Korvaa solujen kaavinta suuren näytteenkäsittelykapasiteetin ultraäänilaitteella UIP400MTP

Adherenttien solulinjojen irrottaminen ja uuttaminen monikuoppalevyiltä multiomiikka-analyysiä varten on laboratorioiden päivittäinen tehtävä. Solujen irrottaminen suurella näytteenkäsittelykapasiteetilla monikuoppalevyjen ultraäänilaitteen UIP400MTP avulla korvaa solujen manuaalisen kaavinnan ja parantaa RNA:n, kokonaislipidien ja kaikkien polaaristen metaboliittien saantoja. Uusi menetelmä yhdistää Hielscher UIP400MTP -ultraäänilaitteen Beckman Coulter i7 -nesteenkäsittelytyöasemaan ja mahdollistaa toistettavan ja tehokkaan solujen käsittelyn suurella näytteenkäsittelykapasiteetilla RNA:n, metaboliittien ja lipidien uuttamista varten. Esitelty menetelmä ylittää perinteiset solujen manuaaliset kaavintamenetelmät saavuttamalla paremman toistettavuuden ja saannon eri solutyypeillä ja erilaisissa koeolosuhteissa.

Sujuvoita solujen irrottamista mikrolevyjen ultraäänilaitteella UIP400MTP

Adherenttien solujen viljelyjärjestelmillä on keskeinen rooli toksikologisessa ja biolääketieteellisessä tutkimuksessa. Tässä yhteydessä Cruchley-Fuge ym. (2024) käsittelivät merkittävää haastetta PrecisionTox-hankkeessa, joka keskittyi omiikkateknologioiden hyödyntämiseen kemikaalien vaarojen arvioinnissa. Hankkeen tavoitteena oli analysoida suurella näytteenkäsittelykapasiteetilla tuhansia näytteitä, joita oli käsitelty erilaisilla kemikaaleilla. Tähän tarpeeseen vastatakseen tutkijat kehittivät automatisoidun työnkulun, jossa ultraäänilaite UIP400MTP yhdistettiin vakiintuneisiin kaksifaasisiin uuttomenettelyihin nestekromatografia-massaspektrometria-analyysiä (LC-MS) varten. Heidän tutkimuksessaan arvioidaan monikuoppalevyjen ultraäänilaitteen UIP400MTP tehokkuutta adherenttien solujen irrottamisessa verrattuna manuaaliseen kaavintaan ja muihin perinteisiin menetelmiin.

Multiomiikan sujuvoittaminen: adherenttien solujen automatisoitu uutto laitteella UIP400MTP

Birminghamin yliopiston Laura Cruchley-Fugen tutkimusryhmä käytti kolmea ihmisen solulinjaa: HepG2 (maksasyöpäsolut), HepaRG (erilaistuneet hepatosyyttien kaltaiset solut) ja H295R (lisämunuaissyöpäsolut). Näitä soluja viljeltiin 24- ja 96-kuoppalevyillä ja altistettiin testikemikaaleille, kuten aflatoksiini B1:lle ja forskoliinille.

Koeasetelma:

Vaihe 1: Ultraäänilaitteen UIP400MTP tehoasetusten optimointi ja vertailu solujen manuaaliseen kaavintaan ja ultraäänivesihauteisiin. HepG2-soluja käytettiin RNA:n, metaboliittien ja lipidien talteenoton arviointiin.
Vaihe 2: UIP400MTP-laitteen integrointi kaksifaasiseen uuttotyönkulkuun Beckman Coulter i7 -järjestelmän avulla. Validointi tehtiin HepaRG- ja H295R-soluilla.

Uuttotyönkulku: Työnkulku sisälsi kemikaalialtistukset monikuoppalevyillä, solujen irrottamisen laitteella UIP400MTP ja kaksifaasisen uuton Bligh & Dyer (B&D) -menetelmällä. Lipofiilisten ja polaaristen yhdisteiden LC-MS-analyysi tehtiin Thermo Scientific Orbitrap Exploris 120 -laitteella. Menetelmä B&D, joka on lipidien kvantitatiivisen määrityksen kultainen standardi, sisältää kaksivaiheisen uuton metanolilla, kloroformilla ja vedellä sekä sen jälkeen lipidien kvantitatiivisen määrityksen kloroformifaasista.

