Hiivasolujen hajottaminen mikrolevyillä korkean intensiteetin ultraäänikäsittelyllä

Mikrobiologit ja biotieteiden tutkijat, jotka työskentelevät Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris / Komagataella phaffii, ja muissakin hiivajärjestelmissä tunnetaan tämä haaste: hiivasolut ovat kestäviä, niiden toistettava hajottaminen voi olla vaikeaa, ja näytteiden manuaalinen hajottaminen muuttuu nopeasti pullonkaulaksi, kun on seulottava useita kantoja, klooneja, viljelyolosuhteita tai ilmentymiskonstruktioita.

Suurikapasiteettinen hiivan solujen hajotus mikrobiologian, molekyylibiologian ja proteiinanalytiikan tarpeisiin

Hielscherin mikrolevy-ultraäänilaitteet, kuten UIP400MTP (400 W) ja UIP550MTP (550 W), tarjoavat suuren läpimenokapasiteetin ratkaisun hiivasolujen mekaaniseen hajottamiseen suoraan mikrolevyissä. Sen sijaan, että näytteitä käsiteltäisiin yksi kerrallaan anturilla, kokonaiset mikrolevyt voidaan käsitellä ultraäänellä tasaisissa olosuhteissa. Tämä tekee hiivasolujen ultraäänilyysistä nopeampaa, toistettavampaa ja helpommin integroitavaa nykyaikaiseen mikrobiologiaan, proteiini-ilmentymiseen, entsyymiseulontaan ja omiikka-työnkulkuihin.
Olipa kyseessä sitten rekombinanttiproteiinien eristäminen P. pastoris -hiivasta, hiivalysaattien valmistaminen entsyymimäärityksiä varten, S. cerevisiae -hiivan solujen hajottaminen proteiinanalyysiä varten tai kymmenien hiivakloonien rinnakkaistutkimus, Hielscherin mikrolevy-ultraäänilaitteet tarjoavat tehokkaan kavitaatiopohjaisen solujen hajottamisen ja tarkan prosessinohjauksen.

Miksi hiivasolut tarvitsevat tehokasta mekaanista hajotusta

Hiivasoluja on vaikeampi hajottaa kuin monia bakteeri- tai nisäkässoluja, koska niitä suojaa jäykkä soluseinä, joka koostuu pääasiassa polysakkarideista, glukaaneista, mannoproteiineista ja kitiinistä. Tämä soluseinä tarjoaa mekaanista vakautta, mutta se myös rajoittaa solunsisäisten proteiinien, nukleiinihappojen, aineenvaihduntatuotteiden ja entsyymien vapautumista.
Perinteisiä hiivan hajotusmenetelmiä ovat helmenmurskaus, entsymaattinen pilkkominen, pakastus-sulatusjaksot, kemiallinen hajotus ja koettimella suoritettava ultraäänikäsittely. Nämä menetelmät voivat olla tehokkaita, mutta niillä on myös rajoituksia. Helmenlyönti voi aiheuttaa jätteitä ja lämpenemistä, entsymaattinen pilkkominen voi lisätä kustannuksia ja vaihtelua, ja yksittäisen näytteen koettimella tapahtuva ultraäänikäsittely on aikaa vievää, kun on käsiteltävä suuria näytemääriä.
Korkean intensiteetin kohdennettu ultraäänikavitaatio ylittää nämä rajoitukset kohdistamalla hiivasuspensioon voimakkaita mekaanisia leikkausvoimia, painevaihteluita ja mikrovirtauksia. Tuloksena on soluseinien ja -kalvojen nopea hajoaminen, solunsisäisen vapautumisen tehostuminen sekä erittäin toistettavissa oleva näytteenvalmistus levymuodossa.

Mikrolevyjen ultraäänikäsittely hiivanäytteiden rinnakkaisvalmistelussa

Hielscher UIP400MTP- ja UIP550MTP-laitteet on suunniteltu mikrolevyjen, monikuoppalevyjen, PCR-levyjen ja sopivien näytealustojen tasalaatuiseen ultraäänikäsittelyyn. Toisin kuin anturipohjaisessa ultraäänikäsittelyssä, näytteitä ei tarvitse käsitellä yksitellen. Koko levy altistetaan hallitulle ultraäänienergialle, minkä ansiosta työnkulku sopii erinomaisesti näytteiden rinnakkaiskäsittelyyn.

