Mikrolevyjen ultraäänikäsittely shotgun-proteomiikassa – sovellusohje

Shotgun-proteomiikka edellyttää tehokasta ja toistettavaa näytteiden valmistelua, jotta monimutkaisesta biologisesta materiaalista saadaan peptidejä, jotka soveltuvat analysoitaviksi menetelmällä LC-MS/MS. Mikrolevyjen ultraäänilaite UIP400MTP tukee tätä prosessia mahdollistamalla pienitilavuuksisten näytteiden standardoidun rinnakkaisen ultraäänikäsittelyn ja auttaa laboratorioita parantamaan hajotusta, uuttoa ja uudelleenliuotusta mikrolevypohjaisissa työnkuluissa. Tässä sovellusohjeessa kuvataan, miten UIP400MTP voidaan liittää proteomiikan näytteiden valmisteluun. Laboratoriossa testattuna esimerkkinä käytetään julkaistua solunulkoisten vesikkelien työnkulkua PLA2G12A/Th17 tutkimuksista.

Mikrolevyjen ultraäänikäsittely shotgun-proteomiikan toistettavuuden parantamiseksi

Proteomiikan tutkijoille toistettava näytteiden valmistelu on ratkaisevan tärkeää laadukkaan datan saamiseksi menetelmällä LC-MS/MS. Mikrolevyjen ultraäänilaite UIP400MTP tukee standardoitua rinnakkaista ultraäänikäsittelyä levypohjaisissa työnkuluissa sekä pienitilavuuksisten näytteiden suuren käsittelykapasiteetin työnkuluissa.

Se on erityisen hyödyllinen laboratorioille, jotka käsittelevät seuraavia:

• Suuret näytesarjat, jotka edellyttävät yhdenmukaista käsittelyä lukuisissa kuopissa
• Materiaalit, joiden lähtömäärä on pieni ja joiden näytehävikki ja vaihtelu on minimoitava
• Runsaasti lipidejä sisältävät näytteet, kuten solunulkoiset vesikkelit
• Monimutkaiset biologiset valmisteet, jotka edellyttävät tehokasta hajotusta, uuttoa tai uudelleenliuotusta
• Vertaileva shotgun-proteomiikka, jossa toistettavuus eri olosuhteiden ja rinnakkaisnäytteiden välillä on olennaista

Sisällyttämällä mikrolevyjen ultraäänikäsittelyn ennen pilkkomista tutkijat voivat parantaa näytteiden valmiutta seuraaviin vaiheisiin:

• Proteiinien uutto ja uudelleenliuotus
• Pilkkominen trypsiinillä/Lys-C:llä
• Tiedonkeruu menetelmällä Nano-LC/MS/MS
• Kvantitatiivinen proteomiikka-analyysi myöhemmissä vaiheissa

Mikrolevyjen ultraäänikäsittelystä voivat hyötyä:

• Proteomiikan keskitetyt tutkimuspalveluyksiköt
• EV-tutkimuslaboratoriot
• Immunologian ja solubiologian laboratoriot
• Translationaaliset tutkimusryhmät
• Biotieteiden ryhmät, jotka siirtyvät yksittäisten näytteiden valmistelusta suuremman käsittelykapasiteetin työnkulkuihin

Suuren käsittelykapasiteetin näytteiden valmistelu solunulkoisten vesikkelien proteomianalyysiin

Mitä shotgun-proteomiikka on?

Shotgun-proteomiikasta on tullut keskeinen analyyttinen lähestymistapa monimutkaisten biologisten näytteiden karakterisointiin. Näytteet ulottuvat kokonaissolulysaateista ja kudosuutteista puhdistettuihin soluelimiin, solunulkoisiin vesikkeleihin ja kliinisiin näytteisiin, joiden lähtömäärä on pieni. Sen keskeinen vahvuus on proteiinien pilkkomisen, korkean erotuskyvyn nestekromatografia-tandemmassaspektrometrian ja laskennallisen, peptideistä proteiineihin etenevän päättelyn yhdistäminen. Lopullisen proteomiaineiston laatu määräytyy kuitenkin kauan ennen kuin näyte saavuttaa massaspektrometrin. Tehokas näytteiden hajotus, proteiinien liuotus, häiritsevien aineiden poisto, toistettava entsymaattinen pilkkominen ja luotettava peptidien talteenotto ovat kaikki ratkaisevia proteomin kattavuuden ja kvantitatiivisen luotettavuuden kannalta.
Proteomiikan tutkijoille ja biotieteiden laboratorioille, jotka käsittelevät rajallisia tai arvokkaita näytteitä, näytteiden valmistelu on usein pullonkaula.

