Pienimmän inhibitoripitoisuuden (MIC) määritysprotokolla

Biofilmipohjainen MIC-määritys (Minimum Inhibitory Concentration) on olennainen menetelmä arvioitaessa mikrobilääkkeiden tehokkuutta biofilmeihin liittyviä mikro-organismeja vastaan, joilla on lisääntynyt resistenssi suojaavan soluväliaineensa vuoksi. Ratkaiseva vaihe tässä määrityksessä on biofilmirakenteiden häiriöt sulautettujen solujen vapauttamiseksi tarkkaa elinkelpoisuuden arviointia varten. UIP400MTP monikuoppainen levysonikoija helpottaa tätä prosessia käyttämällä kohdennettua ultraääntä kontrolloidun kavitaation tuottamiseksi, irrottamalla tehokkaasti biofilmisolut ja hajottamalla ne yhtenäiseen suspensioon. Tämä tarkka ja toistettavissa oleva biofilmihäiriö parantaa MIC-määritysten luotettavuutta ja suorituskykyä, mikä tekee UIP400MTP olennaisen työkalun biofilmitutkimuksen edistämisessä.

Sonikaatio biofilmin irtoamiseen

Biofilmipohjainen MIC-määritys mittaa tyypillisesti bakteerien elinkelpoisuutta tai kasvun estymistä käyttämällä menetelmiä, kuten pinnoitusta, pesäkkeiden laskentaa tai optisen tiheyden mittauksia. Sonikaatio on kriittinen vaihe biofilmipohjaisissa MIC-määrityksissä, kun arvioidaan biofilmiin liittyvien mikro-organismien antimikrobista herkkyyttä. Sen ensisijainen tehtävä on irrottaa ja hajottaa biofilmimatriisiin upotetut solut yhtenäiseksi suspensioksi tarkkaa analyysiä varten.
Biokalvot ovat huomattavasti vastustuskykyisempiä antimikrobisille aineille kuin planktoniset solut, mikä tekee asianmukaisesta irtoamisesta kriittisen tarkan analyysin kannalta. Tämän prosessin aikana ultraääniaallot tuottavat kontrolloitua kavitaatiota, hajottavat biofilmimatriisin ja vapauttavat sulautetut solut yhtenäiseksi suspensioksi talteenottoväliaineessa. Tämä vaihe mahdollistaa biofilmiin dispergoituneiden solujen tarkan elinkykyisyyden arvioinnin menetelmillä, kuten pinnoitus, laimennus ja pesäkkeiden laskenta. Oikea biofilmin häiriö sonikaatiolla estää jäljellä olevia matriisikomponentteja suojaamasta soluja, mikä voisi muuten johtaa antimikrobisen aktiivisuuden aliarviointiin. Monikuoppainen levysoitin UIP400MTP soveltuu erityisen hyvin tähän tarkoitukseen, ja se tarjoaa tarkat ja toistettavat sonikaatio-olosuhteet määrityslevyjen luotettavan ja korkean suorituskyvyn valmistuksen varmistamiseksi.

Miksi sonikaatio on välttämätöntä biofilmipohjaisissa vähimmäisinhibitrorypitoisuusmäärityksissä

Elinkykymittauksia ja solujen laskentaa varten tarvitaan yksittäisten solujen täydellinen ja luotettava irtoaminen ja leviäminen. UIP400MTP edistää tasaista, vahingoittamatonta biofilmin irtoamista ja solujen dispersiota luotettavien määritystulosten saavuttamiseksi.

• Biofilmin monimutkaisuus: Biofilmit ovat strukturoituja mikrobiyhteisöjä, jotka on koteloitu solunulkoiseen polymeeriseen ainematriisiin (EPS), joka suojaa mikro-organismeja ja tekee niistä vastustuskykyisempiä antimikrobisille aineille.
• Tasainen hajonta: Jotta biofilmiin upotettujen solujen elinkykyä tai herkkyyttä mikrobilääkkeille voidaan mitata tarkasti, biofilmi on ensin irrotettava ja hajotettava homogeeniseksi suspensioksi.

Biofilmipohjainen pienimmän inhiboivan pitoisuuden määritysprotokolla

Minimum Inhibitory Concentration (MIC) -määritys määrittää mikrobilääkkeen pienimmän pitoisuuden, joka tarvitaan mikro-organismien näkyvän kasvun estämiseen. Tämä protokolla on suunniteltu biofilmiin liittyville mikro-organismeille, UIP400MTP käytetään monikuoppaista levysonikaattoria biofilmin häiritsemiseen.

Vaihe 1: Bakteeri-inokulaatin valmistus

1. Valmistele bakteerisuspensio:
   Kasvata bakteereja sopivassa väliaineessa logaritmisen vaiheen puoliväliin.
   Viljelmä laimennetaan standardoidun solutiheyden saavuttamiseksi (esim. 0,5 McFarlandin standardi tai OD600 ~0,1).
2. Valmistele antimikrobisia liuoksia:
   Antimikrobinen aine laimennetaan sopivaan väliaineeseen pitoisuusalueen luomiseksi (esim. kaksinkertaiset sarjalaimennokset).
3. Annostele 96kuoppalevyyn:
   Antimikrobiset liuokset lisätään tavallisen 96-kuoppaisen levyn kuoppiin, jolloin lopullinen kuoppatilavuus on ~150–200 μl.
   Sisältää kasvukontrollit (ei antimikrobista) ja steriiliyskontrollit (ei bakteeri-inokulaattia).

