Ultraäänisuodatinavusteinen näytteenvalmistus (FASP): Proteomiikan työnkulkujen parantaminen kehittyneellä sonikaatiolla
Ultraäänisuodattimella tuettu näytteenvalmistus (FASP) on kehittymässä erittäin tehokkaaksi ja toistettavaksi menetelmäksi nykyaikaisessa proteomiikan tutkimuksessa. Integroimalla hallittu sonikointi vakiintuneisiin FASP-työnkulkuihin tutkijat voivat parantaa merkittävästi proteiinien uuttamista, sulatuksen tehokkuutta ja datan kokonaislaatua. Kun korkean läpimenotehon ja toistettavan näytteenvalmistuksen kysyntä kasvaa, mikrolevyjen sonikaattorin UIP400MTP:n kaltaiset kohdennetut sonikaattorit ovat saamassa tieteellistä ja käytännöllistä merkitystä.
Tieteellinen konteksti: Miksi FASP:llä on merkitystä proteomiikan alalla?
Suodatinavusteisesta näytteenvalmistuksesta (FASP) on tullut bottom-up-proteomiikan kultainen standardi, koska se poistaa detergentit, suolat ja muut epäpuhtaudet ja mahdollistaa samalla tehokkaan entsymaattisen pilkkomisen. Klassisissa FASP-protokollissa on kuitenkin usein rajoituksia, jotka liittyvät epätäydelliseen lyysiin, epäjohdonmukaiseen sulatukseen ja näytteiden vaihtelevuuteen. – erityisesti silloin, kun on kyse monimutkaisista tai joustavista biologisista soluista tai kudoksista.
Tässä kohdennettu ultraäänienergia (sonikointi) tarjoaa ratkaisevan edun. Mekaanisten leikkausvoimien ja kavitaation avulla sonikointi tehostaa useita kriittisiä vaiheita FASP-työnkulussa vaarantamatta proteiinien eheyttä.
Multi-well-levyn sonikaattori UIP400MTP helpottaa suodatinavusteista näytteenvalmistusta (FASP).
Sonikaation myönteiset vaikutukset ultraääni-FASP:ssä
Sonikointi tuo mukanaan hallittua akustista kavitaatiota. – mikroskooppisen kuplan muodostuminen ja romahtaminen – mikä aiheuttaa paikallisia leikkausvoimia ja mikrovirtauksia.
Sonikaatio tehostaa sekä alkylointi- että mädätysvaiheita ultraääni-FASP:ssä parantamalla aineensiirtoa ja nopeuttamalla reaktiokinetiikkaa. Ultraäänienergian käyttö tuottaa kavitaatiota, mikä johtaa paikalliseen mikrovirtaukseen ja ohimeneviin leikkausvoimiin, jotka edistävät reagenssien nopeaa sekoittumista ja tehokasta tunkeutumista proteiinimatriisiin tai suodatinympäristöön. Alkyloinnin aikana tämä johtaa kysteiinijäämien tasaisempaan ja nopeampaan modifiointiin jodoasetamidilla. Digestiovaiheessa sonikointi lisää proteolyyttisten pilkkoutumiskohtien saavutettavuutta ja parantaa entsyymin ja substraatin vuorovaikutusta, mikä nopeuttaa trypsiinin aktiivisuutta ja parantaa digestion tehokkuutta. Kaiken kaikkiaan ultraäänikäsittely lyhentää käsittelyaikaa säilyttäen tai parantaen reaktion täydellisyyttä ja toistettavuutta.
Proteomiikan näytteenvalmistuksessa ultraääni-FASP tarkoittaa:
- Tehokkaampi solujen hajottaminen ja proteiinien uuttaminen jopa vaikeista kudoksista tai mikrobinäytteistä.
- Proteiinien tehostettu liukeneminen
- Parempi entsyymien saavutettavuus ruoansulatuksen aikana.
- Käsittelyajan lyhentäminen ja lisääntynyt toistettavuus
Toisin kuin tavanomaiset mekaaniset tai kemialliset lyysimenetelmät, ultraäänikäsittely on hyvin hallittavissa ja skaalattavissa, joten se soveltuu erityisen hyvin standardoituihin proteomiikan työnkulkuihin.
UIP400MTP ei ole ultraäänihaude. Se on korkean intensiteetin kuppisarvi keskittyneelle sonikaatiolle. Tämä tehokas kosketukseton sonikaattori tuottaa yhtenäisen sonikoinnin tavallisen kaivolevyn kaikissa kaivoissa. Voit hallita tarkasti amplitudia, tehoa ja pulssia. Sisäänrakennettu ajastin ja lämpötila-anturi takaavat tasalaatuiset tulokset. UIP400MTP levysonikaattori jäähdyttää näytteitä vesihauteella (ulkoinen jäähdytin valinnainen).
