Proteomiikkatyönkulut korkean suorituskyvyn proteiinien pilkkomisella

Proteomiikka on olennainen ala biologisten prosessien ja järjestelmien ymmärtämisessä, ja proteiinien pilkkominen muodostaa kriittisen vaiheen sen työnkuluissa. Perinteisesti proteiinien pilkkominen suoritetaan liuoksessa käyttäen proteolyyttisiä entsyymejä, kuten trypsiiniä, joka hydrolysoi erityisesti peptidisidoksia lysiini- ja arginiinitähteissä. Tämä prosessi tuottaa peptidejä, jotka soveltuvat hyvin ionisaatioon ja fragmentaatioon massaspektrometriasovelluksissa (MS). Tavanomaiset mädätysmenetelmät vaativat kuitenkin 12–24 tuntia valmistuakseen, mikä luo merkittäviä pullonkauloja proteomiikan työnkulkuihin.
Ultrasonication tarjoaa tehokkaan vaihtoehdon, lyhentämällä dramaattisesti ruoansulatusaikoja tunneista vain muutamaan minuuttiin. Yhdistettynä kehittyneisiin moninäytteisiin sonikaattoreihin, kuten Hielscher CupHorn, VialTweeter ja 96-kuoppainen levysoitin UIP400MTP, ultrasonication mahdollistaa nopeutetun, korkean suorituskyvyn proteomiikan. Nämä tekniikat virtaviivaistavat työnkulkuja, lyhentävät näytteiden valmisteluaikaa ja lisäävät tehokkuutta vaarantamatta toistettavuutta tai tietojen laatua.

Ultraäänienergian rooli proteiinien ruoansulatuksessa

Ultrasonication käyttää kohdennettuja ultraääniaaltoja kavitaation luomiseksi - paikallisia mikrokuplia, jotka romahtavat tuottamaan voimakkaita leikkausvoimia. Tämä ilmiö parantaa massansiirtoa, edistää entsyymien sekoittumista substraattien kanssa ja avaa proteiinirakenteita altistamalla pilkkoutumiskohdat proteolyyttisille entsyymeille, kuten trypsiinille.
Lopputulos? Vähentää merkittävästi ruoansulatusaikaa vaarantamatta tehokkuutta tai toistettavuutta.

Ultraäänitehostettu proteolyyttinen pilkkominen: menetelmät ja tulokset

Nopeutetun ruoansulatuksen protokolla

Ultraääniavusteinen ruoansulatus yhdistää proteolyyttiset entsyymit ja ultraäänienergian työnkulkujen nopeuttamiseksi. Esimerkiksi Hielscher UP200St-CupHornin (200 W, 26 kHz) avulla ruoansulatuksen työnkulku etenee seuraavasti:

1. Pelkistys: Proteiininäytteet (0,5 mg/ml, 20 μl) käsitellään DTT:llä (2 μl, 110 mM) ammoniumbikarbonaattipuskurissa (12,5 mM). Sonikaatiota käytetään 50%: n amplitudilla 5 minuutin ajan.
2. Alkylointi: IAA: n (2 μl, 400 mM) lisäämisen jälkeen sonikaatio toistetaan samoissa olosuhteissa.
3. Ruoansulatus: Näytteet laimennetaan ja inkuboidaan immobilisoiduilla trypsiinin nanohiukkasilla. Viimeinen sonikaatiokierros (5 minuuttia) täydentää ruoansulatusta. Peptidit erotellaan, kuivataan ja varastoidaan MS-analyysiä varten.

Tämä ultraäänimenetelmä vähentää kokonaisvalmistusaikaa 12 tunnista alle 30 minuuttiin. Nopeutetusta prosessista huolimatta peptidien saanto ja laatu pysyvät yhdenmukaisina perinteisten yön yli -menetelmien kanssa.