Solunulkoisten vesikkelien haasteet proteomiikassa

Esimerkiksi solunulkoiset vesikkelit (EV) muodostavat erityisen vaativan näyteluokan. Ne ovat kalvon ympäröimiä, runsaasti lipidejä sisältäviä nanokokoluokan hiukkasia, joiden proteiinisaanto on suhteellisen pieni ja joihin liittyy suuri lipidien, suolojen, detergenttien, seerumin proteiinien ja muiden matriisikomponenttien siirtymisriski myöhempiin vaiheisiin. Nämä ominaisuudet voivat häiritä pilkkomistehokkuutta, kromatografista suorituskykyä, sähkösumutuksen vakautta ja peptidien tunnistamista. Solunulkoisten vesikkelien proteomiikan valmistelutyönkulun on siksi oltava riittävän tehokas hajottamaan vesikkelirakenteet ja liuottamaan niiden kuljettamat proteiinit, mutta samalla sen on sovelluttava myöhempään entsymaattiseen pilkkomiseen ja analyysiin menetelmällä LC-MS/MS.
Tässä yhteydessä mikrolevyille soveltuva ultraäänikäsittely tarjoaa käytännöllisen lähestymistavan toistettavaan rinnakkaiseen näytteiden käsittelyyn. Hielscherin mikrolevyjen ultraäänilaitemallit UIP400MTP (400 W) ja UIP550MTP (550 W) on suunniteltu monikuoppalevyissä ja pienitilavuuksisissa astioissa olevien näytteiden ultraäänikäsittelyyn, ja ne tukevat suuremman käsittelykapasiteetin työnkulkuja kuin tavanomaiset yhden anturin ultraäänilaitteet. Proteomiikan laboratorioille tämä toteutustapa on houkutteleva, koska se voi vähentää manuaalisesta työstä aiheutuvaa vaihtelua, parantaa useiden näytteiden rinnakkaista käsittelyä ja liittyä luontevammin levypohjaisiin näytteiden valmisteluketjuihin.

Esimerkkityönkulku

Tuore solunulkoisten vesikkelien proteomiikan työnkulku, jossa tarkastellaan PLA2G12A:n ohjaamaa Th17-solubiologiaa, tarjoaa hyödyllisen, laboratoriossa testatun esimerkin siitä, miten mikrolevyjen ultraäänilaite UIP400MTP voidaan sisällyttää shotgun-proteomiikan näytteiden valmisteluun. Tässä tutkimussarjassa solunulkoisia vesikkeleitä (EV) sisältäviä näytteitä käsiteltiin proteomianalyysia varten metanolikäsittelyllä, ultraäänikäsittelyllä laitteella UIP400MTP, sentrifugoinnilla, kuivauksella, pilkkomisella entsyymiseoksella trypsin/Lys-C ja nanovirtauksen nestekromatografialla (LC), joka oli yhdistetty korkean erotuskyvyn tandemmassaspektrometriaan (MS). Mochizuki-Ono ja kollegat raportoivat biologisen tutkimuksen vuonna 2026. Proteomiikka-analyysi auttoi siinä karakterisoimaan, miten PLA2G12A muuttaa solunulkoisten vesikkelien kuljettamia proteiineja patogeenisten T-soluvasteiden yhteydessä.

Monikuoppalevyjen ultraäänilaite UIP400MTP

Miksi mikrolevyjen ultraäänikäsittely?
UIP400MTP mahdollistaa pienitilavuuksisten näytteiden standardoidun rinnakkaisen ultraäänikäsittelyn. Tämä on hyödyllistä, kun toistettavuus, pieni näytteen lähtömäärä ja useiden näytteiden käsittelykapasiteetti ovat tärkeitä.