Tämä on erityisen hyödyllistä seuraavissa tilanteissa:

• seulonta Leivontahiiva mutantit tai ilmentymiskannat
• Lysyysi Pastorin isä / K. phaffii kloonit rekombinanttiproteiinin ilmentymisen jälkeen
• Hiivalysaattien valmistus entsyymimäärityksiä varten
• Proteiinin eristäminen SDS-PAGE-, Western blot-, ELISA-, LC-MS/MS- tai aktiivisuustestausta varten
• Solunsisäisten metaboliittien vapauttaminen metabolomiikkaa varten
• DNA- ja RNA-näytteiden valmistelu sopivan jatkopuhdistuksen jälkeen
• Lysispuskurien, lisäaineiden ja uutto-olosuhteiden suurikapasiteettinen optimointi

Miten ultraäänikavitaatio tuhoaa hiivasoluja

Ultraäänikäsittelyn aikana kohdennettu suuritehoinen ultraääni aiheuttaa nestemäisessä näytteessä vuorotellen puristumis- ja harventumissyklejä. Riittävällä voimakkuudella nämä painevaihtelut aiheuttavat akustista kavitaatiota. Kavitaatiokuplat muodostuvat, värähtelevät ja romahtavat, mikä tuottaa paikallisia leikkausvoimia, mikrosuihkuja, turbulenssia ja voimakkaita paine-eroja.
Hiivasuspensioissa nämä mekaaniset vaikutukset heikentävät ja rikkovat soluseinän ja solukalvon. Solunsisäiset proteiinit, entsyymit, nukleiinihapot ja metaboliitit vapautuvat lyysipuskurin sekaan. Koska prosessi on mekaaninen, sitä voidaan käyttää monien erilaisten puskurijärjestelmien kanssa ja yhdistää proteaasi-inhibiittoreihin, pelkistimiin, pesuaineisiin, suoloihin tai lievään entsymaattiseen esikäsittelyyn.

Yleisohjeet: Hiivasolujen hajottaminen mikrolevyillä

Seuraava protokolla tarjoaa käytännöllisen lähtökohdan hiivan hajottamiseen Hielscher UIP400MTP- tai UIP550MTP-mikrolevyultraäänilaitteella. Parametrit on optimoitava hiivakannan, solutiheyden, kohdemolekyylin, puskurin koostumuksen, levytyypin ja jatkokäsittelyn mukaisesti.

1. Hiivasolujen kerääminen ja pesu

Kasvata Saccharomyces-, Pichia-, Hansenula-, Debaryomyces- tai muuta hiivakantaa halutuissa viljelyolosuhteissa. Kerää solut sentrifugoimalla ja poista viljelyalusta. Pese sakka kylmällä tislatulla vedellä, PBS:llä tai valitulla lyysipuskurilla, jotta poistat jäljellä olevat viljelyalustan aineosat, jotka saattavat häiritä myöhempiä analyysejä.
Proteiinien uuttamista varten näytteet on pidettävä kylminä ja työ on suoritettava nopeasti. Jos proteaasit ovat ongelmana, jäähdytä kaikki puskurit ja kulutustarvikkeet etukäteen.

2. Sekoita solupelletti uudelleen

Sekoita hiivapelletti uudelleen sopivaan kylmään lyysipuskuriliuokseen. Tehokkaan proteiinien vapautumisen kannalta korkea solutiheys on usein edullista. Käytä lähtökohtana noin 10–20 % (paino/tilavuus) märkää solupellettiä tai tiheää suspensiota, joka vastaa OD-arvoa₆₀₀ > 10, riippuen määrityksestä.

Tyypillinen hiivan proteiinien hajotuspuskuriliuos voi sisältää:

• puskurijärjestelmä, kuten Tris-HCl, fosfaattipuskuri tai HEPES
• suola, kuten NaCl tai KCl
• Proteaasi-inhibiittori cocktail
• valinnainen pelkistin, kuten DTT tai β-merkaptoetanoli
• valinnainen pesuaine, kuten Triton X-100, NP-40, SDS tai CHAPS, riippuen jatkokäsittelyn yhteensopivuudesta
• valinnaiset fosfataasi-inhibiittorit fosforylaatiotutkimuksia varten

Vaikeiden hiivakantojen tai erittäin hellävaraisen proteiinin uuttamisen yhteydessä voidaan ennen ultraäänikäsittelyä suorittaa lyhyt esikäsittely Zymolyase-, Lyticase- tai muulla soluseinää hajottavalla entsyymillä. Tämä entsymaattinen esikäsittely on vapaaehtoista, mutta se voi parantaa solujen hajoamistehokkuutta tai vähentää tarvittavaa ultraäänitehoa.

