Proteomiikan protokolla: Kosketukseton ultraäänikäsittely tehostaa peptidinäytteiden valmistelua massaspektrometriaa varten
Alhaalta ylöspäin -proteomiikka on noussut nykyaikaisen biomarkkerien löytämisen, rakennebiologian ja kliinisen diagnostiikan kulmakiveksi. Pilkkomalla proteiinit peptideiksi ennen massaspektrometria-analyysiä (MS) tutkijat voivat saavuttaa kattavamman sekvenssikattavuuden ja luotettavamman kvantifioinnin. Erittäin monimutkaisten biologisten näytteiden valmistelu MS-analyysiä varten on kuitenkin edelleen teknisesti vaativaa. Viimeaikaiset menetelmälliset edistysaskeleet korostavat, kuinka hallittu ultraäänikäsittely – erityisesti kosketuksettoman VialTweeter Multi-Tube -ultraäänilaitteen ja UIP400MTP-mikrolevyultraäänilaitteen kanssa – voi merkittävästi tehostaa tätä työnkulkua, parantaa toistettavuutta ja estää laitteistossa yleisesti esiintyviä pullonkauloja.
Täältä löydät yksityiskohtaisen näytteenvalmistusohjeen, jonka avulla voit saada sopivan kokoisia peptidejä MS-analyysia varten.
Kenelle kosketukseton ultraäänikäsittely sopii peptidinäytteiden valmisteluun?
- Alhaalta ylöspäin -proteomiikka & Discovery Labs: Tutkijat, jotka valmistelevat erittäin monimutkaisia näytteitä LC-MS- tai MALDI-analyysiprosesseja varten ja jotka tarvitsevat tasalaatuista, korkean saannon peptidien talteenottoa erilaisista biologisista matriiseista.
- S-Trap™ & Jousitus, joka estää käyttäjien liikkumisen: Ryhmät, jotka käyttävät mikrokolonnipuhdistusta ja jotka tarvitsevat hallittua DNA:n pilkkomista kolonnin tukkeutumisen estämiseksi sekä näytteen sujuvan lataamisen ja pilkkomisen varmistamiseksi.
- kliininen & Kliinisen tutkimuksen ryhmät: Laboratoriot, joissa käsitellään kudoksia, soluja, plasmaa, seerumia tai aivo-selkäydinnestettä ja joissa erien välinen toistettavuus ja näytteiden eheys ovat ratkaisevan tärkeitä.
- Määrällinen & Kohderyhmänä olevat MS Teams -ryhmät: Laboratoriot, joissa tehdään tarkkoja vertailututkimuksia ja joissa uudelleenkäytettävät ultraäänilaitteet aiheuttavat ristikontaminaatioriskejä, jotka voivat vaarantaa harvinaisten peptidien pitoisuuksien määrittämisen.
- Yhteiset tilat & Suurikapasiteettiset toiminnot: Ryhmät, jotka käsittelevät useita biologisia toistokappaleita samanaikaisesti ja jotka hyötyvät VialTweeter-laitteen avulla toteutettavasta suljetun putken moniputkiblokkisonikaatiosta, joka poistaa anturin puhdistustarpeen, lyhentää käsin suoritettavaa työtä ja ylläpitää aseptisia olosuhteita.
- Vanhempien ja opettajien tapaaminen & Rakenteellisten proteiinien tutkijat: Tutkijat, jotka tarvitsevat hellävaraista, lämpötilasäädeltyä käsittelyä epästabiilien muutosten säilyttämiseksi ja sekvenssikattavuuden maksimoimiseksi solujen hajotuksen ja homogenisoinnin aikana.
