Proteomiikan työnkulut suuren näytekapasiteetin proteiinipilkonnalla

Proteomiikka on keskeinen tutkimusala biologisten prosessien ja järjestelmien ymmärtämisessä, ja proteiinien pilkonta on sen työnkulkujen kriittinen vaihe. Perinteisesti proteiinien pilkonta tehdään liuoksessa proteolyyttisillä entsyymeillä, kuten trypsiinillä, joka hydrolysoi spesifisesti peptidisidoksia lysiini- ja arginiinitähteiden kohdalla. Tässä prosessissa syntyy peptidejä, jotka soveltuvat hyvin ionisointiin ja fragmentointiin massaspektrometrisissä (MS) sovelluksissa. Tavanomaiset pilkontamenetelmät vaativat kuitenkin 12–24 tuntia valmistuakseen, mikä aiheuttaa merkittäviä pullonkauloja proteomiikan työnkulkuihin.
Ultraäänikäsittely tarjoaa tehokkaan vaihtoehdon ja lyhentää pilkonta-aikoja huomattavasti tunneista vain muutamaan minuuttiin. Yhdistettynä edistyneisiin usean näytteen ultraäänilaitteisiin, kuten Hielscher CupHorn, VialTweeter ja 96-kuoppalevyjen ultraäänilaite UIP400MTP, ultraäänikäsittely mahdollistaa nopeutetun proteomiikan suurella näytekapasiteetilla. Nämä teknologiat sujuvoittavat työnkulkuja, lyhentävät näytteiden valmisteluaikaa ja parantavat tehokkuutta heikentämättä toistettavuutta tai datan laatua.

Ultraäänienergian rooli proteiinien pilkonnassa

Ultraäänikäsittelyssä käytetään kohdennettuja ultraääniaaltoja kavitaation synnyttämiseen – paikalliset mikrokuplat luhistuvat ja tuottavat voimakkaita leikkausvoimia. Tämä ilmiö tehostaa aineensiirtoa, edistää entsyymien sekoittumista substraatteihin ja avaa proteiinirakenteita, jolloin katkaisukohdat tulevat proteolyyttisten entsyymien, kuten trypsiinin, ulottuville.
Tulos? Pilkonta-aika lyhenee merkittävästi tehokkuuden tai toistettavuuden heikentymättä.

Ultraäänellä tehostettu proteolyyttinen pilkonta: menetelmät ja tulokset

Nopeutettu pilkontaprotokolla

Ultraääniavusteinen pilkonta yhdistää proteolyyttiset entsyymit ja ultraäänienergian työnkulkujen nopeuttamiseksi. Esimerkiksi Hielscher UP200St-CupHorn -laitetta (200 W, 26 kHz) käytettäessä pilkonnan työnkulku etenee seuraavasti:

1. Pelkistys: Proteiininäytteitä (0,5 mg/mL, 20 µL) käsitellään DTT:llä (2 µL, 110 mM) ammoniumbikarbonaattipuskurissa (12,5 mM). Ultraäänikäsittely tehdään 50 %:n amplitudilla 5 minuutin ajan.
2. Alkylointi: IAA:n (2 µL, 400 mM) lisäämisen jälkeen ultraäänikäsittely toistetaan samoissa olosuhteissa.
3. Pilkonta: Näytteet laimennetaan ja inkuboidaan nanohiukkasten kanssa, joihin on immobilisoitu trypsiiniä. Viimeinen ultraäänikäsittelyjakso (5 minuuttia) saattaa pilkonnan loppuun. Peptidit erotetaan, kuivataan ja säilytetään massaspektrometristä analyysiä (MS) varten.

Tämä ultraäänimenetelmä lyhentää kokonaisvalmisteluajan 12 tunnista alle 30 minuuttiin. Nopeutetusta prosessista huolimatta peptidien saanto ja laatu vastaavat perinteisten yön yli kestävien menetelmien tuloksia.