3. Siirrä näytteet sopivaan mikrolevyyn

Annostele hiivasuspensio ultraäänikäsittelyyn soveltuvaan mikrolevyyn. Pyöreäpohjaisia levyjä suositellaan usein, koska ne parantavat näytteen keräämistä ja vähentävät kuolleita alueita. Käytä yhtä suuria näytemääriä kaikissa kuopissa toistettavuuden parantamiseksi.
Sulje levy sopivalla tiivistysmatolla tai -kalvolla haihtumisen, aerosolien muodostumisen ja ristikontaminaation estämiseksi. Varmista, että tiiviste sopii valittuihin lämpötila- ja ultraäänikäsittelyolosuhteisiin.
Tyypilliset työtilavuudet riippuvat levyn koosta ja käyttötarkoituksesta. Yleisiä kokoja ovat esimerkiksi 96-kuoppalevyt, syväkuoppalevyt, PCR-levyt tai sopivat putkitelineet.

4. Jäähdytyksen asettaminen

Hiivan hajottaminen vaatii suurta ultraäänitehoa, ja mekaaninen hajottaminen tuottaa lämpöä. Lämpötilan säätö on siksi ratkaisevan tärkeää, erityisesti proteiini-, entsyymi-, RNA- tai fosforylaatioanalyyseissä.

Käytä sopivaa jäähdytysmenetelmää, kuten:

• ennaltajäähdytetty lyysipuskuriliuos
• esijäähdytetyt mikrolevyt
• jäähdytystauot ultraäänikäsittelyjaksojen välillä
• ulkoinen jäähdytys ultraäänikäsittelyalustalle, mikäli tarpeen

Tavoitteena on pitää näyte riittävän kylmänä, jotta vältetään proteiinien denaturoituminen, entsyymien inaktivoituminen, RNA:n hajoaminen sekä lämmön aiheuttamat vaihtelut näytteessä.

5. Käsittele hiivasuspensiota ultraäänellä

Aseta suljettu levy Hielscher UIP400MTP- tai UIP550MTP-mikrolevyultraäänilaitteeseen ja valitse pulssitoiminen ultraääniohjelma. Pulssitoimintoa suositellaan, koska se mahdollistaa mekaanisen hajottamisen ON-vaiheiden aikana ja lämmön haihtumisen OFF-vaiheiden aikana.
Hiivasolujen hajottamisen lähtökohtana:

Jos kyseessä ovat erittäin resistentit hiivasuspensiot, tiheä P. pastoris -biomassa tai vaikea rekombinanttiproteiinin uuttaminen, lisää kumulatiivista ON-aikaa vaiheittain. Lämpöherkkien proteiinien tai entsyymimääritysten yhteydessä käytä lyhyempiä pulsseja, pidempiä jäähdytystaukoja ja pienempää aloitusamplitudia.

Hiivan lysis suurella läpimenokapasiteetilla monikuoppalevyillä UIP400MTP-laitteella

6. Lysatin puhdistaminen

Ultraäänikäsittelyn jälkeen sentrifugoi mikrolevy tai siirrä näytteet sentrifugointiputkiin. Poista solujätteet sentrifugoimalla sopivalla nopeudella ja lämpötilassa. Kerää supernatantti jatkokäsittelyä varten.

Käyttötarkoituksesta riippuen lysaattia voidaan käyttää seuraaviin tarkoituksiin:

• Proteiinien kvantifiointi
• entsyymiaktiivisuuden määritykset
• SDS-PAGE ja Western blotting
• ELISA ja immunomääritykset
• LC-MS/MS-proteomiikka
• metaboliittianalyysi
• DNA:n tai RNA:n puhdistaminen

7. Menetelmän optimointi ja dokumentointi

Jotta hiivan hajottaminen olisi toistettavissa, kirjaa ylös kaikki merkitykselliset parametrit, kuten kanta, viljelyolosuhteet ja OD₆₀₀, märän kennon massa, puskurin koostumus, levytyyppi, näytteen tilavuus, amplitudi, pulssijakso, kumulatiivinen päälläoloaika, jäähdytystapa ja näytteen lopullinen lämpötila.
Jos Hielscher-ultraäänilaite on varustettu automaattisella tietojen tallennustoiminnolla, prosessitietoja voidaan käyttää dokumentointiin, menetelmien kehittämiseen, tuotannon laajentamiseen ja laadunvalvontaan.