Ultraääni-FASP:n edut perinteisiin menetelmiin verrattuna
Sonikaation sisällyttäminen FASP-protokolliin tarjoaa mitattavissa olevia etuja, jotka vaikuttavat suoraan myöhemmän prosessin massaspektrometrisiin tuloksiin.
Ultraääni-FASP mahdollistaa täydellisemmän proteiinien talteenoton erityisesti haastavista näytteistä, kuten kuitukudoksista tai biofilmistä. Tasainen energiajakauma takaa yhdenmukaisen käsittelyn kaikissa toistoissa, mikä vähentää vaihtelua. – olennainen edellytys kvantitatiivisen proteomiikan kannalta.
Lisäksi sonikointi nopeuttaa ruoansulatuskinetiikkaa parantamalla entsyymin ja substraatin vuorovaikutusta. Tämä johtaa usein lyhyempiin pilkkomisaikoihin ja suurempaan peptidisaantoon, samalla kun sekvenssin kattavuus säilyy.
Työnkulun näkökulmasta ultraäänijärjestelmät vähentävät manuaalisia toimenpiteitä ja poistavat aggressiivisten kemiallisten käsittelyjen tarpeen, jolloin näytteen eheys säilyy ja protokollan standardointi yksinkertaistuu.
Venn-diagrammi, josta käy ilmi ultraääni-FASP:n avulla tunnistettujen proteiinien määrän kasvu verrattuna yön yli -FASP:hen.
Kuva ja tutkimus: ©Carvalho et al., 2020.
UIP400MTP monikuoppalevykuvauslaite suodatinavusteiseen näytteenvalmistukseen (FASP).
Pöytäkirja: UIP400MTP:llä: Suuren läpimenon ultraääni-FASP-menetelmä.
Suuria näytekohortteja käsitteleville laboratorioille UIP400MTP-mikrolevykuvauslaite mahdollistaa standardien monikuoppalevyjen (esim. 96 kuoppalevyjen) samanaikaisen kuuntelun, mikä lisää merkittävästi läpimenoa ja toistettavuutta.
Tässä muodossa näytteet (tyypillisesti 50-200 µl kuoppaa kohti) valmistetaan suoraan mikrolevyihin, jotka ovat yhteensopivia ultrasuodatuksen tai jatkokäsittelyn kanssa. Lyysipuskurit ovat samankaltaisia kuin tavanomaisissa FASP-protokollissa käytetyt.
UIP400MTP käyttää tasaista ultraäänienergiaa kaikissa kuopissa. Sonikaatio suoritetaan tyypillisesti 60-80 prosentin amplitudilla 2-4 minuutin ajan näytetyypistä riippuen. Seuraa lämpötilaa kytkettävän lämpötila-anturin avulla. Käyttämällä pulssimuotoista sonikointia ja valinnaisesti laboratoriojäähdytintä.
Esimerkkipöytäkirja:
- Alkylointivaihetta varten näytteitä sonikoidaan mikrolevyjen sonikaattorilla (UIP400MTP) 40 prosentin amplitudilla 7 syklin ajan (30 s ON, 15 s OFF; sonikointiaika yhteensä 5 min 45 s).
- Sonikaation jälkeen jodoasetamidi (IAA) -liuos poistetaan sentrifugoimalla. Ennen trypsiinin pilkkomista näytteet on pestävä ureajäämien poistamiseksi, sillä urea on vahva kaotrooppinen aine, joka estää entsymaattista aktiivisuutta. Siksi näytteet pestään kahdesti 200 μl:lla 25 mM ammoniumbikarbonaattia (AmBic).
- Tämän jälkeen lisätään 100 μl trypsiiniliuosta (entsyymi/proteiini-suhde 1:30), joka on valmistettu 12,5 mM ammoniumbikarbonaatissa. Proteiinien pilkkominen suoritetaan sitten UIP400MTP:llä samoissa sonikaatio-olosuhteissa (40 % amplitudi, 7 sykliä, 30 s ON / 15 s OFF; kokonaisaika: 5 min 45 s).
- Sonikaation jälkeen näytteet siirretään suodatinlevyille tai käsitellään levypohjaisilla FASP-järjestelmillä. Pelkistys- ja alkylointivaiheet suoritetaan levyn sisällä, jolloin työnkulku pysyy virtaviivaisena.