Moninäyteinen sonikaattori “VialTweeter” useiden suljettujen pullojen kosketuksettomaan näytteenvalmistukseen proteomiikkaa varten
Protokollan yleiskatsaus: Kudoksista ja soluista MS-analyysiin soveltuviin peptideihin
Wojtkiewiczin ym. esittelemä, laajalti käyttöön otettu alhaalta ylöspäin suuntautuva proteomiikan työnkulku tarjoaa luotettavan ja skaalautuvan menetelmän peptidinäytteiden valmistamiseksi erilaisista biologisista matriiseista. Menetelmä alkaa 50–100 mg:n määrällä pikajäädytettyä kudosta tai 1–20 miljoonalla solulla, ja siinä hyödynnetään suspensiokäsittelytekniikkaa (S-Trap™) detergenttien, suolojen ja epäpuhtauksien tehokkaaseen poistamiseen ennen entsymaattista pilkkomista.
Lysysoinnin, proteiinimäärityksen, pelkistyksen ja alkyloinnin jälkeen näyte happamoitetaan ja ladataan S-Trap™-sentrifugipylvääseen, jossa suoritetaan trypsiini/lysC-pilkkominen. Tuloksena syntyneet peptidit eluoidaan, kuivataan ja analysoidaan LC-MS-menetelmällä. Kun tätä työnkulkua sovelletaan 50 mg:aan ihmisen sydänkudosta, se tuottaa johdonmukaisesti riittävästi peptidejä 30–40 injektioon, jolloin tunnistetaan yli 4 000 ainutlaatuista proteiinia per ajo. Vaikka kemia ja kolonnipohjainen puhdistus ovat tarkasti määriteltyjä, prosessin onnistuminen riippuu suuresti alkuvaiheen fyysisestä hajottamisesta ja DNA:n käsittelyvaiheista.
Ohjeessa suositellaan VialTweeter Multi-Tube Sonicator -laitetta solujen hajottamiseen ultraäänikäsittelyllä ja DNA:n pilkkomiseen – Molemmat vaiheet ovat ratkaisevan tärkeitä peptidianalyysissä.
VialTweeter käsittelee ultraäänellä suljettuja 1,0, 1,5 ja 2,0 ml:n Eppendorf-putkia sekä erilaisia NUNC-pulloja
Proteiinien uuttamiseen tarkoitettu ultraäänipohjainen solujen ja kudosten hajotus
Bottom-up-proteomiikan työnkulussa ultraäänikäsittely on keskeinen vaihe solunäytteiden hajottamisessa proteiinien erottamiseksi myöhempää massaspektrometrianalyysiä varten. Kun SDS-solunhajotuspuskuria on lisätty solupellettiin, näytteet käsitellään ultraäänellä VialTweeter Multi-Tube Sonicator -laitteella. Menetelmässä käytetään 1,5 ml:n mikrofuugiputkia, ja siinä määritetään, että ultraäänikäsittelylaitetta käytetään 30 %:n teholla 10 sekuntia päällä ja 10 sekuntia pois päältä, ja tätä toistetaan 3 syklin ajan. Yhden minuutin odottelun jälkeen sykliä toistetaan vielä kaksi kertaa. Näytteitä jäähdytetään jatkuvasti jäällä.
Tämä prosessi ei ainoastaan edistä solujen hajoamista, vaan se on nimenomaan välttämätöntä lysaation aikana vapautuvan genomisen DNA:n pilkkomiseksi. Tehokas DNA:n pilkkominen on ratkaisevan tärkeää näytteen viskositeetin vähentämiseksi ja S-Trap™-kolonnien tukkeutumisen estämiseksi, mikä puolestaan takaa optimaalisen proteiinin talteenoton ja luotettavan peptidien pilkkomisen jatkokäsittelyssä.
Ultraäänellä tapahtuvan DNA:n pilkkomisen ratkaiseva merkitys
Yksi S-Trap™-pohjaisten työnkulkujen yleisimmistä ongelmista on kolonnin tukkeutuminen, joka johtuu lähes yksinomaan solujen tai kudosten homogenisoinnin aikana vapautuvasta suurimolekyylipainoisesta genomisen DNA:sta. Ehjä DNA nostaa näytteen viskositeettia huomattavasti, sitoo peptidejä ja tukkii mikrohuokoisen S-Trap™-sorbointikerroksen.
