Proteomiikan protokolla: kosketukseton ultraäänikäsittely tehostaa peptidinäytteiden valmistelua massaspektrometriaan (MS)

Bottom-up-proteomiikasta on tullut nykyaikaisen biomarkkerien löytämisen, rakennebiologian ja kliinisen diagnostiikan kulmakivi. Pilkkomalla proteiinit peptideiksi ennen massaspektrometristä analyysiä (MS) tutkijat voivat saavuttaa paremman sekvenssikattavuuden ja luotettavamman kvantifioinnin. Koostumukseltaan erittäin monimutkaisten biologisten näytteiden valmistelu massaspektrometriaan (MS) on kuitenkin edelleen teknisesti vaativaa. Viimeaikaiset menetelmäkehityksen edistysaskeleet osoittavat, miten hallittu ultraäänikäsittely – erityisesti kosketuksettomalla usean putken ultraäänilaitteella VialTweeter ja mikrolevyultraäänilaitteella UIP400MTP – voi merkittävästi sujuvoittaa tätä työnkulkua, parantaa toistettavuutta ja ehkäistä yleisiä laitteiston pullonkauloja.
Tutustu yksityiskohtaiseen näytteiden valmisteluprotokollaan, jolla saadaan massaspektrometriseen analyysiin (MS) sopivan kokoisia peptidejä.

Keiden kannattaa käyttää kosketuksetonta ultraäänikäsittelyä peptidinäytteiden valmistelussa?

• Bottom-up-proteomiikan ja uusien löydösten tutkimuslaboratoriot: Tutkijat, jotka valmistelevat koostumukseltaan erittäin monimutkaisia näytteitä menetelmiä LC-MS tai MALDI käyttäviin työnkulkuihin ja tarvitsevat tasaisen, suuren peptidisaannon erilaisista biologisista matriiseista.
• S-Trap™- ja suspension trapping -menetelmän käyttäjät: Ryhmät, jotka käyttävät mikrokolonneihin perustuvaa puhdistusta ja tarvitsevat hallittua DNA:n katkomista leikkausvoimilla kolonnien tukkeutumisen ehkäisemiseksi sekä näytteiden sujuvan latauksen ja pilkkomisen varmistamiseksi.
• Kliinisen ja translationaalisen tutkimuksen ryhmät: Laboratoriot, jotka käsittelevät kudosta, soluja, plasmaa, seerumia tai aivo-selkäydinnestettä ja joissa erien välinen toistettavuus ja näytteiden eheys ovat kriittisiä.
• Kvantitatiivisen ja kohdennetun massaspektrometrian (MS) ryhmät: Laboratoriot, jotka tekevät tarkkoja vertailevia tutkimuksia ja joissa anturilla varustetut ultraäänilaitteet aiheuttavat ristikontaminaation riskejä, jotka voivat vaarantaa pieninä pitoisuuksina esiintyvien peptidien kvantifioinnin.
• Yhteiskäyttölaboratoriot ja suuren näytekapasiteetin toiminnot: Ryhmät, jotka käsittelevät samanaikaisesti useita biologisia rinnakkaisnäytteitä ja hyötyvät laitteella VialTweeter tehtävästä usean suljetun putken lohkotyyppisestä ultraäänikäsittelystä, joka poistaa anturin puhdistustarpeen, vähentää aktiivisen työskentelyn aikaa ja ylläpitää aseptisia olosuhteita.
• Translaationjälkeisten muokkausten ja proteiinirakenteiden tutkijat: Tutkijat, jotka tarvitsevat hellävaraista, lämpötilaltaan hallittua käsittelyä epävakaiden muokkausten säilyttämiseksi ja sekvenssikattavuuden maksimoimiseksi solulyysin ja homogenoinnin aikana.