Ultraääniproteiinin ruoansulatuksen tehokkuus

Vertailevissa tutkimuksissa, joissa käytetään E. coli -proteomeja:

• Proteiinien tunnistaminen: Ultraäänellä pilkotut näytteet tunnistivat 777 proteiinia 5 minuutissa verrattuna 817: een 12 tunnissa. Jaetut proteiinitunnistukset ylittivät 70%.
• Toistettavuus: Rinnakkaisanalyysit osoittivat korrelaatioarvoja yli 98% kussakin menetelmässä, mikä osoittaa luotettavuuden.
• Valikoivuus: Tietyt proteiinit pilkottiin ensisijaisesti kullakin menetelmällä, ultraäänipilkkominen suosi 65 proteiinia ja yön yli pilkkominen 54 proteiinia. Tällaiset vivahteikkaat erot korostavat ultrasonicationin ainutlaatuista potentiaalia tietyissä sovelluksissa.

Leimattoman proteiinin kvantifiointitulokset seitsemästä piikkiproteiinista E. coliksi
otos. Seuraavat proteiinit lisättiin kahdella eri tasolla, kuten kolonnissa on todettu
nimeltään "Theo Ratio". Theo-suhde on teoreettinen suhde tässä käytetyn kahden tason välillä
kokeilu. Naudan seerumialbumiini (ALBU), β-laktoglobuliini (LACB), α-S1-kaseiini (CASA1),
α-S2-kaseiini (CASA2), sytokromi c (CYC), ovalbumiini (OVAL) ja hiilihappoanhydraasi 2
(CAH2). Suhteet laskettiin käyttämällä MaxQuantista saatuja LFQ-proteiiniintensiteettiä
analysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
Tutkimus ja grafiikka: © Martins et al., 2019)

Nanohiukkasten immobilisoitu trypsiini

Immobilisoitujen trypsiininanohiukkasten (esim. T-FMNP) integrointi ultrasonicationiin parantaa edelleen proteomiikan työnkulkuja. Nämä nanohiukkaset tarjoavat suuren pinta-alan entsyymi-substraattien vuorovaikutukselle, mikä lisää tehokkuutta. Kun sitä sovelletaan monimutkaisiin proteomeihin, kuten E. coliin, yhdistetyllä menetelmällä saavutetaan:

• Nopeus: Täydellinen ruoansulatus 5 minuutissa.
• Tarkkuus: Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
• Skaalautuvuus: Sopeutuminen UIP400MTP:n kaltaisiin monikaivoalustoihin mahdollistaa suuren suorituskyvyn käsittelyn.

Klikkaa tästä saadaksesi yksityiskohtaisen protokollan vaiheittaisilla ohjeilla!
(vrt. Martins et al., 2019)

Proteolyyttinen pilkkominen suurella nopeudella ja suurella läpäisykyvyllä Hielscher-sonikaattoreilla

Parhaat proteomiikan sonicator-mallit

Hielscher Ultrasonics tarjoaa erilaisia sonicator-malleja samanaikaiseen moninäytteen valmistukseen, mikä helpottaa korkean suorituskyvyn työnkulkuja. Työskenteletpä sitten injektiopullojen, koeputkien, monikuoppalevyjen (esim. 6-, 24-, 96-kuoppaiset lautaset) tai petrimaljoiden kanssa – Tarjoamme sinulle ihanteelliset sonikaattorit kokeillesi.

UIP400MTP monikuoppainen levysonikaattori

Äärimmäistä läpäisykykyä varten UIP400MTP tarjoaa kyvyn käsitellä 96-kuoppaisia levyjä ultraäänellä. Yhteensopiva minkä tahansa tavallisen mikrolevyn kanssa, UIP400MTP ei vaadi kalliita patentoituja kertakäyttötuotteita ja antaa sinulle vapauden valita paras monikuoppalevy tutkimuksellesi. Toimittamalla tasaista energiaa levylle se mahdollistaa jopa 200 monimutkaisen proteomin nopean pelkistyksen, alkyloinnin ja pilkkomisen vain 1 tunnissa. Tämä automaation ja tehokkuuden taso on ratkaisevan tärkeää suuren suorituskyvyn proteomiikalle ja kliinisille sovelluksille. Lisätietoja monikuoppaisesta levysonikaattorista!