Vaihe 2: Biofilmin muodostuminen tapin kannessa

• Kiinnitä tapin kansi:
  Aseta erikoistapin kansi inokuloituihin kuoppiin varmistaen, että tapit ovat täysin upotettuina bakteerisuspensioon.
• Inkuboidaan levyä:
  Inkuboidaan sopivassa lämpötilassa (esim. 37 °C) määrätyn ajan (esim. 24 tuntia) staattisissa olosuhteissa, jotta tappeihin muodostuu biokalvoa.

Vaihe 3: Altistuminen mikrobilääkkeille

• Huuhtele nastat:
  Poista tapin kansi bakteerisuspensiosta ja huuhtele varovasti steriilillä suolaliuoksella tai PBS:llä löysästi kiinnittyneiden planktonisten solujen poistamiseksi.
• Altistu mikrobilääkkeille:
  Siirrä tapin kansi uuteen 96well-levyyn, joka sisältää aiemmin valmistetut antimikrobiset laimennokset.
  Inkuboidaan määrätyn ajan (esim. 24 tuntia) staattisissa olosuhteissa, jotta mikrobilääke voi vaikuttaa biofilmeihin.

Vaihe 4: Sonikaatio Microplate Sonicator -UIP400MTP kanssa

Sonikaatiovaihe on kriittinen biokalvojen irrottamiseksi tapin kansista elinkelpoisuuden arvioimiseksi. Noudata näitä ohjeita UIP400MTP sonicatorille:

1. Valmistele asennus:
   Täytä tuore 96-kuoppainen levy keräysaineella (esim. neutraloivalla liemellä tai steriilillä kasvualustalla) jokaisessa kuopassa.
2. Siirrä tapin kansi:
   Poista tapin kansi antimikrobisesta hoitolevystä.
   Huuhtele tapin kansi steriilillä suolaliuoksella tai PBS:llä antimikrobisten aineiden jäämien poistamiseksi.
3. Aseta levy sonikaattoriin:
   Kiinnitä tapin kansi keräysväliainelevyyn.
   Aseta talteenottoväliainelevy UIP400MTP sonikaattoriin varmistaen, että levy istuu keskellä ja vakaasti kuvatun käsikirjan mukaisesti.
4. Säädä sonikaatioparametreja:
   Aseta sonikaatioparametrit UIP400MTP (asetukset voidaan säätää biofilmiin):
   Amplitudi: 70–100%.
   Sonikaatioaika: 1–3 minuuttia (säädä biofilmin rakenteen perusteella) syklitilassa.
5. Sonikaatti:
   Aloita sonikaatioprosessi. Ultraääniaallot häiritsevät biofilmimatriisia ja syrjäyttävät solut talteenottoväliaineeseen.
6. Seuraa prosessia:
   Käytä kytkettävää lämpötila-anturia näytteen lämpötilan seuraamiseen kaivoissa. UIP400MTP voidaan liittää laboratoriojäähdyttimeen jäähdytystä varten.
7. Post-sonication-käsittely:
   Irronneita biokalvoja sisältävä keräysaine siirretään välittömästi tuoreelle steriilille levylle myöhempää analyysia varten.

A) TSB:tä sisältävä levy, jossa on 2 % glukoosia ja jota käytetään biofilmin muodostukseen, solujen talteenottoon sekä MIC:n ja MBEC:n määrittämiseen; B) Kansi, jossa on tapit stafylokokkibiofilmien muodostamiseksi.
Nastoille muodostetut biofilmisolut irrotettiin sonikaatiolla (Hielscher Ultrasound Technology) 5 minuutin ajan 96-kuoppalevyissä, jotka sisälsivät tuoretta viljelyalustaa solujen talteenottoa varten.
(Kuva ja tutkimus: ©de Oliveira et ai., 2016)

Vaihe 4: Elinkelpoisuuden arviointi

Levy- ja viljelmäirrotetut biofilmit:

1. Keräyselatusaine ja malja laimennetaan sarjalaimennoksina agarille pesäkkeitä muodostavien yksiköiden (CFU) luettelemiseksi.
2. Arvioi MIC:
   Määritä MIC pienimmäksi antimikrobiseksi pitoisuudeksi, joka estää täysin näkyvän mikrobikasvun talteenottoväliaineessa.

MIC:n pienin inhiboiva pitoisuus: Esimerkki mikrotiitterilevystä ja mikrolaimennustulosten tulkinnasta.
(Tutkimus ja kuva: ©Jaskiewicz et al. 2019)

Suunnittelu, valmistus ja konsultointi – Laatu valmistettu Saksassa

Hielscher-ultraääniastiat ovat tunnettuja korkeimmista laatu- ja suunnittelustandardeistaan. Kestävyys ja helppokäyttöisyys mahdollistavat ultraäänilaitteidemme sujuvan integroinnin teollisuuslaitoksiin. Hielscherin sonikaattorit käsittelevät helposti karkeita olosuhteita ja vaativia ympäristöjä.

Hielscher Ultrasonics on ISO-sertifioitu yritys ja painottaa erityisesti korkean suorituskyvyn ultraäänilaitteita, joissa on huipputeknologia ja käyttäjäystävällisyys. Tietenkin, Hielscher-ultraäänilaitteet ovat CE-yhteensopivia ja täyttävät UL: n, CSA: n ja RoHs: n vaatimukset.

Lue täältä, miten UIP400MTP käytetään biofilmin irtoamiseen ASTM E2799 -protokollassa – Desinfiointiaineen tehon testaaminen Pseudomonas aeruginosa -biofilmiä vastaan MBEC-määrityksellä.