Protokollan yleiskuvaus: kudoksista ja soluista massaspektrometriaan (MS) valmiiksi peptideiksi

Wojtkiewiczin ym. kuvaama, laajasti käytetty bottom-up-proteomiikan työnkulku tarjoaa vankan ja skaalautuvan menetelmän peptidinäytteiden valmisteluun erilaisista biologisista matriiseista. Protokollan lähtömateriaalina on 50–100 mg pikajäädytettyä kudosta tai 1–20 miljoonaa solua, ja siinä käytetään suspension trapping -tekniikkaa (S-Trap™) detergenttien, suolojen ja kontaminanttien tehokkaaseen poistamiseen ennen entsymaattista pilkkomista.
Lyysin, proteiinien kvantifioinnin, pelkistyksen ja alkyloinnin jälkeen näyte happamoidaan ja ladataan sentrifugointikolonniin S-Trap™, jossa tapahtuu entsymaattinen pilkkominen yhdistelmällä trypsin/lysC. Syntyvät peptidit eluoidaan, kuivataan ja analysoidaan menetelmällä LC-MS. Kun tätä työnkulkua sovelletaan 50 mg:aan ihmisen sydänkudosta, saadaan johdonmukaisesti riittävästi peptidejä 30–40 injektioon ja tunnistetaan yli 4 000 erillistä proteiinia ajoa kohti. Vaikka kemialliset vaiheet ja kolonnipohjainen puhdistus on määritelty tarkasti, prosessin onnistuminen riippuu suuresti alkuvaiheen fysikaalisesta hajotuksesta ja vaiheista, joissa käsitellään DNA.
Protokollassa suositellaan usean putken ultraäänilaitteen VialTweeter käyttöä ultraäänikäsittelyyn, jossa solut hajotetaan ja DNA katkotaan leikkausvoimilla – molemmat vaiheet ovat kriittisiä peptidianalyysille.

Solujen ja kudosten ultraäänilyysi proteiinien uuttamiseksi

Bottom-up-proteomiikan työnkulussa ultraäänikäsittely on keskeinen vaihe solunäytteiden lyysissä, jolla uutetaan proteiinit myöhempää massaspektrometristä analyysiä varten. Kun solupellettiin on lisätty solulyysipuskuri, joka sisältää SDS, näytteet ultraäänikäsitellään usean putken ultraäänilaitteella VialTweeter. Protokollassa käytetään 1,5 mL:n mikrosentrifugiputkia ja määritellään ultraäänilaitteen käyttö 30 %:n teholla siten, että laite on 10 sekuntia päällä ja 10 sekuntia pois päältä, yhteensä 3 syklin ajan. 1 minuutin odotuksen jälkeen sykli toistetaan vielä kaksi kertaa. Näytteitä jäähdytetään jatkuvasti jäällä.
Tämä prosessi paitsi auttaa solujen hajotuksessa myös on erityisesti tarpeen, jotta lyysissä vapautuva genominen DNA saadaan katkottua leikkausvoimilla. On ratkaisevan tärkeää, että DNA katkotaan tehokkaasti leikkausvoimilla näytteen viskositeetin vähentämiseksi ja kolonnien S-Trap™ tukkeutumisen ehkäisemiseksi, mikä varmistaa optimaalisen proteiinisaannon ja luotettavan myöhemmän pilkkomisen peptideiksi.

DNA:n ultraäänellä tapahtuvan katkomisen kriittinen merkitys

Yksi S-Trap™-pohjaisten työnkulkujen yleisimmistä ongelmista on kolonnin tukkeutuminen, jonka aiheuttaa lähes yksinomaan solujen tai kudosten homogenoinnissa vapautuva suuren molekyylipainon genominen DNA. Ehjä DNA lisää huomattavasti näytteen viskositeettia, vangitsee peptidejä ja tukkii mikrohuokoisen S-Trap™-sorbenttipedin.
Ultraäänikäsittely ratkaisee tämän ongelman pilkkomalla DNA:n mekaanisesti pieniksi, liukoisiksi fragmenteiksi. Hallitun akustisen energian avulla VialTweeter katkoo nukleiinihappoja tehokkaasti leikkausvoimilla tuottamatta liiallista lämpöä tai lisäämättä vieraita kontaminantteja. Tämä viskositeetin väheneminen varmistaa näytteen sujuvan latauksen, tasaiset läpivirtauksen tilavuusvirrat ja keskeytymättömän pilkkomiskinetiikan.