VialTweeter

VialTweeter on räätälöity laboratorioihin, jotka vaativat jopa 10 injektiopullon tai koeputken samanaikaista sonikaatiota. Sen ei-invasiivinen lähestymistapa eliminoi ristikontaminaation riskit ja varmistaa samalla toistettavan proteiinipilkkomisen. Tämä laite on ihanteellinen tutkijoille, jotka työskentelevät rajallisten näytemäärien tai erilaisten näytetyyppien kanssa.
Lisätietoja VialTweeter-moniputkisesta sonikaattorista!

Hielscher UP200St-CupHorn

CupHorn-sonikaattori on tehokas laite, joka on suunniteltu useiden näytteiden samanaikaiseen käsittelyyn suljetuissa astioissa. Se varmistaa tasaisen ultraäänienergian jakautumisen ja tarkan lämpötilan säädön. Kyky käsitellä jopa viittä näytettä samanaikaisesti yhdistettynä sen yhteensopivuuteen pelkistetyn, alkyloidun ja pilkotun työnkulun kanssa tekee CupHornista luotettavan työkalun MS-pohjaiseen proteomiikkaan.
Lue lisää CupHorn SonoReactorista!

Vaiheittainen protokolla ultrasonication-avusteiselle proteolyyttiselle ruoansulatukselle käyttäen nanohiukkasimmobilisoitua trypsiiniä

(2019) on optimoitu proteiinien nopeaan pilkkomiseen ultraäänienergian ja nanohiukkasimmobilisoidun trypsiinin (T-FMNP) avulla. Kuvatut vaiheet varmistavat tehokkaan pelkistyksen, alkyloinnin ja proteolyysin, jotka soveltuvat massaspektrometrian (MS) sovelluksiin.
Protokollan vaiheet

1. Disulfidisidosten vähentäminen
   • Lisätään 2 μl DTT-liuosta (110 mM) 20 μl:n proteiininäytteeseen (0,5 mg/ml) AmBic-puskurissa.
   • Aseta näyteputki sonoreaktoriin UP200St-CupHorn.
   • Sonikoidaan näytettä 2,5 minuutin ajan 50%: n amplitudilla (200 W, 26 kHz).
   • Keskeytä lyhyt aikaväli jäähdytyksen mahdollistamiseksi, sitten sonikoidaan vielä 2,5 minuuttia samoissa olosuhteissa.
2. Pelkistyneiden kysteiinijäämien alkylointi
   • Lisätään 2 μl IAA-liuosta (400 mM) pelkistyneeseen proteiininäytteeseen.
   • Sonikoidaan 2,5 minuuttia 50%: n amplitudilla alkyloinnin helpottamiseksi.
   • Tauko jäähdytystä varten, sitten sonikoidaan vielä 2,5 minuuttia.

   Huomautus: Minimoi alkyloidun näytteen altistuminen valolle IAA:n hajoamisen estämiseksi.

3. Näytteen laimennus
   • Alkyloitu proteiininäyte laimennetaan lopulliseen tilavuuteen 100 μl käyttäen 25 mM AmBic puskuria, joka sisältää 4 % asetonitriiliä (v/v).
   • Sekoita huolellisesti kevyesti pipetoimalla.
4. Proteolyyttinen pilkkominen nanohiukkasimmobilisoidulla trypsiinillä
   • Lisätään laimennettuun proteiininäytteeseen 20 μl T-FMNP-liuosta (3 mg/ml).
   • Sonikoidaan seosta sonoreaktorissa 2,5 minuutin ajan 50%: n amplitudilla.
   • Tauko jäähdytystä varten, sitten sonikoidaan vielä 2,5 minuuttia samoissa olosuhteissa.
5. Trypsiininanohiukkasten erottaminen
   • Käytä magneettia erottamaan T-FMNP:t pilkkoutuneita peptidejä sisältävästä supernatantista.
   • Supernatantti siirretään uuteen mikrosentrifugiputkeen.
6. Peptidivalmiste MS-analyysiä varten
   • Peptidejä sisältävä supernatantti kuivataan tyhjiösentrifugissa.
   • Kuivatut peptidit säilytetään -20 °C:ssa, kunnes ne analysoidaan tarkemmin massaspektrometrisesti.