Ultraäänikäsittely ratkaisee tämän ongelman hajottamalla DNA:n mekaanisesti pieniksi, liukoisiksi palasiksi. VialTweeter leikkaa nukleiinihappoja tehokkaasti hallitulla akustisella energialla ilman, että syntyy liikaa lämpöä tai että näytteeseen pääsee vieraita epäpuhtauksia. Tämä viskositeetin aleneminen takaa sujuvan näytteen syöttämisen, tasaiset virtausnopeudet ja keskeytyksettömän pilkkomisprosessin.
Optimoidut VialTweeter-ultraäänikäsittelyparametrit
Menetelmäkuvauksessa määritellään erittäin toistettavissa oleva ultraäänikäsittelyohjelma, joka on optimoitu biologisten näytteiden eheyden säilyttämiseksi ja myöhemmän massaspektrometrianalyysin yhteensopivuuden varmistamiseksi. Kun näytteet ovat 1,5 ml:n mikrotsentrifugiputkissa ja käytetään Hielscher VialTweeter -kosketuksetonta lohko-ultraäänilaitetta, seuraavat parametrit takaavat solujen hajoamisen ja optimaalisen DNA:n katkeamisen säilyttäen samalla proteiinien rakenteen:
- Amplitudi: 30 % tehoa
- Toimintakierto: 10 sekuntia päällä / 10 sekuntia pois päältä
- Kesto: 3 jaksoa (10 sekuntia päällä / 10 sekuntia pois päältä) → 1 minuutin lepo jäällä → toista vielä 2 kertaa
- Lämpötilan hallinta: Näytteet asetetaan jään päälle käsittelyn ajaksi, jotta vältetään lämpödenaturaatio ja entsyymien ennenaikainen aktivoituminen
Tämä pulssipohjainen ultraäänikäsittelymenetelmä estää paikallisen ylikuumenemisen, minimoi peptidien hapettumisen ja takaa tasaisen ultraäänialtistuksen kaikissa pulloissa. Suljetun putken rakenne poistaa myös tarpeen puhdistaa anturi näytteiden välillä, mikä lyhentää merkittävästi käsin suoritettavaa aikaa ja vähentää käyttäjästä johtuvia vaihteluita.
Nykyaikaisten proteomiikan työnkulkujen tärkeimmät edut
VialTweeterin integroiminen bottom-up-proteomiikan prosessiketjuun tarjoaa useita käytännön ja tieteellisiä etuja:
- Jatkuva DNA:n pirstoutuminen: Akustisen energian tasainen jakautuminen kaikkiin pulloihin takaa toistettavan viskositeetin alenemisen ja estää eräkohtaiset vaihtelut S-Trap™-laitteen täyttämisessä.
- Labiilien modifikaatioiden säilyttäminen: Jäähauteessa suoritettava matalalämpötilakäsittely suojaa translaation jälkeisiä modifikaatioita (PTM) ja estää lämmön aiheuttaman proteiinien aggregaation solujen hajotuksen aikana.
- Tehostettu jatkokäsittely: VialTweeter-menetelmällä käsitellyt lysaatit voidaan kirkastaa suoraan sentrifugoimalla ja määrittää pitoisuudeltaan ilman ylimääräisiä puhdistusvaiheita, mikä nopeuttaa siirtymistä S-Trap™-pilkkomiseen.
- skaalautuvuus & Joustavuus: Samat ultraäänikäsittelyasetukset soveltuvat sekä erittäin monimutkaisiin kudosnäytteisiin että solususpensioihin, mikä tukee proteomiikan tutkimusta, kohdennettua kvantifiointia ja glykoproteomiikan työnkulkuja. Hielscherin mikrolevy-ultraäänilaitteilla voidaan helposti laajentaa käsittelyä suuriin näytemääriin monikuoppalevyissä.