Laadunvalvonnan tarkistuslista

• Varmista, että kaikkien näytteiden EV-lähtömäärä on sama proteiiniekvivalenttien perusteella.
• Käytä satunnaistettuja tai tasapainotettuja näytteiden käsittelyjärjestelyjä.
• Pidä metanolin tilavuus, ultraäänikäsittelyaika, kuivausaika ja pilkkomistilavuus yhdenmukaisina.
• Seuraa peptidisaantoa ja proteiinitunnistusten kokonaismäärää.
• Tarkista pilkkoutumatta jääneiden kohtien osuus ja peptidien pituusjakauma.
• Tarkastele kromatografisten piikkien muotoa ja retentioaikojen toistettavuutta.
• Sisällytä nollanäytteitä näytteiden välisen siirtymän seurantaan.
• Käytä yhdistettyjä QC-näytteitä laajemmissa tutkimuksissa.
• Arvioi rinnakkaisnäytteiden variaatiokerrointa.
• Käytä PCA:ta tai vastaavia menetelmiä erävaikutusten tai poikkeavien näytteiden tunnistamiseen.

Dokumentointisuositukset

Kun julkaiset tai dokumentoit tämän työnkulun, ilmoita solunulkoisten vesikkelien (EV) lähtömäärä, levymuoto, metanolin tilavuus, laitteen UIP400MTP amplitudi ja ultraäänikäsittelyaika, sentrifugointiolosuhteet, kuivausmenetelmä, pilkkomispuskuri, entsyymipitoisuus, pilkkomisaika, happamointiolosuhteet, analyysijärjestelmä menetelmälle LC-MS/MS, tiedonkeruutila, ohjelmistoversio, tietokanta, väärien löydösten osuuden (FDR) kynnysarvo, normalisointimenetelmä ja tilastollinen työnkulku.
Kaikki Hielscherin mikrolevyjen ultraäänilaitteet tallentavat automaattisesti tärkeät prosessiparametrit, kuten amplitudin, ultraäänikäsittelyn keston ja lämpötilan, päiväys- ja aikaleimalla varustettuna CVS-tiedostona integroituun SD-korttiin. Tietojen tallentaminen toistettavuutta ja laadunvalvontaa varten ei ole koskaan ollut helpompaa!

Tutkimus yksityiskohtaisesti: EV:iden shotgun-proteomiikka PLA2G12A-tutkimuksessa