- Trypsiinin pilkkominen suoritetaan kontrolloiduissa olosuhteissa (esim. 37 °C, 4-16 tuntia), ja lisäksi on mahdollista käyttää lyhytaikaista ultraäänistimulaatiota entsymaattisen aktiivisuuden kiihdyttämiseksi ja peptidisaannon parantamiseksi.
- Peptidit otetaan talteen sentrifugoimalla ja ovat valmiita LC-MS/MS-analyysiä varten.
Järjestelmän tärkein etu on sen kyky tuottaa identtiset käsittelyolosuhteet kaikkiin kuoppiin, mikä minimoi erien vaikutukset ja mahdollistaa vankat kvantitatiiviset vertailut laajamittaisissa proteomitutkimuksissa.
VialTweeter Multi-Tube Sonicator -äänentoistolaite nopeuttaa ja parantaa suodatinavusteista näytteenvalmistusta (FASP) proteomiikan alalla.
Tieteellinen merkitys
Sonikaation sisällyttäminen FASP-työnkulkuihin ei ole pelkästään tekninen parannus. – se edustaa metodologista edistystä proteomiikan näytteenvalmistuksessa. Alan siirtyessä kohti suurempaa läpäisykykyä, automaatiota ja toistettavuutta ultraäänitekniikat ratkaisevat näytteiden käsittelyn perustavanlaatuisia pullonkauloja.
Viimeaikaiset tutkimukset korostavat yhä enemmän näytteiden johdonmukaisen valmistuksen merkitystä luotettavan biomarkkerien löytämisen ja kvantitatiivisen proteomiikan kannalta. Ultraääni-FASP edistää suoraan tätä tavoitetta parantamalla uuton tehokkuutta, sulatuksen johdonmukaisuutta ja työnkulun yleistä kestävyyttä.
Lisäksi ultraäänijärjestelmien skaalautuvuus – yksittäisistä injektiopulloista VialTweeterin avulla täydellisiin mikrolevyihin UIP400MTP:n avulla. – vastaa sekä kartoittavien että suurten kohorttien proteomitutkimusten kasvavaa kysyntää.
Hanki Sonicator helpottamaan FASP-työnkulkua!
Ultraäänisuodattimella tuetussa näytteenvalmistuksessa yhdistyvät FASP:n todistetut vahvuudet ja sonikaation fyysiset edut. Tehostamalla lyysiä, parantamalla pilkkomista ja standardoimalla työnkulkuja ultraäänijärjestelmät tarjoavat tehokkaan ratkaisun nykyaikaiseen proteomiikkaan.
Multi-Tube Sonicator VialTweeter ja Microplate Sonicator UIP400MTP ovat esimerkkejä siitä, miten keskitetty ultraäänienergia voi muuttaa rutiininomaisen näytteenvalmistuksen tehokkaammaksi, toistettavammaksi ja tieteellisesti kestävämmäksi prosessiksi. – Tämä johtaa lopulta laadukkaampaan proteomitietoon ja syvempiin biologisiin oivalluksiin.
Valitse sopivin Sonicator suodatinavusteiseen näytteenvalmistukseen
| Sonicator-malli | FASP:n edut | Paras käyttö |
| UIP400MTP mikrolevyn sonikaattori | Tasainen sonikointi koko mikrolevyissä; erittäin toistettava energian syöttö; nopeuttaa alkylointia ja entsymaattista pilkkomista korkean läpimenon työnkuluissa; yhteensopiva automatisoidun näytteenvalmistuksen kanssa. | Suuren läpimenon FASP-työnkulut 96-kuoppaisissa tai vastaavissa levyformaateissa, mukaan lukien proteomiikan seulontasovellukset. |
| VialTweeter moniputkinen sonikaattori | Useiden suljettujen putkien samanaikainen, tasainen sonikointi; minimoi ristikontaminaation ja näytteiden hävikin; parantaa reagenssin tunkeutumista ja sekoittumista, mikä parantaa alkyloinnin ja digestion tehokkuutta. | Useiden FASP-näytteiden rinnakkaiskäsittely kohtuullisella läpimenolla ja hyvällä toistettavuudella. |
| CupHorn (epäsuora sonikointi “korkean intensiteetin kylpyamme” suljetuissa putkissa) | Korkean intensiteetin epäsuora sonikointi suljetuille astioille; erinomainen lämpötilan säätö ja kontaminaatiovapaa käsittely; edistää tehokasta aineensiirtoa ilman suoraa anturikontaktia. | Näytteiden käsittely erilaisissa näyteastioissa / herkät tai vaaralliset näytteet, jotka edellyttävät suljettuja astioita ja tasaista energianjakelua. |
| Laboratorion anturityyppiset Sonicators (suora sonikointi) | Maksimaalinen ultraäänen intensiteetti ja energiansiirto; nopea hajottaminen ja reaktion kiihdyttäminen; tehokas vaikeasti pilkkoutuville tai erittäin monimutkaisille proteiininäytteille. | Yhden näytteen käsittely, suuremmat näytteet tai haastavat matriisit, joissa tarvitaan maksimaalista tehoa ja nopeutta. |
Suunnittelu, valmistus ja konsultointi – Laatu valmistettu Saksassa
Hielscher-ultraääniastiat ovat tunnettuja korkeimmista laatu- ja suunnittelustandardeistaan. Kestävyys ja helppokäyttöisyys mahdollistavat ultraäänilaitteidemme sujuvan integroinnin teollisuuslaitoksiin. Hielscher-ultraäänilaitteet käsittelevät helposti karkeita olosuhteita ja vaativia ympäristöjä.