Mikrolevyjen ultraäänilaite UIP400MTP helpottaa adherenttien solulinjojen irrottamista monikuoppalevyiltä ja petrimaljoista

Tulokset:

Vaihe 1: Optimaaliset ultraäänikäsittelyolosuhteet tunnistettiin 60 %:n teholla.
UIP400MTP tuotti suurimman RNA-saannon poikkeuksellisella toistettavuudella verrattuna manuaaliseen kaavintaan ja ultraäänihauteisiin.
Polaaristen metaboliittien talteenotto oli yhdenmukaista eri menetelmillä, kun taas lipidien talteenotto oli huomattavasti parempi laitteella UIP400MTP.
Vaihe 2: Validointi HepaRG- ja H295R-soluilla osoitti lipidomiikka- ja metabolomiikkatietojen hyvän toistettavuuden, mistä kertoivat tiiviisti ryhmittyneet PCA-pisteet.
Aflatoksiini B1- ja forskoliinikäsittelyt erottuivat selvästi kontrolleista, mikä korosti menetelmän herkkyyttä ja luotettavuutta.

”Hielscher UIP400MTP -ultraäänilaite tarjoaa laadukkaan ja toistettavan vaihtoehdon solujen manuaalisen kaavinnan ”kultaiselle standardille” ja parantaa RNA:n, kokonaislipidien ja kaikkien polaaristen metaboliittien saantoja.” (Cruchley-Fuge ym., 2024)

Cruchley-Fuge ym. korostavat ultraäänilaitteen UIP400MTP etuja adherenttien solujen käsittelyssä. Korvaamalla manuaalisen kaavinnan tämä menetelmä parantaa toistettavuutta, näytteenkäsittelykapasiteettia ja saantoa, mikä tekee siitä korvaamattoman työkalun PrecisionToxin kaltaisiin laajoihin tutkimuksiin. Laitteen UIP400MTP integrointi automatisoituihin työnkulkuihin vähentää vaihtelua ja sujuvoittaa myös työläitä prosesseja, mikä mahdollistaa laadukkaan multiomiikkatiedon keräämisen.

Cruchley-Fugen ym. (2024) työ helpottaa ja sujuvoittaa adherenttien soluviljelmien käsittelyä multiomiikka-analyysiä varten. Ultraäänilaitteen UIP400MTP integrointi automatisoituihin työnkulkuihin varmistaa yhdenmukaisen ja tehokkaan näytteiden valmistelun, minkä ansiosta se soveltuu ihanteellisesti suuren näytteenkäsittelykapasiteetin toksikologiseen tutkimukseen.

Hielscher UIP400MTP on monipuolisin sonikaattori monikuoppalevyille, PCR-levyille tai näyteputkille. Sen jatkuva sonikointiteho on 400 wattia, ja se on suunniteltu esimerkiksi solujen lyysiin, emulgointiin, proteiinien uuttoon, DNA:n / RNA:n fragmentointiin, agglomeraattien hajotukseen, FFPE-uuttoon, nanomateriaalien dispergointiin tai emulgointiin. UIP400MTP ei ole ultraäänikylpy. Se on suuren intensiteetin kuppisonotrodi kohdennettuun sonikointiin. Tämä tehokas, kosketukseton sonikaattori sonikoi vakiomallisen kuoppalevyn kaikki kuopat tasaisesti. Amplitudia, tehoa ja pulssitusta voidaan säätää tarkasti. Sisäänrakennettu ajastin ja lämpötila-anturi varmistavat yhdenmukaiset tulokset. UIP400MTP-levysonikaattori jäähdyttää näytteet vesihauteessa, ja lisävarusteena on saatavana ulkoinen jäähdytin.

Suunnittelu, valmistus ja konsultointi – Saksassa valmistettua laatua

Hielscher-ultraäänilaitteet tunnetaan korkeimmista laatu- ja suunnittelustandardeistaan. Kestävyys ja helppokäyttöisyys mahdollistavat ultraäänilaitteidemme sujuvan integroinnin teollisuuslaitoksiin. Hielscher-ultraäänilaitteet selviytyvät helposti ankarista olosuhteista ja vaativista ympäristöistä.

Hielscher Ultrasonics on ISO-sertifioitu yritys, joka painottaa erityisesti suorituskykyisiä ultraäänilaitteita, joissa yhdistyvät huipputeknologia ja käyttäjäystävällisyys. Hielscher-ultraäänilaitteet ovat luonnollisesti CE-vaatimusten mukaisia ja täyttävät UL-, CSA- ja RoHs-vaatimukset.