Vinkkejä hiivan hajottamisen optimointiin

Proteiinien maksimaalisen vapautumisen saavuttamiseksi käytä tiheitä hiivasuspensioita, korkeaa ultraäänitehoa ja riittävää kumulatiivista käyttöaikaa. Herkkien proteiinien kohdalla vähennä amplitudia, pidennä jäähdytystaukoja ja pidä levy kylmänä koko käsittelyn ajan.
Jos lysaatio on puutteellista, pidennä ultraäänikäsittelyaikaa vaiheittain, kokeile entsymaattista esikäsittelyä, vähennä näytteen viskositeettia tai optimoi puskuri. Jos proteiinit hajoavat tai menettävät aktiivisuutensa, paranna jäähdytystä, lyhennä ON-välejä, lisää inhibiittoreita ja varmista, että pesuainejärjestelmä on yhteensopiva kohdeproteiinin kanssa.
Koska hiivakantojen soluseinän rakenne, kasvuvaihe, ilmentymisjärjestelmä ja biomassan tiheys eroavat toisistaan huomattavasti, suositellaan lyhyttä optimointimatriisia. Kokeile esimerkiksi kolmea amplitudia, kahta pulssisykliä ja kahta kokonais-ON-aikaa ja arvioi sitten lyysitehokkuus ja proteiinin eheys.

Hielscherin mikrolevy-ultraäänilaitteiden edut hiivan solujen hajottamisessa

Hielscherin mikrolevy-ultraäänilaitteet sopivat erinomaisesti laboratorioihin, joissa tarvitaan toistettavaa solujen hajottamista useissa näytteissä. Ne poistavat anturiultraäänikäsittelyn hitaan, näyte kerrallaan -työskentelytavan ja vähentävät vaihtelua, joka johtuu anturin manuaalisesta sijoittamisesta, upotussyvyydestä sekä näytteiden välisistä käsittelyeroista.

Tärkeimpiä etuja ovat:

• Korkean suorituskyvyn käsittely: Käsittele useita hiivanäytteitä samanaikaisesti mikrolevyillä tai yhteensopivilla näytealustoilla.
• Toistettavat olosuhteet: Samat ultraäänikäsittelyolosuhteet kaikissa kuopissa, jotta solujen hajoamistulokset ovat yhdenmukaisia ja vertailukelpoisia.
• Ei koettimien välistä ristikontaminaatiota: Näytteet pysyvät suljettuina ultraäänikäsittelyn aikana, mikä vähentää siirtymistä ja puhdistustoimenpiteitä.
• Sopii kestävälle soluille: Korkean intensiteetin ultraääni edistää hiivasolujen soluseinien hajoamista.
• Tehokas työnkulku: Sopii erinomaisesti kantojen, kloonien, ilmentymisolosuhteiden ja lyysipuskurien seulontaan.
• Tehokas työnkulku: Ohjelmoitavat asetukset, automaattinen tietojen tallennus ja sopii laboratorioautomaatioon.

Sovellukset hiivabiotekniikassa ja biotieteiden tutkimuksessa

Ultraäänipohjainen hiivan lysaatio mikrolevyillä tukee monia tutkimus- ja seulontaprosesseja. Rekombinanttiproteiinien ilmentymisessä P. pastoris- ja S. cerevisiae -klooneja voidaan hajottaa rinnakkain ilmentymistasojen tai entsyymiaktiivisuuden vertailemiseksi. Systeemibiologiassa ja omiikassa standardoitu hajotus parantaa vertailukelpoisuutta eri olosuhteiden välillä. Mikrobiologiassa ultraäänikäsittely tukee lysaattien nopeaa valmistusta useista kannoista, elatusaineolosuhteista tai stressikäsittelyistä.
Tyypillisiä käyttöalueita ovat muun muassa:

• hiivaproteiinin uuttaminen
• rekombinanttiproteiinien seulonta
• entsyymiaktiivisuuden seulonta
• kloonien valinta transformaation jälkeen
• käymisen optimointi
• proteomiikan näytteiden valmistelu
• metabolomiikan näytteiden valmistelu
• soluseinän hajoamista koskevat tutkimukset
• suurikapasiteettiset mikrobiologiset määritykset

Luotettava hiivan hajottaminen alkaa hallitulla ultraäänikäsittelyllä

Hiivan hajottaminen voi olla haastavaa, kun näytemäärät kasvavat, mutta Hielscherin mikrolevy-ultraäänilaitteet tekevät prosessista nopeamman, puhtaamman ja toistettavamman. UIP400MTP- ja UIP550MTP-mallien avulla tutkijat voivat käsitellä kokonaisia levyjä määritellyissä ultraääniolosuhteissa, mikä parantaa läpimenoa ja vähentää manuaalista käsittelyä.
Mikrobiologeille, molekyylibiologeille, proteiinitutkijoille ja biotekniikan laboratorioille mikrolevyjen ultraäänikäsittely on tehokas keino vapauttaa hiivan solunsisäisiä komponentteja tehokkaasti ja toistettavasti.

Kirjallisuus / Viitteet