Mikrolevyjen ultraäänikäsittely shotgun-proteomiikassa – Käyttöohje

Shotgun-proteomiikka edellyttää tehokasta ja toistettavaa näytteenvalmistusta, jotta monimutkainen biologinen materiaali voidaan muuntaa LC-MS/MS-mittaukseen soveltuviksi peptideiksi. UIP400MTP-mikrolevyultraäänilaite tukee tätä prosessia mahdollistamalla pienitilavuuksisten näytteiden standardoidun ja rinnakkaisen ultraäänikäsittelyn, mikä auttaa laboratorioita parantamaan solujen hajottamista, uuttamista ja uudelleenliukenemista mikrolevypohjaisissa työnkuluissa. Tässä sovellusohjeessa kuvataan, miten UIP400MTP voidaan integroida proteomiikan näytteenvalmistukseen käyttäen laboratoriossa testattua esimerkkiä, joka perustuu PLA2G12A/Th17-tutkimuksista julkaistuun solunulkoisten vesikkelien käsittelyprosessiin.

Mikrolevyjen ultraäänikäsittely parantaa shotgun-proteomiikan toistettavuutta

Proteomiikan tutkijoille toistettavissa oleva näytteenvalmistus on ratkaisevan tärkeää korkealaatuisten LC-MS/MS-tulosten saamiseksi. UIP400MTP-mikrolevyultraäänilaite mahdollistaa standardoidun, rinnakkaisen ultraäänikäsittelyn levyperusteisissa sekä pienitilavuuksisissa ja suurikapasiteettisissa työnkuluissa.

Se on erityisen hyödyllinen laboratorioille, jotka työskentelevät seuraavien alojen parissa:

• Suuret näytekokonaisuudet, joiden käsittelyn on oltava yhdenmukaista useissa kuopissa
• Aineisto, jossa näytteiden menetys ja vaihtelu on minimoitava
• Rasvapitoiset näytteet, kuten solunulkoiset vesikkelit
• Monimutkaiset biologiset valmisteet, jotka edellyttävät tehokasta hajottamista, uuttamista tai uudelleenliuottamista
• Vertaileva shotgun-proteomiikka, jossa toistettavuus eri olosuhteissa ja toistokokeissa on olennaisen tärkeää

Integroimalla mikrolevyjen ultraäänikäsittelyn ennen pilkkomista tutkijat voivat parantaa näytteiden valmiutta seuraaviin tarkoituksiin:

• Proteiinin uuttaminen ja uudelleenliukenemisen aikaansaaminen
• Trypsiini-/Lys-C-pilkkominen
• Nano-LC/MS/MS-mittaustulosten kerääminen
• Määrällinen proteomiikan jatkokäsittelyanalyysi

 

Laajenna proteomiikan näytteiden valmistelua luottavaisin mielin!
Tutustu siihen, miten mikrolevyjen ultraäänikäsittely auttaa vähentämään manuaalista vaihtelua, parantamaan näytteiden hajotusta ja valmistelemaan monimutkaisia biologisia näytteitä luotettavaa LC-MS/MS-analyysiä varten.

Tietopyyntö


Sähköpostiosoite (pakollinen)


tuote tai kiinnostuksen kohde



Hyväksyn tietosuojakäytännön









Pyydä tietoja

Mikrolevyjen ultraäänikäsittelystä voi olla hyötyä:

• Proteomiikan ydinlaitokset
• Sähköautojen tutkimuslaboratoriot
• Immunologian ja solubiologian laboratoriot
• Kliinisen tutkimuksen ryhmät
• Biotieteiden tutkimusryhmät, jotka laajentavat toimintaansa yksittäisten näytteiden valmistelusta suuremman läpimenokapasiteetin työnkulkuihin

Suurikapasiteettinen näytteiden valmistelu solunulkoisten vesikkelien proteomianalyysiä varten

Mitä on Shotgun-proteomiikka?

