Ultraääniavusteinen suodatinavusteinen näytteenvalmistelu (FASP): proteomiikan työnkulkujen tehostaminen edistyneellä ultraäänikäsittelyllä

Ultraääniavusteinen suodatinavusteinen näytteenvalmistelu (FASP) on nousemassa erittäin tehokkaaksi ja toistettavaksi menetelmäksi nykyaikaisessa proteomiikassa. Yhdistämällä hallitun ultraäänikäsittelyn menetelmän FASP vakiintuneisiin työnkulkuihin tutkijat voivat parantaa merkittävästi proteiinien uuttoa, pilkkomisen tehokkuutta ja tietojen kokonaislaatua. Suuren näytekapasiteetin ja toistettavan näytteenvalmistelun kysynnän kasvaessa kohdennettua ultraääntä käyttävien laitteiden, kuten mikrolevyjen ultraäänilaitteen UIP400MTP, tieteellinen ja käytännöllinen merkitys kasvaa.

Tieteellinen tausta: miksi FASP on tärkeä proteomiikassa

Suodatinavusteisesta näytteenvalmistelusta (FASP) on tullut bottom-up-proteomiikan kultainen standardi, koska sillä voidaan poistaa detergenttejä, suoloja ja muita epäpuhtauksia ja samalla mahdollistaa tehokas entsymaattinen pilkkominen. Perinteisiin FASP-protokolliin liittyy kuitenkin usein rajoituksia, jotka johtuvat epätäydellisestä lyysistä, epätasaisesta pilkkomisesta ja näytteiden vaihtelusta – etenkin käsiteltäessä monimutkaisia tai kestäviä biologisia soluja tai kudoksia.
Tässä kohdennettu ultraäänienergia (ultraäänikäsittely) tarjoaa ratkaisevan edun. Synnyttämällä mekaanisia leikkausvoimia ja kavitaatiota ultraäänikäsittely tehostaa useita FASP-työnkulun kriittisiä vaiheita vaarantamatta proteiinien eheyttä.

Ultraäänikäsittelyn myönteiset vaikutukset ultraääniavusteisessa FASP-menetelmässä

Ultraäänikäsittely synnyttää hallittua akustista kavitaatiota – mikroskooppisten kuplien muodostumista ja luhistumista – joka tuottaa paikallisia leikkausvoimia ja mikrovirtauksia.
Ultraäänikäsittely tehostaa sekä alkylointi- että pilkkomisvaihetta ultraääniavusteisessa FASP-menetelmässä parantamalla aineensiirtoa ja nopeuttamalla reaktiokinetiikkaa. Ultraäänienergian käyttö synnyttää kavitaatiota, joka aiheuttaa paikallisia mikrovirtauksia ja hetkellisiä leikkausvoimia. Ne edistävät nopeaa sekoittumista ja reagenssien tehokasta tunkeutumista proteiinimatriisiin tai suodatinympäristöön. Alkyloinnin aikana tämä johtaa kysteiinitähteiden tasaisempaan ja nopeampaan muokkautumiseen jodiasetamidin vaikutuksesta. Pilkkomisvaiheessa ultraäänikäsittely parantaa proteolyyttisten pilkkoutumiskohtien saavutettavuutta ja entsyymin ja substraatin välisiä vuorovaikutuksia, mikä nopeuttaa trypsiinin toimintaa ja tehostaa pilkkomista. Kaiken kaikkiaan ultraäänikäsittely lyhentää käsittelyaikaa ja samalla säilyttää tai parantaa reaktioiden täydellisyyttä ja toistettavuutta.

Proteomiikan näytteenvalmistelussa ultraääniavusteinen FASP tarkoittaa seuraavaa:

• Tehokkaampi solujen hajotus ja proteiinien uutto myös sitkeistä kudoksista tai mikrobinäytteistä
• Proteiinien tehostunut liukoistaminen
• Entsyymien parempi pääsy kohteisiinsa pilkkomisen aikana
• Lyhyempi käsittelyaika ja parempi toistettavuus

Toisin kuin perinteiset mekaaniset tai kemialliset lyysimenetelmät, ultraäänikäsittely on erittäin hyvin hallittavissa ja skaalattavissa, joten se soveltuu erityisen hyvin standardoituihin proteomiikan työnkulkuihin.

Ultraääniavusteisen FASP-menetelmän edut perinteisiin menetelmiin verrattuna

Ultraäänikäsittelyn sisällyttäminen FASP-protokolliin tarjoaa mitattavia etuja, jotka vaikuttavat suoraan myöhemmän massaspektrometrian tuloksiin.
Ultraääniavusteinen FASP mahdollistaa proteiinien täydellisemmän talteenoton erityisesti haastavista näytteistä, kuten kuituisista kudoksista tai biofilmeistä. Energian tasainen jakautuminen varmistaa rinnakkaisnäytteiden yhdenmukaisen käsittelyn ja vähentää vaihtelua – tämä on kvantitatiivisen proteomiikan olennainen vaatimus.
Lisäksi ultraäänikäsittely nopeuttaa pilkkomiskinetiikkaa parantamalla entsyymin ja substraatin välistä vuorovaikutusta. Tämä johtaa usein lyhyempiin pilkkomisaikoihin ja suurempaan peptidisaantoon sekvenssikattavuuden säilyessä.
Työnkulun näkökulmasta ultraäänijärjestelmät vähentävät manuaalisen työn tarvetta ja poistavat voimakkaiden kemiallisten käsittelyjen tarpeen, mikä säilyttää näytteiden eheyden ja helpottaa protokollien standardointia.