Liittyvät aiheet

Kirjallisuus / Lähteet

FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.

Usein kysytyt kysymykset

Mitä solujen irrottaminen tarkoittaa?

Tutkimuksessa solujen irrottaminen tarkoittaa prosessia, jossa adherentit solut erotetaan viljelyastian tai kasvualustan pinnasta. Tämä tehdään tavallisesti solujen keräämiseksi jatkokäyttöön, kuten analyysiin, jatkoviljelyyn tai kryosäilytykseen. Irrottaminen voidaan toteuttaa entsymaattisilla menetelmillä (esim. trypsiinillä), kemiallisilla aineilla (esim. EDTA:lla), mekaanisilla menetelmillä (esim. kaavinnalla) tai fysikaalisilla tekniikoilla, kuten ultraäänikäsittelyllä, solutyypin ja tutkimusvaatimusten mukaan.

Miten adherentit solut irrotetaan?

Adherenttien solujen irrottamisessa ultraäänikäsittelyllä käytetään kohdennettuja ultraääniaaltoja solujen ja pinnan välisen kiinnittymisen purkamiseen hallituissa olosuhteissa. Mikrolevyjen ultraäänilaite UIP400MTP toteuttaa tämän tuottamalla paikallisia mekaanisia värähtelyjä, jotka katkaisevat solujen ja viljelypinnan väliset sidokset. Keskeiset vaiheet ovat:

Valmistelu: Soluja kasvatetaan monikuoppalevyillä, ja ne voidaan altistaa tietyille kemikaaleille osana koeasetelmaa.
Ultraäänikäsittely: Ultraäänilaitteeseen UIP400MTP ohjelmoidaan optimoidut asetukset (esim. 60 %:n teho), jotta irrottaminen on tehokasta ilman solujen vaurioitumista tai biomolekyylien eheyden vaarantumista.
Lämpötilan hallinta: Laite pitää lämpötilan vakaana estääkseen lämmön aiheuttaman solujen tai molekyylien hajoamisen prosessin aikana.
Irrottamisen jälkeen: Irrotetuille soluille tehdään jatkouuttomenettelyjä, kuten Bligh & Dyer -menetelmän mukainen kaksifaasinen uutto, RNA:n, lipidien ja metaboliittien talteenottamiseksi.

Tämä menetelmä on manuaalista kaavintaa parempi automatisointinsa, toistettavuutensa ja sen ansiosta, että se pystyy käsittelemään näytteitä tehokkaasti suurella näytteenkäsittelykapasiteetilla.

Mitä on soluja vaurioittamaton irrottaminen?

Soluja vaurioittamaton irrottaminen tarkoittaa prosessia, jossa adherentit solut erotetaan kasvualustastaan vaarantamatta solujen elinkelpoisuutta, eheyttä tai toimintakykyä. Se toteutetaan hellävaraisilla menetelmillä, kuten hallitulla ultraäänikäsittelyllä tai entsyymittömillä liuoksilla.
Solujen tuhoutumisen välttäminen on ratkaisevan tärkeää solujen rakenteellisten ja molekulaaristen ominaisuuksien säilyttämiseksi. Nämä ominaisuudet ovat olennaisia tarkkuutta vaativassa jatkokäytössä, kuten multiomiikka-analyyseissä, toiminnallisissa määrityksissä tai terapeuttisessa käytössä. Vaurioituneet solut voivat vapauttaa solunsisäistä sisältöä, mikä voi sekoittaa koetuloksia tai heikentää näytteen laatua.

Mitä etuja entsyymittömällä solujen irrottamisella on?

Entsyymitön solujen irrottaminen tarjoaa useita etuja, kuten solujen pintaproteiinien ja reseptorien säilymisen, solujen elinkelpoisuuden ylläpitämisen ja biomolekyylien mahdollisten entsymaattisten vaurioiden välttämisen. Tämä lähestymistapa on erityisen hyödyllinen herkissä jatkosovelluksissa, kuten virtaussytometriassa, proteomiikassa tai toiminnallisissa määrityksissä, joissa entsymaattiset muutokset voisivat heikentää tietojen laatua tai koetuloksia. Lisäksi entsyymittömät menetelmät ovat usein paremmin toistettavia, ja ne voidaan mukauttaa suuren näytteenkäsittelykapasiteetin työnkulkuihin.