultraäänilaite­mallit UP200Ht ja UP200St on suunniteltu pienille ja keskisuurille näytetilavuuksille, ja niiden amplitudi- ja pulssiasetukset ovat säädettävissä; molemmissa ultraäänihomogenisaattoreissa on digitaalinen kosketusnäyttöohjaus parametrien tarkkaan säätämiseen, automaattinen tietojen tallennus, liitettävä lämpötila-anturi, kauko-ohjaus ja näytteen valaistus.
 

Ultraäänikäsittelyavusteisessa proteiinien uutossa käytettävät reagenssit

Urealyysipuskuri

Valmista tuoreena välittömästi ennen käyttöä:

• 8 M urea
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/mL aprotiniini
• 10 µg/mL leupeptiini
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 2, 1:100 (v/v)
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 3, 1:100 (v/v)

Urean on oltava täysin liuennut ennen lisäaineiden lisäämistä; inhibiittorit tulee lisätä välittömästi ennen käyttöä; puskuri tulee pitää jäillä; lisäaineiden lisäämisen jälkeen suositellaan pyörittelevää sekoittamista voimakkaan vorteksoinnin sijaan.
 

Muut reagenssit:

• BCA-proteiinimäärityksen reagenssit
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• Jodiasetamidi
• LysC
• Trypsiini
• Muurahaishappo
• TMT-reagenssit, jos käytetään multipleksoitua kvantitatiivista proteomiikkaa
• IMAC-reagenssit, jos tehdään fosfopeptidien rikastus

Ultraäänikäsittelyavusteisessa proteiinien uutossa tarvittavat laitteet ja välineet

Tarvittavat

Suositus sondin valintaan

Käytä noin 200–1 000 µL:n näytteille halkaisijaltaan pientä sonotrodia, joka soveltuu pienten tilavuuksien suoraan, korkean intensiteetin käsittelyyn. Hielscher tarjoaa halkaisijaltaan erikokoisia sonotrodeja, ja pienemmät kärjen halkaisijat tuottavat suuremman intensiteetin kärjessä.

Käytännön huomautus: käytä pienintä sondia, joka sekoittaa tehokkaasti ilman liiallista vaahtoamista tai kosketusta astian seinämään.

Jos käsittelet useita näytteitä samanaikaisesti, voit harkita usean putken ultraäänilaitetta VialTweeter tai mikrolevyjen ultraäänilaitetta UIP400MTP!

Vaiheittaiset ohjeet: ultraäänikäsittelyavusteisen proteiinien uuton menetelmä

A. Esijäähdytys ja valmistelu

1. Jäähdytä sentrifugi 4°C:seen.
2. Valmista tuore urealyysipuskuri ja pidä se jäillä.
3. Asenna UP200Ht tai UP200St jalustaan äänieristyskotelon sisälle.
4. Valmista riittävän suuri jäähaude, jossa näyteputket pysyvät tukevasti pystyasennossa.

Puskurin valmistaminen tuoreena ja käsittely kylmässä ovat ratkaisevan tärkeitä.

B. Alustava ureauutto

1. Pidä kryojauhettu kudos jäillä.
2. Lisää 200 µL jäähdytettyä urealyysipuskuria 50 mg:aa märkää kudosta kohti.
3. Vorteksoi 5–10 s suurella nopeudella.
4. Inkuboi 15 min 4°C:ssa.
5. Toista vorteksointi- ja inkubointivaihe vielä kerran.
6. Sentrifugoi 20 000g:ssä 10 min 4°C:ssa.
7. Siirrä lysaatti/supernatantti puhtaaseen putkeen, jonka pintaan näyte sitoutuu vähäisesti.

C. Ultraäänikäsittely laitteella UP200Ht tai UP200St

Ultraäänikäsittelyn aloitusolosuhteet

• Amplitudi: aloita 20–30%:sta
• Pulssin pituus: 5 s päällä
• Jäähdytys: 2 min jäillä pulssien välillä
• Syklien määrä: 4 sykliä
• Aktiivisen ultraäänikäsittelyn kokonaisaika: 20 s
• Prosessin kokonaisaika jäähdytys mukaan lukien: noin 8–10 min