Proteiinien ultraäänipilkonnan tehokkuus

E. coli -proteomeilla tehdyissä vertailevissa tutkimuksissa:

• Proteiinien tunnistaminen: Ultraäänellä pilkotuista näytteistä tunnistettiin 777 proteiinia 5 minuutissa, kun taas 12 tunnissa tunnistettiin 817 proteiinia. Yhteisten proteiinitunnistusten osuus ylitti 70 %.
• Toistettavuus: Rinnakkaisanalyyseissä korrelaatioarvot ylittivät 98 % kummankin menetelmän sisällä, mikä osoittaa luotettavuuden.
• Selektiivisyys: Kumpikin menetelmä pilkkoi tiettyjä proteiineja ensisijaisesti: ultraäänipilkonta suosi 65:tä proteiinia ja yön yli kestävä pilkonta 54:ää proteiinia. Tällaiset hienovaraiset erot korostavat ultraäänikäsittelyn ainutlaatuista potentiaalia tietyissä sovelluksissa.

E. coli -näytteeseen lisättyjen seitsemän proteiinin
leimaamattoman proteiinimäärityksen tulokset. Seuraavia proteiineja lisättiin kahdella eri pitoisuustasolla, kuten on merkitty sarakkeeseen
nimeltä ”Theo Ratio”. Theo Ratio on tässä
kokeessa käytettyjen kahden pitoisuustason välinen teoreettinen suhde. Naudan seerumin albumiini (ALBU), β-laktoglobuliini (LACB), α-S1-kaseiini (CASA1),
α-S2-kaseiini (CASA2), sytokromi c (CYC), ovalbumiini (OVAL) ja hiilihappoanhydraasi 2
(CAH2). Suhteet laskettiin MaxQuant-analyysistä saatujen LFQ-proteiini-intensiteettien perusteella.
Studentin t-testiä käytettiin kullakin menetelmällä saatujen arvojen vertailuun (p>0,01, n=3, t-theoretical=4,6).
Tutkimus ja kuva: © Martins et al., 2019)

Nanohiukkasiin immobilisoitu trypsiini

Trypsiiniä sisältävien immobilisoitujen nanohiukkasten (esim. T-FMNP:t) yhdistäminen ultraäänikäsittelyyn tehostaa proteomiikan työnkulkuja entisestään. Nämä nanohiukkaset tarjoavat suuren pinta-alan entsyymien ja substraattien välisille vuorovaikutuksille, mikä lisää tehokkuutta. Monimutkaisiin proteomeihin, kuten E. coli -proteomiin, sovellettuna yhdistetty menetelmä saavuttaa seuraavat tulokset:

• Nopeus: Täydellinen pilkonta 5 minuutissa.
• Tarkkuus: Perinteisiin menetelmiin verrattavissa oleva proteiinien kvantifiointi (p > 0,01, n=3).
• Skaalautuvuus: Sovittaminen monikuoppalevyjärjestelmiin, kuten UIP400MTP, mahdollistaa käsittelyn suurella näytekapasiteetilla.

Napsauta tästä ja tutustu yksityiskohtaiseen protokollaan vaiheittaisine ohjeineen!
(vrt. Martins et al., 2019)

Nopea proteolyyttinen pilkonta suurella näytekapasiteetilla Hielscherin ultraäänilaitteilla

Parhaat ultraäänilaitemallit proteomiikkaan

Hielscher Ultrasonics tarjoaa erilaisia ultraäänilaitemalleja useiden näytteiden samanaikaiseen valmisteluun, mikä helpottaa suuren näytekapasiteetin työnkulkuja. Työskenteletpä näytepullojen, koeputkien, monikuoppalevyjen (esim. 6-, 24- ja 96-kuoppalevyjen) tai petrimaljojen kanssa – tarjoamme kokeisiisi ihanteelliset ultraäänilaitteet.

Monikuoppalevyjen ultraäänilaite UIP400MTP

Maksimaalisen näytekapasiteetin saavuttamiseksi UIP400MTP mahdollistaa 96-kuoppalevyjen ultraäänikäsittelyn. UIP400MTP on yhteensopiva kaikkien standardimikrolevyjen kanssa, joten se ei edellytä kalliita valmistajakohtaisia kertakäyttötarvikkeita ja antaa vapauden valita tutkimukseesi parhaiten sopivan monikuoppalevyn. Jakamalla energian tasaisesti koko levylle se mahdollistaa jopa 200 monimutkaisen proteomin nopean pelkistyksen, alkyloinnin ja pilkonnan vain 1 tunnissa. Tämä automaation ja tehokkuuden taso on ratkaisevan tärkeä suuren näytekapasiteetin proteomiikassa ja kliinisissä sovelluksissa. Lue lisää monikuoppalevyjen ultraäänilaitteesta!