Tutkimus, jossa tarkasteltiin PLA2G12A:n vaikutuksia, tarjoaa konkreettisen esimerkin laitteen UIP400MTP käytöstä shotgun-proteomiikan työnkulussa. Biologinen tutkimuskysymys oli, miten erittyvä fosfolipaasi PLA2G12A muokkaa Th17-soluista peräisin olevia solunulkoisia vesikkeleitä ja vaikuttaa siten patogeenisten T-solujen erilaistumiseen. Kirjoittajat osoittivat, että PLA2G12A vaikuttaa solunulkoisten vesikkelien (EV) kalvoihin tuottaen lysofosfolipidejä, kuten 1-oleoyylilysofosfatidyylietanoliamiinia, ja että tämän jälkeinen lysofosfatidihapposignalointi reseptorin LPA2 välityksellä edistää Th17-solujen erilaistumista. Lipidisignaloinnin lisäksi tutkimuksissa tarkasteltiin myös vesikkelien kuljettamaa sisältöä, kuten RNA:ta ja proteiinisisältöä, joten shotgun-proteomiikka oli tärkeä osa karakterisointistrategiaa.
Vesikkelien valmistelutyönkulussa Th17-soluja viljeltiin kasvatusliuoksessa, joka sisälsi eksosomeista puhdistettua naudan sikiöseerumia. Viljelmien supernatantit sentrifugoitiin ensin solujen poistamiseksi, suodatettiin 0,22 µm:n suodattimen läpi, konsentroitiin ultrasuodatuksella/ultrasentrifugoinnilla, pestiin, suspendoitiin uudelleen fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS) ja niiden määrä määritettiin proteiinimäärityksellä BCA. Tämä proteomiikkaa edeltävä vesikkelien valmistelu varmisti, että proteomiikan työnkulkuun voitiin siirtää määriteltyä proteiiniekvivalenttimäärää vastaava määrä vesikkelimateriaalia.
Shotgun-proteomiikka-analyysissa kirjoittajat käyttivät vesikkelinäytteitä, jotka vastasivat 5 µg:n proteiiniekvivalenttimäärää. Nämä näytteet kuivattiin PCR-putkissa, ja niihin lisättiin 25 µL metanolia. Näytteitä ultraäänikäsiteltiin tämän jälkeen 3 minuutin ajan mikrolevyjen ultraäänilaitteella UIP400MTP. Ultraäänikäsittelyn jälkeen näytteitä sentrifugoitiin 4°C:ssa 20 minuutin ajan 19 000 × g:n voimalla. Kun 20 µL supernatanttia oli poistettu, näytteet sentrifugoitiin kuiviksi. Proteiinit liuotettiin tämän jälkeen ultraäänikäsittelyllä 4 µL:aan entsyymiseoksen trypsin/Lys-C liuosta, jonka pitoisuus oli 100 ng/µL 50 mM:n ammoniumbikarbonaatissa. Pilkkominen suoritettiin 2 tunnin ajan 37°C:ssa ravistaen nopeudella 300 rpm. Hydrolysaatti happamoitiin 1 µL:lla 1,25%:n trifluorietikkahappoa ja analysoitiin nanovirtauksen nestekromatografialla (LC), joka oli yhdistetty korkean erotuskyvyn tandemmassaspektrometriaan (MS).
Tämä työnkulku korostaa useita hyödyllisiä periaatteita solunulkoisten vesikkelien proteomiikassa, jossa lähtömäärä on pieni. Ensinnäkin lähtömäärä normalisoitiin proteiiniekvivalentin perusteella, mikä on tärkeää verrattaessa eri genotyypeistä tai käsittelyistä saatuja vesikkeleitä. Toiseksi metanolia käytettiin ennen ultraäänikäsittelyä, mikä tuki hajotusta ja uuttoa samalla välttäen detergenttijärjestelmät, jotka saattavat hankaloittaa analyysia menetelmällä LC-MS/MS. Kolmanneksi ultraäänikäsittelyvaihe oli lyhyt ja standardoitu, mikä soveltuu rinnakkaiseen näytteiden käsittelyyn. Neljänneksi pilkkominen entsyymiseoksella trypsin/Lys-C suoritettiin erittäin pienessä tilavuudessa, mikä vähensi laimenemista ja tuki peptidien talteenottoa pienistä lähtömääristä. Lopuksi suora siirtyminen pilkkomisesta happamointiin ja analyysiin menetelmällä LC-MS/MS minimoi tarpeettomat käsittelyvaiheet.
Myöhemmässä analyysissa menetelmällä LC-MS/MS käytettiin nanovirtauksen käänteisfaasierottelua, joka oli yhdistetty massaspektrometriin Q-Exactive HF Orbitrap. Näytteet kerättiin C18-esikolonniin ja eroteltiin sitten sisähalkaisijaltaan 50 µm:n analyyttisessä kolonnissa tilavuusvirralla 200 nL/min ja lämpötilassa 40°C. Gradientti eteni pienestä orgaanisen liuottimen osuudesta 35%:n liuotin B -osuuteen 60 minuutin aikana, minkä jälkeen suoritettiin pesu suurella orgaanisen liuottimen osuudella ja uudelleentasapainotus. Massaspektrometrinen tiedonkeruu suoritettiin positiivisten ionien tilassa käyttäen datasta riippumatonta tiedonkeruuta (DIA) ja suuremman energian törmäysindusoitua dissosiaatiota. Tiedonkeruun raakatiedostot analysoitiin ohjelmistolla DIA-NN 1.8 käyttäen in silico -ennustettua spektrikirjastoa.