Venn-diagrammi, joka osoittaa ultraääniavusteisella FASP-menetelmällä tunnistettujen proteiinien määrän kasvun yön yli tehtävään FASP-käsittelyyn verrattuna
Kuva ja tutkimus: ©Carvalho et al., 2020

Protokolla: suuren näytekapasiteetin ultraääniavusteinen FASP laitteella UIP400MTP

Suuria näytejoukkoja käsittelevissä laboratorioissa mikrolevyjen ultraäänilaite UIP400MTP mahdollistaa vakiomallisten monikuoppalevyjen (esim. 96-kuoppalevyjen) samanaikaisen ultraäänikäsittelyn, mikä lisää merkittävästi näytekapasiteettia ja toistettavuutta.
Tässä muodossa näytteet (tyypillisesti 50–200 µL kuoppaa kohti) valmistellaan suoraan mikrolevyissä, jotka soveltuvat ultrasuodatukseen tai jatkokäsittelyyn. Lyysipuskurit ovat samankaltaisia kuin menetelmän FASP tavanomaisissa protokollissa käytettävät puskurit.

UIP400MTP kohdistaa tasaisesti ultraäänienergiaa kaikkiin kuoppiin. Ultraäänikäsittely tehdään tyypillisesti 60–80 %:n amplitudilla 2–4 minuutin ajan näytetyypistä riippuen. Seuraa lämpötilaa liitettävällä lämpötila-anturilla. Käytä pulssitettua ultraäänikäsittelyä ja halutessasi laboratoriojäähdytintä.

Esimerkkiprotokolla:

1. Alkylointivaiheessa näytteitä käsitellään mikrolevyjen ultraäänilaitteella (UIP400MTP) 40 %:n amplitudilla 7 jakson ajan (30 s PÄÄLLÄ, 15 s POIS; ultraäänikäsittelyn kokonaisaika: 5 min 45 s).
2. Ultraäänikäsittelyn jälkeen jodiasetamidiliuos (IAA) poistetaan sentrifugoimalla. Ennen trypsiinipilkkomista näytteet on pestävä jäljelle jääneen urean poistamiseksi. Urea on voimakas kaotrooppinen aine, joka estää entsymaattista aktiivisuutta. Siksi näytteet pestään kahdesti 200 μL:lla 25 mM ammoniumbikarbonaattia (AmBic).
3. Tämän jälkeen lisätään 100 μL trypsiiniliuosta (entsyymin ja proteiinin suhde 1:30), joka on valmistettu 12,5 mM ammoniumbikarbonaattiin. Proteiinit pilkotaan sitten laitteella UIP400MTP samoissa ultraäänikäsittelyolosuhteissa (40 %:n amplitudi, 7 jaksoa, 30 s PÄÄLLÄ / 15 s POIS; kokonaisaika: 5 min 45 s).
4. Ultraäänikäsittelyn jälkeen näytteet siirretään suodatinlevyille tai käsitellään levypohjaisilla FASP-järjestelmillä. Pelkistys- ja alkylointivaiheet tehdään levyllä, jolloin työnkulku pysyy sujuvana.
5. Trypsiinipilkkominen tehdään hallituissa olosuhteissa (esim. 37 °C, 4–16 tuntia), ja haluttaessa voidaan käyttää lyhyttä ultraäänistimulaatiota entsymaattisen aktiivisuuden nopeuttamiseksi ja peptidisaannon parantamiseksi.
6. Peptidit otetaan talteen sentrifugoimalla, minkä jälkeen ne ovat valmiita analysoitaviksi menetelmällä LC-MS/MS.

Tämän järjestelmän keskeinen etu on sen kyky tuottaa samanlaiset käsittelyolosuhteet kaikkiin kuoppiin, mikä minimoi erävaikutukset ja mahdollistaa luotettavat kvantitatiiviset vertailut laajoissa proteomiikkatutkimuksissa.

Suunnittelu, valmistus ja konsultointi – Saksassa valmistettua laatua

Hielscher-ultraäänilaitteet tunnetaan korkeimmista laatu- ja suunnittelustandardeistaan. Vankka rakenne ja helppokäyttöisyys mahdollistavat ultraäänilaitteidemme sujuvan integroinnin teollisuuslaitoksiin. Hielscher-ultraäänilaitteet selviytyvät helposti ankarista olosuhteista ja vaativista ympäristöistä.

Hielscher Ultrasonics on ISO-sertifioitu yritys, joka painottaa erityisesti suorituskykyisiä ultraäänilaitteita, joissa yhdistyvät huipputekniikka ja käyttäjäystävällisyys. Hielscher-ultraäänilaitteet ovat luonnollisesti CE-vaatimusten mukaisia ja täyttävät UL-, CSA- ja RoHs-vaatimukset.

Kirjallisuus / lähteet

FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• Luís B. Carvalho, José-Luis Capelo-Martínez, Carlos Lodeiro, Jacek R. Wiśniewski, Hugo M. Santos (2020): Ultrasonic-Based Filter Aided Sample Preparation as the General Method to Sample Preparation in Proteomics. Analytical Chemistry 92, 13; 2020. 9164–9171.
• Hugo M. Santos, Luís B. Carvalho, Carlos Lodeiro, Gonçalo Martins, Inês L. Gomes, Wilson D.T. Antunes, Vanessa Correia, Maria M. Almeida-Santos, Helena Rebelo-de-Andrade, António P.A. Matos, J.L. Capelo (2023): How to dissect viral infections and their interplay with the host-proteome by immunoaffinity and mass spectrometry: A tutorial. Microchemical Journal, Volume 186, 2023.
• Walter, J., Monthoux, C., Fortes, C. et al. (2020): The bovine cumulus proteome is influenced by maturation condition and maturational competence of the oocyte. Scientific Reports 10, 9880 (2020).