Shotgun-proteomiikka on noussut keskeiseksi analyysistrategiaksi monimutkaisten biologisten näytteiden karakterisoinnissa, aina kokosolulysaatteista ja kudosuutteista puhdistettuihin organelleihin, solunulkoisiin vesikkeleihin ja pieninäytteisiin kliinisiin näytteisiin. Sen keskeinen vahvuus on proteiinien pilkkomisen, korkean resoluution nestekromatografian ja tandem-massaspektrometrian sekä laskennallisen peptidi-proteiini-päätelmän yhdistämisessä. Lopullisen proteomidatan laatu määräytyy kuitenkin jo kauan ennen kuin näyte saavuttaa massaspektrometrin. Tehokas näytteen hajottaminen, proteiinien liukoisuuden parantaminen, häiritsevien aineiden poistaminen, toistettava entsymaattinen pilkkominen ja luotettava peptidien talteenotto ovat kaikki ratkaisevia tekijöitä kattavuuden syvyyden ja kvantitatiivisen luotettavuuden kannalta.
Proteomiikan tutkijoille ja biotieteiden laboratorioille, jotka työskentelevät rajallisten tai arvokkaiden näytteiden parissa, näytteiden valmistelu on usein pullonkaula.

Solunulkoisten vesikkelien aiheuttama haaste proteomiikassa

Esimerkiksi solunulkoiset vesikkelit (EV:t) muodostavat erityisen vaativan näyteluokan. Ne ovat kalvoon sidottuja, lipidipitoisia, nanokokoisia hiukkasia, joiden proteiinisaanto on suhteellisen alhainen ja joissa on suuri riski lipidien, suolojen, pesuaineiden, seerumiproteiinien ja muiden matriisikomponenttien siirtymiselle. Nämä ominaisuudet voivat heikentää pilkkomisen tehokkuutta, kromatografista suorituskykyä, elektrospray-vakautta ja peptidien tunnistamista. EV-proteomiikan valmistusprosessin on siksi oltava riittävän tehokas hajottamaan vesikkelirakenteet ja liuottamaan proteiinikuorman, samalla kun se on yhteensopiva myöhemmän entsymaattisen pilkkomisen ja LC-MS/MS-analyysin kanssa.
Tässä yhteydessä mikrolevyjen kanssa yhteensopiva ultraäänikäsittely tarjoaa käytännöllisen ratkaisun toistettavaan ja rinnakkaistettuun näytteiden käsittelyyn. Hielscherin mikrolevy-ultraäänikäsittelylaitemallit UIP400MTP (400 W) ja UIP550MTP (550 W) on suunniteltu näytteiden ultraäänikäsittelyyn monikuoppalevyissä ja pienitilavuuksisissa astioissa, ja ne tukevat suuremman läpimenon työnkulkuja kuin perinteiset yksianturiset ultraäänikäsittelylaitteet. Proteomiikkalaboratorioille tämä muoto on houkutteleva, koska se voi vähentää manuaalisen käsittelyn vaihtelua, parantaa useiden näytteiden rinnakkaiskäsittelyä ja integroitua luonnollisemmin levyihin perustuviin näytteenvalmistusprosesseihin.

Esimerkki työnkulusta

Äskettäin julkaistu solunulkoisten vesikkelien proteomiikan työnkulku PLA2G12A:n ohjaamassa Th17-solubiologiassa tarjoaa hyödyllisen, laboratoriossa testatun esimerkin siitä, miten mikrolevy-ultraäänikäsittelylaite UIP400MTP voidaan integroida shotgun-proteomiikan näytteiden valmisteluun. Kyseisessä tutkimussarjassa EV-näytteet käsiteltiin proteomianalyysiä varten metanolikäsittelyllä, UIP400MTP-ultraäänikäsittelyllä, sentrifugoinnilla, kuivauksella, trypsiini/Lys-C-pilkkomisella sekä nano-flow LC-korkean resoluution tandem-MS-menetelmällä. Sama biologinen tutkimus julkaistiin ensin bioRxiv-preprintinä ja myöhemmin Cell Reports -lehdessä, jossa proteomiikan analyysin avulla selvitettiin, miten PLA2G12A muuttaa EV-lastiproteiineja patogeenisten T-soluvasteiden yhteydessä.