Hielscher Ultrasonics on ISO-sertifioitu yritys ja painottaa erityisesti korkean suorituskyvyn ultraäänilaitteita, joissa on huipputeknologia ja käyttäjäystävällisyys. Tietenkin, Hielscher-ultraäänilaitteet ovat CE-yhteensopivia ja täyttävät UL: n, CSA: n ja RoHs: n vaatimukset.
Usein Kysytyt Kysymykset
Mihin suodatinavusteista näytteenvalmistusta käytetään?
Suodatinavusteista näytteenvalmistusta (Filter-Aided Sample Preparation, FASP) käytetään proteiininäytteiden valmisteluun massaspektrometriaan perustuvaa proteomianalyysiä varten. Se mahdollistaa detergenttien, suolojen ja muiden pienimolekyylipainoisten epäpuhtauksien tehokkaan poistamisen, kun proteiinit jäävät molekyylipainoltaan rajatulle suodattimelle, jossa ne voidaan denaturoida, pelkistää, alkyloida ja pilkkoa entsymaattisesti peptideiksi, jotka soveltuvat LC-MS/MS-analyysiin.
Mitkä ovat FASP:n edut proteomiikan alalla?
FASP:n tärkeimmät edut proteomiikan alalla ovat sen kyky käsitellä monimutkaisia ja detergenttipitoisia näytteitä ja tuottaa samalla erittäin puhtaita peptidiseoksia, jotka ovat yhteensopivia massaspektrometrian kanssa. Se parantaa sulatuksen tehokkuutta ja toistettavuutta suorittamalla reaktiot suljetussa suodatusympäristössä, vähentää näytteiden hävikkiä saostukseen perustuviin menetelmiin verrattuna ja mahdollistaa tehokkaan puskurinvaihdon. Kaiken kaikkiaan FASP parantaa peptidien talteenottoa, datan laatua ja proteomin kattavuutta, mikä tekee siitä vankan ja laajalti hyväksytyn työnkulun alhaalta ylöspäin suuntautuvassa proteomikassa.
Kirjallisuus / Viitteet
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- Luís B. Carvalho, José-Luis Capelo-Martínez, Carlos Lodeiro, Jacek R. Wiśniewski, Hugo M. Santos (2020): Ultrasonic-Based Filter Aided Sample Preparation as the General Method to Sample Preparation in Proteomics. Analytical Chemistry 92, 13; 2020. 9164–9171.
- Hugo M. Santos, Luís B. Carvalho, Carlos Lodeiro, Gonçalo Martins, Inês L. Gomes, Wilson D.T. Antunes, Vanessa Correia, Maria M. Almeida-Santos, Helena Rebelo-de-Andrade, António P.A. Matos, J.L. Capelo (2023): How to dissect viral infections and their interplay with the host-proteome by immunoaffinity and mass spectrometry: A tutorial. Microchemical Journal, Volume 186, 2023.
- Walter, J., Monthoux, C., Fortes, C. et al. (2020): The bovine cumulus proteome is influenced by maturation condition and maturational competence of the oocyte. Scientific Reports 10, 9880 (2020).
Kosketukseton Sonicator UIP400MTP helpottaa FASP:n käyttöä 96 kuoppalevyissä.
Hielscher Ultrasonics valmistaa korkean suorituskyvyn ultraäänihomogenisaattoreita laboratorio jotta Teollisuuden koko.