VialTweeter

VialTweeter on suunniteltu laboratorioille, jotka tarvitsevat jopa 10 näytepullon tai koeputken samanaikaista ultraäänikäsittelyä. Sen näytteeseen tunkeutumaton toimintatapa poistaa ristikontaminaation riskit ja varmistaa samalla proteiinien pilkonnan toistettavuuden. Tämä laite on ihanteellinen tutkijoille, jotka työskentelevät pienillä näytetilavuuksilla tai erilaisilla näytetyypeillä.
Lue lisää usean putken ultraäänilaitteesta VialTweeter!

Hielscher UP200St-CupHorn

CupHorn on tehokas ultraäänilaite, joka on suunniteltu useiden näytteiden samanaikaiseen käsittelyyn suljetuissa astioissa. Se varmistaa ultraäänienergian tasaisen jakautumisen ja tarkan lämpötilansäädön. Koska CupHorn pystyy käsittelemään jopa viittä näytettä samanaikaisesti ja on yhteensopiva pelkistyksen, alkyloinnin ja pilkonnan sisältävien työnkulkujen kanssa, se on luotettava työkalu massaspektrometriaan (MS) perustuvaan proteomiikkaan.
Lue lisää CupHorn SonoReactor -laitteesta!

Vaiheittainen protokolla ultraääniavusteiseen proteolyyttiseen pilkontaan nanohiukkasiin immobilisoidulla trypsiinillä

Tämä Martins et al. (2019) -protokolla on optimoitu proteiinien nopeaan pilkontaan ultraäänienergialla ja nanohiukkasiin immobilisoidulla trypsiinillä (T-FMNP:t). Esitetyt vaiheet varmistavat tehokkaan pelkistyksen, alkyloinnin ja proteolyysin massaspektrometrisiin (MS) sovelluksiin.
Protokollan vaiheet

1. Disulfidisidosten pelkistys
   • Lisää 2 µL DTT-liuosta (110 mM) AmBic-puskurissa olevaan 20 µL:n proteiininäytteeseen (0,5 mg/mL).
   • Aseta näyteputki ultraäänireaktoriin UP200St-CupHorn.
   • Käsittele näytettä ultraäänellä 2,5 minuuttia 50 %:n amplitudilla (200 W, 26 kHz).
   • Pidä lyhyt tauko jäähtymistä varten ja jatka sitten ultraäänikäsittelyä vielä 2,5 minuuttia samoissa olosuhteissa.
2. Pelkistettyjen kysteiinitähteiden alkylointi
   • Lisää 2 µL IAA-liuosta (400 mM) pelkistettyyn proteiininäytteeseen.
   • Käsittele ultraäänellä 2,5 minuuttia 50 %:n amplitudilla alkyloinnin edistämiseksi.
   • Pidä tauko jäähtymistä varten ja jatka sitten ultraäänikäsittelyä vielä 2,5 minuuttia.

   Huomautus: Minimoi alkyloidun näytteen altistuminen valolle IAA:n hajoamisen estämiseksi.

3. Näytteen laimennus
   • Laimenna alkyloitu proteiininäyte 100 µL:n lopputilavuuteen käyttäen 25 mM:n AmBic-puskuria, joka sisältää 4 % asetonitriiliä (v/v).
   • Sekoita huolellisesti pipetoimalla varovasti.
4. Proteolyyttinen pilkonta nanohiukkasiin immobilisoidulla trypsiinillä
   • Lisää 20 µL T-FMNP-liuosta (3 mg/mL) laimennettuun proteiininäytteeseen.
   • Käsittele seosta ultraäänireaktorissa ultraäänellä 2,5 minuuttia 50 %:n amplitudilla.
   • Pidä tauko jäähtymistä varten ja jatka sitten ultraäänikäsittelyä vielä 2,5 minuuttia samoissa olosuhteissa.
5. Trypsiiniä sisältävien nanohiukkasten erottaminen
   • Erota T-FMNP:t magneetilla pilkottuja peptidejä sisältävästä supernatantista.
   • Siirrä supernatantti uuteen mikrosentrifugiputkeen.
6. Peptidien valmistelu massaspektrometristä analyysiä (MS) varten
   • Kuivaa peptidejä sisältävä supernatantti tyhjiösentrifugissa.
   • Säilytä kuivattuja peptidejä -20°C:ssa massaspektrometristä jatkoanalyysiä varten.