Kosketuksetonta Multi-Tube Sonicator VialTweeter -laitetta voidaan käyttää kylmäkaapeissa
Ultraäänilaitteet proteomiikan näytteiden valmisteluun
Laadukkaiden peptidinäytteiden valmistelu massaspektrometriaa varten vaatii muutakin kuin tehokasta solujen hajottamista – Se edellyttää tarkkaa hallintaa DNA:n katkaisussa, lämpötilassa ja kontaminaation ehkäisyssä. Ottamalla Hielscher VialTweeterin osaksi bottom-up-proteomiikan työnkulkuasi voit estää S-Trap™-suodattimen tukkeutumisen, varmistaa toistettavan proteiinien talteenoton ja ylläpitää herkille MS-analyyseille vaadittavaa puhtautta. Käsittelitpä sitten ihmiskudosta, viljeltyjä soluja tai monimutkaisia lysaatteja, ultraääniblokkikäsittely tarjoaa luotettavuuden, skaalautuvuuden ja prosessin hallinnan, joita nykyaikaiset proteomiikkalaboratoriot vaativat.
Jos haluat laajentaa tuotantoa suurempiin näytemääriin, hyödynnä Hielscherin kohdennettuja, kosketuksettomia mikrolevy-ultraäänikäsittelylaitteita, malleja UIP400MTP ja UIP550MTP! Käsittele mitä tahansa vakiomuotoista monikuoppalevyä suurikapasiteettiseen proteomiikkaan!
Suljetun putken käsittelymenetelmä verrattuna perinteisiin koettimellisiin ultraäänikäsittelylaitteisiin
Aiemmin tutkijat ovat käyttäneet DNA:n pilkkomiseen suorakontaktisia anturipohjaisia ultraäänilaitteita. Vaikka nämä järjestelmät ovat tehokkaita, ne aiheuttavat useita merkittäviä rajoituksia proteomiikan työnkulkuissa:
- Ristikontaminaation riski: Saman koettimen käyttö useissa näytteissä aiheuttaa aerosolin siirtymistä ja tuo mukanaan ristikontaminaatioita, jotka vääristävät kvantitatiivisia MS-tuloksia.
- Näytteen menetys: Suora lisäys voi aiheuttaa roiskumista, haihtumista ja arvokkaiden peptidien tarttumista koettimen pintaan.
- Puhdistus: Koettimien perusteellinen puhdistaminen mittausten välillä on aikaa vievää ja usein puutteellista, mikä vaarantaa harvinaisten proteiinien tutkimukset.
VialTweeter-lohko-ultraäänikäsittelylaite käsittelee näytteet kokonaan suljetuissa mikrotsentrifugiputkissa. Tämä suljetun järjestelmän rakenne eliminoi anturin ja näytteen välisen kosketuksen, estää aerosolien muodostumisen ja ylläpitää tiukkoja aseptisia olosuhteita koko homogenisoinnin ja solujen hajottamisen ajan. Laboratorioille, jotka käsittelevät erittäin monimutkaisia kudoslysaatteja tai useita solulinjoja, tämä tarkoittaa puhtaampia MS-tietoja, parempaa peptidien talteenottoa ja luotettavampia biologisia replikaatteja.
Siirtyminen suurikapasiteettiseen näytteiden valmisteluun monikuoppalevyillä
Mikrolevy-ultraäänikäsittelylaitteiden mallit UIP400MTP ja UIP550MTP, putkien käsittely voidaan helposti laajentaa suurikapasiteettiseksi näytteiden käsittelyksi missä tahansa tavallisessa monikuoppalevyssä.
Multi-well-levyn sonikaattori UIP400MTP korkean läpimenon proteiinien uuttamiseen näytteistä
Usein kysyttyjä kysymyksiä ultraäänikäsittelystä peptidinäytteiden valmistuksessa
Miksi ultraäänikäsittely on tarpeen ennen S-Trap™-peptidien käsittelyä?