Optimoidut ultraäänikäsittelyn parametrit laitteelle VialTweeter

Protokollassa määritellään erittäin toistettava ultraäänikäsittelyohjelma, joka on optimoitu biologisten näytteiden eheyden ja myöhemmän massaspektrometrisen analyysin (MS) kanssa yhteensopivuuden kannalta. Kun 1,5 mL:n mikrosentrifugiputkissa olevia näytteitä käsitellään kosketuksettomalla lohkotyyppisellä ultraäänilaitteella Hielscher VialTweeter, seuraavat parametrit mahdollistavat lyysin ja sen, että DNA katkotaan optimaalisesti leikkausvoimilla proteiinien rakenne säilyttäen:

• Amplitudi: 30 %:n teho
• Syklimalli: 10 sekuntia PÄÄLLÄ / 10 sekuntia POIS PÄÄLTÄ
• Kesto: 3 sykliä (10 s PÄÄLLÄ / 10 s POIS PÄÄLTÄ) → 1 minuutin tauko jäällä → toista vielä 2 kertaa
• Lämpötilan hallinta: näytteet asetetaan jäälle käsittelyn ajaksi lämpödenaturaation ja ennenaikaisen entsymaattisen aktiivisuuden ehkäisemiseksi

Tämä pulssitettu ultraäänikäsittely estää paikallisen ylikuumenemisen, minimoi peptidien hapettumisen ja varmistaa tasaisen akustisen altistuksen kaikissa näytepulloissa. Suljettuihin putkiin perustuva järjestely poistaa myös tarpeen puhdistaa anturi näytteiden välillä ja vähentää siten huomattavasti aktiivisen työskentelyn aikaa sekä käyttäjästä johtuvaa vaihtelua.

Keskeiset edut nykyaikaisissa proteomiikan työnkuluissa

VialTweeter-laitteen sisällyttäminen bottom-up-proteomiikan prosessiisi tarjoaa useita toiminnallisia ja tieteellisiä etuja:

1. Tasainen DNA:n fragmentointi: Akustisen energian tasainen siirtyminen kaikkiin näytepulloihin varmistaa viskositeetin toistettavan vähenemisen ja ehkäisee erien välistä vaihtelua S-Trap™-latauksessa.
2. Epävakaiden muokkausten säilyttäminen: Käsittely matalassa lämpötilassa jäähauteessa suojaa translaationjälkeisiä muokkauksia (PTM) ja estää lämmön aiheuttaman proteiinien aggregaation solulyysin aikana.
3. Sujuvammat jatkokäsittelyvaiheet: Laitteella VialTweeter käsitellyt lysaatit voidaan suoraan kirkastaa sentrifugoimalla ja kvantifioida ilman lisäpuhdistusvaiheita, mikä nopeuttaa etenemistä menetelmällä S-Trap™ tehtävään pilkkomiseen.
4. Skaalautuvuus ja joustavuus: Samat ultraäänikäsittelyn asetukset soveltuvat sekä koostumukseltaan erittäin monimutkaisiin kudosnäytteisiin että solususpensioihin ja tukevat uusien löydösten proteomiikan, kohdennetun kvantifioinnin ja glykoproteomiikan työnkulkuja. Valmistajan Hielscher mikrolevyultraäänilaitteilla käsittely voidaan helposti skaalata suuriin näytemääriin monikuoppalevyillä.

Kirjallisuus / Viitteet

• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
• Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
• Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.