Multi-well-levyn sonikaattori UIP400MTP

Miksi mikrolevyjen ultraäänikäsittely?
UIP400MTP-laite mahdollistaa pienitilavuuksisten näytteiden standardoidun, rinnakkaisen ultraäänikäsittelyn. Tästä on hyötyä tilanteissa, joissa toistettavuus, pieni näytemäärä ja useiden näytteiden käsittelykapasiteetti ovat tärkeitä.

Laadunvalvonnan tarkistuslista

• Varmista, että kaikkien näytteiden EV-proteiinipitoisuus on sama.
• Käytä satunnaistettuja tai tasapainotettuja näytteenkäsittelymalleja.
• Pidä metanolin tilavuus, ultraäänikäsittelyaika, kuivausaika ja hajotustilavuus vakioina.
• Seuraa peptidien saantoa ja tunnistettujen proteiinien kokonaismäärää.
• Tarkista katkeamisten osuus ja peptidien pituusjakauma.
• Tarkista kromatografisen piikin muoto ja retentioajan toistettavuus.
• Lisää tyhjiä rivejä, jotta voit seurata siirtymää.
• Käytä yhdistettyjä laadunvalvontanäytteitä laajemmissa tutkimuksissa.
• Arvioi toistojen variaatiokerroin.
• Käytä PCA:ta tai vastaavia menetelmiä erävaikutusten tai poikkeavien näytteiden tunnistamiseen.

Pöytäkirjojen laatimista koskevat suositukset

Kun julkaiset tai dokumentoit tätä työnkulkua, ilmoita EV:n syöttömäärä, levyn muoto, metanolin tilavuus, UIP400MTP:n amplitudi ja ultraäänikäsittelyaika, sentrifugointiolosuhteet, kuivausmenetelmä, pilkkomispuskurin koostumus, entsyymipitoisuus, pilkkomisaika, happamoitusolosuhteet, LC-MS/MS-alustan, mittaustilan, ohjelmistoversion, tietokannan, FDR-kynnysarvon, normalisointimenetelmän sekä tilastollisen työnkulun.
Kaikki Hielscherin mikrolevy-ultraäänilaitteet tallentavat automaattisesti tärkeät prosessiparametrit, kuten amplitudin, ultraäänikäsittelyn keston ja lämpötilan, päivämäärä- ja aikaleimoineen CVS-tiedostona integroituun SD-korttiin. Tietojen kirjaaminen toistettavuuden ja laadunvalvonnan varmistamiseksi ei ole koskaan ollut näin helppoa!