Ultraäänikäsittely on välttämätöntä solujen tai kudosten hajotuksen yhteydessä vapautuvan suurimolekyylipainoisen genomisen DNA:n pilkkomiseksi. Ehjä DNA nostaa näytteen viskositeettia huomattavasti, mikä voi tukkia S-Trap™-mikropylvään ja sitoa peptidejä, mikä puolestaan heikentää merkittävästi saantoa ja MS-yhteensopivuutta.
Miten VialTweeter-lohko-ultraäänilaite parantaa näytteiden valmistelua verrattuna perinteisiin anturipohjaisiin ultraäänilaitteisiin?
Toisin kuin suorakosketusanturilla varustetut ultraäänikäsittelylaitteet, jotka vaativat huolellista puhdistusta käyttökertojen välillä ja joissa on aerosolien siirtymisen riski, VialTweeter käsittelee näytteet kokonaan suljetuissa pulloissa ja mikrotsentrifugiputkissa. Tämä suljettu putkirakenne eliminoi ristikontaminaation, estää näytteen menetyksen ja ylläpitää tiukkoja aseptisia olosuhteita koko homogenisoinnin ja solujen hajottamisen ajan.
Mitkä ovat optimaaliset ultraäänikäsittelyparametrit proteomiikan näytteiden valmistelussa?
Solujen ja kudosten kaltaisten biologisten näytteiden osalta suositellussa menettelytavassa käytetään VialTweeter-ultraäänikäsittelylaitetta 30 %:n teholla 10 sekunnin päällä / 10 sekunnin pois päältä -syklillä, jota toistetaan 3 kertaa. Näytteet on pidettävä jäällä käsittelyn aikana, ja sykliä on toistettava vielä kaksi kertaa, jos käsiteltävien solujen määrä on ≥5 miljoonaa. (ks. Wojtkiewicz et al., 2021)
Mitä minun pitäisi tehdä, jos S-Trap™-kolonni tukkeutuu näytteen lataamisen aikana?
Kolonnin tukkeutuminen johtuu tyypillisesti DNA:n korkeasta viskositeetista tai riittämättömästä selkeyttämisestä. Tämän korjaamiseksi sentrifugoi lysaatti huolellisesti ennen pipetointia ja varmista, että DNA on hajotettu riittävästi ultraäänikäsittelyllä.
Miten kosketukseton ultraäänikäsittely hyödyttää kvantitatiivisen proteomiikan työnkulkuja?
Määrällisissä tutkimuksissa jopa vähäinen ristikontaminaatio näytteiden välillä voi vääristää harvinaisten peptidien mittaustuloksia. VialTweeterin suljetun putken ja usean näytepullon käsittelymenetelmä poistaa koettimen käyttöä, takaa erien välisen toistettavuuden ja säilyttää näytteiden eheyden tarkkoja vertailuanalyysejä varten.
Minkälaista proteiinisaantoa ja MS-erottelukykyä voin odottaa tältä menetelmältä?
Kun lähtöaineena käytetään 50 mg ihmisen sydänkudosta tai 5 miljoonaa solua, S-Trap™-menetelmällä saadaan tyypillisesti riittävä määrä peptidejä 30–50 LC-MS-injektioon, ja menetelmällä tunnistetaan johdonmukaisesti yli 4 000 ainutlaatuista proteiinia kutakin ajoa kohti. (ks. Wojtkiewicz ym., 2021)
Kirjallisuus / Viitteet
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
- Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
- Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.
Hielscher Ultrasonics toimittaa tehokkaita kosketuksettomia ultraäänilaitteita näytteiden valmisteluun ja kliiniseen analyysiin. Monikuoppalevyn ultraäänilaite UIP400MTP, VialTweeter, CupHorn ja GDmini2-virtausultraäänilaite käsittelevät näytteitä niitä koskettamatta.