Pienimmän estävän pitoisuuden (MIC) määritysprotokolla

Biofilmiin perustuva pienimmän estävän pitoisuuden (MIC) määritys on olennainen menetelmä arvioitaessa antimikrobisten aineiden tehoa biofilmiin liittyviä mikro-organismeja vastaan. Näiden vastustuskyky on kohonnut niitä suojaavan solunulkoisen matriksin vuoksi. Määrityksen ratkaiseva vaihe on biofilmirakenteiden irrottaminen, jotta niihin sitoutuneet solut vapautuvat elinkyvyn tarkkaa arviointia varten. Monikuoppalevyjen ultraäänikäsittelylaite UIP400MTP helpottaa tätä prosessia tuottamalla kohdennetulla ultraäänellä hallittua kavitaatiota, joka irrottaa biofilmisolut tehokkaasti ja dispergoi ne tasalaatuiseksi suspensioksi. Tämä tarkka ja toistettava biofilmin hajotus parantaa MIC-määritysten luotettavuutta ja näytteiden käsittelykapasiteettia, mikä tekee UIP400MTP:stä olennaisen työkalun biofilmitutkimuksen edistämisessä.

Miksi minun kannattaa käyttää ultraäänikäsittelyä MIC-määrityksissä?

• Tarkat, toistettavat tulokset: Saat tasalaatuisia solususpensioita, joissa matriksin suojaava vaikutus poistuu, jolloin pesäkelaskentasi ja optisen tiheyden mittaustuloksesi kuvaavat todella antimikrobista tehoa.
• Tehokas suuren näytemäärän käsittely: Käsittele kokonainen 96-kuoppalevy samanaikaisesti vain 1–3 minuutissa ja korvaa hidas, epäjohdonmukainen manuaalinen kaavinta sujuvalla työnkululla.
• Solujen elinkyvyn säilyminen: Irrota biofilmiin sitoutuneet solut hellävaraisesti ilman kaavinnan aiheuttamia fyysisiä vaurioita ja säilytä korkeammat eloonjäämisosuudet luotettavia MIC/MBEC-laskelmia varten.
• Ristikontaminaatioriski on nolla: Hyödynnä kosketuksetonta, kuppimaisen ultraäänitorven rakennetta, joka käsittelee kaikkia kuoppia tasaisesti ilman, että anturit koskettavat yksittäisiä näytteitä tai kuoppia.
• Valmius standardien vaatimusten täyttämiseen: Sovita menetelmäsi validoituihin alan protokolliin, kuten ASTM E2799-22:een, jolloin tulostesi uskottavuus paranee viranomais- tai julkaisukäyttöä varten.
• Luotettava lääkkeiden ja hoitojen seulonta: Luota herkkyystuloksiisi ja tee paremmin perusteltuja päätöksiä antimikrobisesta tehosta, resistenssiprofiloinnista tai hoitojen kehittämisestä.

Ultraäänikäsittely biofilmin irrottamiseen

Biofilmiin perustuvassa MIC-määrityksessä mitataan tavallisesti bakteerien elinkykyä tai kasvun estymistä esimerkiksi maljaviljelyllä, pesäkelaskennalla tai optisen tiheyden mittauksilla. Ultraäänikäsittely on ratkaiseva vaihe biofilmiin perustuvissa MIC-määrityksissä, kun arvioidaan biofilmiin liittyvien mikro-organismien herkkyyttä antimikrobisille aineille. Sen ensisijainen tehtävä on irrottaa biofilmimatriksiin sitoutuneet solut ja dispergoida ne tasalaatuiseksi suspensioksi tarkkaa analyysia varten.
Biofilmit ovat huomattavasti vastustuskykyisempiä antimikrobisille aineille kuin planktoniset solut, joten asianmukainen irrottaminen on ratkaisevan tärkeää tarkalle analyysille. Tämän prosessin aikana ultraääniaallot tuottavat hallittua kavitaatiota, joka hajottaa biofilmimatriksin ja vapauttaa siihen sitoutuneet solut tasalaatuiseksi suspensioksi solujen talteenottoväliaineeseen. Tämä vaihe mahdollistaa biofilmistä dispergoitujen solujen elinkyvyn tarkan arvioinnin esimerkiksi maljaviljelyllä, laimennuksilla ja pesäkelaskennalla. Asianmukainen biofilmin hajotus ultraäänikäsittelyllä estää jäljelle jääviä matriksin osia suojaamasta soluja, mikä voisi muuten johtaa antimikrobisen aktiivisuuden aliarviointiin. Monikuoppalevyjen ultraäänikäsittelylaite UIP400MTP soveltuu erityisen hyvin tähän tarkoitukseen, sillä se tarjoaa tarkat ja toistettavat ultraäänikäsittelyolosuhteet määrityslevyjen luotettavaan valmisteluun suurella näytteiden käsittelykapasiteetilla.