Tutkimus yksityiskohtaisesti: EV-shotgun-proteomiikka PLA2G12A-tutkimuksessa

PLA2G12A-tutkimus tarjoaa konkreettisen esimerkin UIP400MTP:n käytöstä shotgun-proteomiikan työnkulussa. Biologisena tutkimuskysymyksenä oli, kuinka erittyvä fosfolipaasi PLA2G12A muokkaa Th17-soluista peräisin olevia solunulkoisia vesikkeleitä ja vaikuttaa siten patogeenisten T-solujen erilaistumiseen. Tutkijat osoittivat, että PLA2G12A vaikuttaa ekstrasellulaaristen vesikkelien (EV) kalvoihin tuottamalla lysofosfolipidejä, kuten 1-oleoyylilysofosfatidyylietanoliamiinia, ja että LPA2:n välittämä lysofosfatidihapon signalointi edistää Th17-solujen erilaistumista. Lipidisignaloinnin lisäksi tutkimuksissa tarkasteltiin myös ekstrasellulaaristen vesikkelien sisältöä, mukaan lukien RNA- ja proteiinipitoisuudet, minkä vuoksi shotgun-proteomiikka oli tärkeä osa karakterisointistrategiaa.
EV:n valmistusprosessissa Th17-soluja viljeltiin elatusaineessa, joka sisälsi eksosomista puhdistettua naudan sikiöseerumia. Viljelyliuoksen supernatantit sentrifugoitiin ensin solujen poistamiseksi, suodatettiin 0,22 µm:n suodattimen läpi, konsentroitiin ultrafiltraatiolla/ultracentrifugoinnilla, pestiin, suspendoitiin uudelleen PBS:ään ja kvantifioitiin BCA-proteiinimäärityksellä. Tämä EV:n valmistusvaihe varmisti, että määritelty, proteiinipitoisuudeltaan vastaava määrä EV-materiaalia voitiin siirtää proteomiikan työnkulkuun.
Shotgun-proteomiikan analyysissä kirjoittajat käyttivät EV-näytteitä, jotka vastasivat 5 µg:n proteiiniekvivalentteja. Nämä näytteet kuivattiin PCR-putkissa, ja niihin lisättiin 25 µL metanolia. Sen jälkeen näytteitä sonikoitiin 3 minuutin ajan UIP400MTP-mikrolevy-sonikaattorilla. Ultraäänikäsittelyn jälkeen näytteet sentrifugoitiin 4 °C:ssa 20 minuuttia 19 000 × g:n nopeudella. Kun 20 µl supernatanttia oli poistettu, näytteet sentrifugoitiin kuiviin. Proteiinit liuotettiin sitten ultraäänikäsittelyllä 4 µl:aan trypsiini/Lys-C-liuosta, jonka pitoisuus oli 100 ng/µl 50 mM:n ammoniumbikarbonaattiliuoksessa. Pilkkomista suoritettiin 2 tuntia 37 °C:ssa ravistellen 300 rpm:n nopeudella. Pilkkomistuote happamoitettiin 1 µl:lla 1,25-prosenttista trifluorietikkahappoa ja analysoitiin nano-virtaus-LC-korkean resoluution tandem-massaspektrometrialla.
Tämä työnkulku tuo esiin useita hyödyllisiä periaatteita vähäisen lähtömäärän EV-proteomiikalle. Ensinnäkin lähtömäärä normalisoitiin proteiiniekvivalenttina, mikä on tärkeää vertailtaessa eri genotyyppien tai käsittelyjen EV:itä. Toiseksi ennen ultraäänikäsittelyä käytettiin metanolia, mikä tukee solujen hajoamista ja uuttamista samalla kun vältetään pesuainejärjestelmiä, jotka saattavat vaikeuttaa LC-MS/MS-analyysiä. Kolmanneksi ultraäänikäsittelyvaihe oli lyhyt ja standardoitu, mikä sopii rinnakkaiseen näytteiden käsittelyyn. Neljänneksi trypsiini-/Lys-C-pilkkominen suoritettiin hyvin pienessä tilavuudessa, mikä vähensi laimennusta ja edisti vähäisen näytemäärän sisältävien peptidien talteenottoa. Lopuksi suora siirtyminen pilkkomisesta happamoittamiseen ja LC-MS/MS-analyysiin minimoi tarpeettomat käsittelyvaiheet.
Jatkokäsittelyvaiheessa käytetyssä LC-MS/MS-menetelmässä hyödynnettiin nanovirtausta käyttävää käänteisfaasierotusta, joka oli kytketty Q-Exactive HF Orbitrap -massaspektrometriin. Näytteet kerättiin C18-esikolonnille, minkä jälkeen ne erotettiin sisähalkaisijaltaan 50 µm:n analyysikolonnilla virtausnopeudella 200 nL/min ja lämpötilassa 40 °C. Gradientti kulki matalasta orgaanisen liuottimen pitoisuudesta 35 %:n liuottimeen B 60 minuutin aikana, minkä jälkeen suoritettiin korkean orgaanisen liuottimen pitoisuuden pesu ja uudelleentasapainotus. MS-mittaus suoritettiin positiivisten ionien tilassa käyttäen datariippumatonta mittausta (DIA) ja korkeaenergisellä törmäysdissosiaatiolla. DIA-raakatiedostot analysoitiin DIA-NN 1.8 -ohjelmistolla käyttäen in silico -menetelmällä ennustettua spektrikirjastoa.