Ultraäänikäsittelyn vaiheet

1. Siirrä lysaatti ultraäänikäsittelyyn soveltuvaan putkeen. Käytä kapeaa, ohutseinäistä putkea, joka mahdollistaa hyvän lämmönvaihdon ja sondin turvallisen upottamisen.
2. Aseta putki jäähauteeseen. Tutkimusartikkelin mukaan jäähdytys ultraäänikäsittelyn aikana on ratkaisevan tärkeää lämpövaurioiden estämiseksi.
3. Upota sondin kärki näytteeseen. Pidä kärki riittävän syvällä nesteessä vakaan kavitaation ylläpitämiseksi, mutta älä anna sen koskettaa putken seinämää tai pohjaa.
4. Anna yksi 5 s:n pulssi aloitusamplitudilla.
5. Palauta näyte välittömästi kokonaan jäille 2 min ajaksi.
6. Toista, kunnes 4 sykliä on suoritettu.
7. Tarkasta lysaatti syklin jälkeen.
8. Jatka vain tarvittaessa antamalla yksi ylimääräinen 5 s:n pulssi kerrallaan ja jäähdyttämällä näyte aina sen jälkeen täysin.
9. Lopeta, kun lysaatti muuttuu tasaisemmaksi ja vähemmän venyväksi/viskoosiksi.
   Päätepisteessä lysaatti on läpikuultavampi ja muodostaa pisaroita yhtenäisen viskoosin virtauksen sijaan.
10. Sentrifugoi noin 16 000g:ssä 15 min 4°C:ssa.
11. Siirrä kirkastettu supernatantti uuteen putkeen ja mittaa proteiinipitoisuus.

Kokonaisproteomiikan ja -fosfoproteomiikan vertailu ultraäänikäsiteltyjen ja ultraäänikäsittelemättömien näytteiden välillä.
a. Tunnistettujen proteiinien määrä (kokonaisproteomiikka) kaikissa PDX-kasvainkudoksissa ultraäänikäsittelyn kanssa tai ilman sitä. b. Tunnistettujen fosfopeptidien määrä (IMAC-rikastus) kaikissa PDX-kasvainkudoksissa ultraäänikäsittelyn kanssa tai ilman sitä. Mukaan laskettiin vain proteiinit ja fosfopeptidit, joiden runsaussuhde oli vähintään 25. persentiilin suuruinen. Runsaussuhde laskettiin samantyyppisten näytteiden välillä.
Tutkimus ja kuvaajat: ©Li et al., 2025

Myöhempi pilkkominen ja analyysi

Jatka ultraäänikäsittelyn ja kirkastamisen jälkeen alkuperäisessä CPTAC-tyyppisessä työnkulussa kuvatulla tavalla:

1. Laimenna lysaatti suhteessa 1:3 (v/v) 50 mM Tris-HCl-puskurilla, jonka pH on 8,0, ureapitoisuuden pienentämiseksi tasolle <2 M.
2. Lisää LysC:tä 1 mAU 50 µg:aa proteiinia kohti ja inkuboi 2 h 25°C:ssa.
3. Lisää trypsiiniä entsyymin ja substraatin suhteessa 1:49 (w/w) ja pilko yön yli 25°C:ssa.
4. Pysäytä reaktio muurahaishapolla siten, että sen lopullinen pitoisuus on 1%.
5. Jatka tarvittaessa suolanpoistoon, TMT leimaukseen, fraktiointiin, fosfopeptidien rikastukseen ja LC-MS/MS analyysiin.

Fosfopeptidien erilainen ilmentyminen TMT leimatun MS analyysin perusteella.
a. Basaalinen alatyyppi, jossa on korostettu joitakin ihmisen fosfopeptidejä (protein-sequence, alku ja loppu), joiden ilmentyminen on lisääntynyt ultraäänikäsitellyissä näytteissä verrattuna ultraäänikäsittelemättömiin näytteisiin. b. Luminaalinen alatyyppi, jossa on korostettu joitakin ihmisen fosfopeptidejä (protein_sequence, alku ja loppu), joiden ilmentyminen on lisääntynyt ultraäänikäsitellyissä näytteissä verrattuna ultraäänikäsittelemättömiin näytteisiin. c. Rikastuneet KEGG-reitit, jotka perustuvat niiden fosfopeptidien proteiineihin, joiden ilmentyminen on lisääntynyt ultraäänikäsitellyissä basaalisen alatyypin kasvaimissa. d. Rikastuneet KEGG-reitit, jotka perustuvat niiden fosfopeptidien proteiineihin, joiden ilmentyminen on lisääntynyt ultraäänikäsitellyissä luminaalisen alatyypin kasvaimissa.
Tutkimus ja kuvaajat: ©Li et al., 2025

Suunnittelu, valmistus ja konsultointi – Saksassa valmistettua laatua

Hielscherin ultraäänilaitteet tunnetaan korkeimmista laatu- ja suunnittelustandardeistaan. Kestävyys ja helppokäyttöisyys mahdollistavat ultraäänilaitteidemme sujuvan integroinnin teollisuuslaitoksiin. Hielscherin ultraäänilaitteet selviytyvät helposti ankarista olosuhteista ja vaativista ympäristöistä.

Hielscher Ultrasonics on ISO-sertifioitu yritys, joka painottaa erityisesti suorituskykyisiä ultraäänilaitteita, joissa yhdistyvät uusinta tekniikkaa edustava teknologia ja käyttäjäystävällisyys. Hielscherin ultraäänilaitteet ovat luonnollisesti CE-vaatimusten mukaisia ja täyttävät UL:n, CSA:n ja RoHs:n vaatimukset.

Kirjallisuus / viitteet

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.