Miksi ultraäänikäsittely on tarpeen biofilmiin perustuvissa pienimmän estävän pitoisuuden määrityksissä

Elinkykyä mitattaessa ja soluja laskettaessa yksittäiset solut on irrotettava ja dispergoitava täydellisesti ja luotettavasti. UIP400MTP edistää tasaista, vaurioittamatonta biofilmin irrottamista ja solujen dispergointia luotettavien määritystulosten saavuttamiseksi.

• Biofilmin monimutkaisuus: Biofilmit ovat järjestäytyneitä mikrobiyhteisöjä, joita ympäröi solunulkoisista polymeerisistä aineista (EPS) koostuva matriksi. Se suojaa mikro-organismeja ja tekee niistä vastustuskykyisempiä antimikrobisille aineille.
• Tasainen dispergointi: Jotta biofilmiin sitoutuneiden solujen elinkyky tai herkkyys antimikrobisille aineille voidaan mitata tarkasti, biofilmi on ensin irrotettava ja hajotettava homogeeniseksi suspensioksi.

Biofilmiin perustuvan pienimmän estävän pitoisuuden määritysprotokolla

Pienimmän estävän pitoisuuden (MIC) määrityksellä määritetään antimikrobisen aineen pienin pitoisuus, joka tarvitaan estämään mikro-organismien näkyvä kasvu. Tämä protokolla on suunniteltu biofilmiin liittyville mikro-organismeille, ja siinä käytetään monikuoppalevyjen ultraäänikäsittelylaitetta UIP400MTP biofilmin hajottamiseen.

Vaihe 1: Bakteeri-inokulumin valmistaminen

1. Valmista bakteerisuspensio:
   Kasvata bakteereja sopivissa kasvatusalustoissa logaritmisen kasvuvaiheen keskivaiheeseen.
   Laimenna viljelmää standardoidun solutiheyden saavuttamiseksi (esim. 0,5 McFarlandin standardi tai OD600 ~0,1).
2. Valmista antimikrobiset liuokset:
   Laimenna antimikrobinen aine sopivaan väliaineeseen eri pitoisuuksien sarjaksi (esim. kaksinkertaisin sarjalaimennuksin).
3. Annostele 96-kuoppalevylle:
   Lisää antimikrobiset liuokset tavanomaisen 96-kuoppalevyn kuoppiin siten, että lopullinen tilavuus kuoppaa kohti on ~150–200 µL.
   Sisällytä mukaan kasvukontrollit (ilman antimikrobista ainetta) ja steriiliyskontrollit (ilman bakteeri-inokulumia).

Vaihe 2: Biofilmin muodostuminen tappikannelle

• Aseta tappikansi paikalleen:
  Aseta erityinen tappikansi inokuloitujen kuoppien päälle ja varmista, että tapit ovat kokonaan upoksissa bakteerisuspensiossa.
• Inkuboi levy:
  Inkuboi sopivassa lämpötilassa (esim. 37°C) määritellyn ajan (esim. 24 tuntia) staattisissa olosuhteissa, jotta tapeille voi muodostua biofilmiä.

Vaihe 3: Altistus antimikrobisille aineille

• Huuhtele tapit:
  Poista tappikansi bakteerisuspensiosta ja huuhtele se hellävaraisesti steriilissä suolaliuoksessa tai PBS:ssä löyhästi kiinnittyneiden planktonisten solujen poistamiseksi.
• Altista antimikrobisille aineille:
  Siirrä tappikansi uudelle 96-kuoppalevylle, joka sisältää aiemmin valmistetut antimikrobisten aineiden laimennokset.
  Inkuboi määritellyn ajan (esim. 24 tuntia) staattisissa olosuhteissa, jotta antimikrobinen aine voi vaikuttaa biofilmeihin.

Vaihe 4: Ultraäänikäsittely mikrolevyjen ultraäänikäsittelylaitteella UIP400MTP

Ultraäänikäsittelyvaihe on ratkaisevan tärkeä biofilmien irrottamisessa tappikansista elinkyvyn arviointia varten. Noudata seuraavia vaiheita käyttäessäsi ultraäänikäsittelylaitetta UIP400MTP:

1. Valmistele järjestely:
   Lisää uuden 96-kuoppalevyn jokaiseen kuoppaan solujen talteenottoväliaine (esim. neutraloiva liemi tai steriili kasvatusalusta).
2. Siirrä tappikansi:
   Poista tappikansi antimikrobisen käsittelyn levyltä.
   Huuhtele tappikansi steriilissä suolaliuoksessa tai PBS:ssä antimikrobisten aineiden jäämien poistamiseksi.
3. Aseta levy ultraäänikäsittelylaitteeseen:
   Kiinnitä tappikansi talteenottoväliainetta sisältävään levyyn.
   Aseta talteenottoväliainetta sisältävä levy ultraäänikäsittelylaitteeseen UIP400MTP ja varmista, että levy on keskitetty ja vakaasti paikallaan käyttöohjeessa kuvatulla tavalla.
4. Säädä ultraäänikäsittelyn parametrit:
   Aseta UIP400MTP:n ultraäänikäsittelyparametrit (asetuksia voidaan mukauttaa biofilmin mukaan):
   Amplitudi: 70–100%.
   Ultraäänikäsittelyaika: 1–3 minuuttia (säädä biofilmin rakenteen mukaan) jaksotetussa tilassa.
5. Käsittele ultraäänellä:
   Käynnistä ultraäänikäsittely. Ultraääniaallot hajottavat biofilmimatriksin ja irrottavat solut talteenottoväliaineeseen.
6. Seuraa prosessia:
   Seuraa kuoppien näytteiden lämpötilaa liitettävällä lämpötila-anturilla. UIP400MTP voidaan liittää laboratoriojäähdyttimeen jäähdytystä varten.
7. Käsittely ultraäänikäsittelyn jälkeen:
   Siirrä irrotettuja biofilmejä sisältävä talteenottoväliaine välittömästi uudelle steriilille levylle jatkoanalyysia varten.

(A) Levy, joka sisältää TSB:tä ja 2% glukoosia ja jota käytetään biofilmin muodostamiseen, solujen talteenottoon sekä MIC- ja MBEC-arvojen määrittämiseen; (B) tapillinen kansi stafylokokkibiofilmien muodostamiseen.
Tapeille muodostuneet biofilmisolut irrotettiin 5 min kestäneellä ultraäänikäsittelyllä (Hielscher Ultrasound Technology) 96-kuoppalevyillä, jotka sisälsivät tuoretta kasvatusalustaa solujen talteenottoa varten.
(Kuva ja tutkimus: ©de Oliveira et al., 2016)

Vaihe 4: Elinkyvyn arviointi

Siirrä irrotetut biofilmit maljoille ja viljele niitä:

1. Tee talteenottoväliaineesta sarjalaimennokset ja siirrä ne agarmaljoille pesäkkeitä muodostavien yksiköiden (CFU) laskemiseksi.
2. Arvioi MIC:
   Määritä MIC pienimmäksi antimikrobisen aineen pitoisuudeksi, joka estää kokonaan näkyvän mikrobikasvun talteenottoväliaineessa.

MIC, pienin estävä pitoisuus: esimerkki mikrotiitterilevystä ja mikrolaimennustulosten tulkinnasta.
(Tutkimus ja kuva: ©Jaskiewicz et al. 2019)

Ketkä hyötyvät ultraäänikäsittelystä MIC-määrityksissä?

• Lääkinnällisten laitteiden valmistajat: Pintapinnoitteiden tehon testaamiseen ja puhdistusprotokollien validointiin laitteille, jotka ovat alttiita biofilmin muodostumiselle.
• Kliiniset mikrobiologit: Implantteihin liittyvien infektioiden (kuten PJI:n) tarkkaan diagnosointiin ottamalla talteen bakteereja lääkinnällisistä laitteista.
• Lääkekehittäjät: Uusien antimikrobisten aineiden tehon arviointiin vastustuskykyisiä, biofilmiin sitoutuneita taudinaiheuttajia vastaan.
• Akateemiset tutkijat: Biofilmibiologiaa ja antimikrobisen resistenssin mekanismeja koskeviin toistettaviin tutkimuksiin, joissa käsitellään suuria näytemääriä.
• Teollisuuden laadunvalvontatiimit: Biologisen likaantumisen ja desinfiointiaineiden tehon arviointiin teollisuusympäristöissä (esim. ASTM E2799-22 -standardeja käyttäen).

Suunnittelu, valmistus ja konsultointi – Saksassa tuotettua laatua

Hielscher valmistaa ultraäänilaitteita, jotka tunnetaan korkeimmista laatu- ja suunnittelustandardeistaan. Kestävyys ja helppokäyttöisyys mahdollistavat ultraäänilaitteidemme sujuvan integroinnin teollisuuslaitoksiin. Hielscher valmistaa ultraäänikäsittelylaitteita, jotka selviytyvät helposti ankarista olosuhteista ja vaativista ympäristöistä.

Hielscher Ultrasonics on ISO-sertifioitu yritys, joka painottaa erityisesti tehokkaita ultraäänilaitteita, joissa yhdistyvät uusin teknologia ja käyttäjäystävällisyys. Hielscher valmistaa ultraäänilaitteita, jotka ovat luonnollisesti CE-vaatimusten mukaisia ja täyttävät standardien UL, CSA ja RoHs vaatimukset.

Lue tästä, miten UIP400MTP:tä käytetään biofilmin irrottamiseen ASTM E2799 -protokollassa – desinfiointiaineiden tehon testaaminen Pseudomonas aeruginosa -biofilmiä vastaan MBEC-määrityksellä.