Staphylococcus-biofilmin viljely- ja irtoamisprotokolla

Standardoidut menetelmät ovat välttämättömiä luotettavien tutkimustulosten kannalta. Täältä löydät stafylokokkibiofilmien viljely- ja irrotusprotokollan. Tämä protokolla keskittyy virtaviivaiseen korkean suorituskyvyn näytteen valmistukseen käyttämällä monikuoppaista levysonikaattori UIP400MTP a tehokkaaksi, korkean suorituskyvyn biofilmin irtoamiseksi 96-kuoppaisissa levyissä. Protokolla sisältää myös biofilmin viljelyn, pesun ja visualisoinnin keskeiset vaiheet, joissa keskitytään vaihtelun minimointiin ja toistettavuuden varmistamiseen.

Staphylococcus-biofilmi- ja antibioottitutkimus

Staphylococcus-biokalvoilla on kriittinen rooli pysyvissä infektioissa, koska ne ovat vastustuskykyisiä antibiooteille ja immuunivasteille. Biofilmin muodostuminen tarjoaa suojaavan ympäristön bakteereille, mikä vaikeuttaa infektioiden hoitoa. Biofilmien tutkimus keskittyy usein ymmärtämään niiden muodostumista, käyttäytymistä ja alttiutta mikrobilääkkeille painottaen korkean suorituskyvyn menetelmiä kokeellisten työnkulkujen virtaviivaistamiseksi.
UIP400MTP monikuoppainen levysonikaattori tarjoaa merkittävän edun biofilmitutkimuksessa mahdollistamalla biofilmien nopean ja tehokkaan irrottamisen 96-kuoppaisista levyistä. Tämä laite tarjoaa tasaisen ultraäänienergian kaikkiin kaivoihin, mikä takaa johdonmukaiset tulokset ja minimoi vaihtelun.

Stafylokokin biofilmin viljelyn ja irtoamisen protokolla

Alla opastamme sinua vaiheittaisilla ohjeilla stafylokokkibiofilmin viljely- ja irrotusprosessin läpi. Esimerkillisenä analyyttisenä vaiheena näytämme, kuinka viljelty biomassa kvantifioidaan spektrofotometrisesti kristalliviolettivärjäyksellä.

Staphylococcus-biofilmin viljely

Tarvittavat materiaalit:

• Steriilit tasapohjaiset 96-kuoppaiset polystyreenikudosviljelmäkäsitellyt kannelliset mikrotitterilevyt
• Tryptinen soijaliemi (TSB), jossa on 0,25% glukoosia
• Biologinen suojakaappi

Portaat:

1. Valmistele steriili työympäristö biologisessa suojakaapissa saastumisen minimoimiseksi.
2. Lisää 0,25% glukoosia sisältävä TSB mikrotitterilevykuoppiin. TSB ilman glukoosia ei yleensä tue biofilmin muodostumista, ja sitä tulisi käyttää kontrollina vain tarvittaessa.
3. Inokuloidaan kuopat bakteerikannoilla, jotka on valmistettu alla kuvatulla tavalla:
4. Valmistetaan bakteerisuspensioita varmistamalla, ettei olemassa olevia soluklustereita ole homogenisoimalla suspensiot sonikaatiolla tai hajottamalla klustereita 23-ulotteisella neulalla ja lyhyellä pyörteellä.
5. Sulje levy kannellaan ja inkuboi biofilmin muodostumisen kannalta optimaalisissa olosuhteissa (esim. 37 °C 24 tunnin ajan).
6. Koe suoritetaan kolmena kappaleena jokaiselle bakteerikannalle (kolme kuoppaa kantaa kohti) luotettavuuden varmistamiseksi.
7. Kullekin levylle varataan kuusi kuoppaa negatiivisia kontrolleja varten. Jopa 30 kantaa voidaan testata 96-kuoppalevyä kohti.

Biofilmin visualisointi ja pesu

1. Inkuboinnin jälkeen viljelyaine hävitetään varovasti, jotta biofilmi ei häiriinny.
2. Pese kukin kuoppa neljä kertaa fysiologisella suolaliuoksella planktonisten bakteerien poistamiseksi.
3. Tarkista kaivojen pohjasta biofilmin esiintymiseen viittaavia valkoisia laikkuja.

Biofilmin irtoaminen käyttämällä monikuoppaista levysonikaattoria UIP400MTP

Laitteen asetukset ja parametrit:

• UIP400MTP monikuoppainen levysonikaattori
• Käyttöasetukset: 60% amplitudi, syklitila 60 sekuntia päällä / 30 sekuntia pois päältä

Portaat:

1. Aseta pesty mikrotiitterilevy UIP400MTP alustalle.
2. Sonikoidaan näytteet suositelluilla asetuksilla (60% amplitudi, 60 sekuntia päällä, 30 sekuntia pois päältä). Säädä asetukset bakteerikannan mukaan.
3. Aloita sonikaatioprosessi biofilmin irrottamiseksi. Ultraääniaallot häiritsevät biofilmimatriisia ja vapauttavat tarttuvat bakteerit.
4. UIP400MTP varmistaa tasaisen valotuksen kaikissa kaivoissa tasaisen irtoamistuloksen saavuttamiseksi.

Analyysivaihe: Irronneen stafylokokkibiofilmibiomassan kvantifiointi kristallivioletilla (CV)

Tarvittavat materiaalit:

• 0.1% kristalliviolettiliuos (CV)
• 95% etanolia tai 30% etikkahappoa (liuottamiseen)
• Mikrolevynlukija, joka pystyy lukemaan 570 nm:ssä
• Steriilit mikrotitterilevyt värjäykseen

Portaat:

1. Värjäyslevyn valmistus: Siirrä 100 μl irrotettua biofilmisuspensiota sonikoidun levyn jokaisesta kuopasta puhtaan, steriilin 96-kuoppaisen mikrotitterilevyn vastaaviin kuoppiin. Tämä takaa selkeän ja tasaisen ympäristön värjäykselle.
2. Irronneen biokalvon värjäys: Lisätään 150 μl 0,1-prosenttista kristalliviolettiliuosta jokaiseen kuoppaan, joka sisältää irrotettua biofilmisuspensiota. Pipetoidaan varovasti, jotta varmistetaan biofilmisuspension ja kristallivioletin tasainen sekoittuminen.
3. Inkubointi: Anna levyn inkuboida huoneenlämmössä 15 minuuttia, jotta kristallivioletti värjää biomassan tehokkaasti.
4. Pesu: Inkuboinnin jälkeen kristalliviolettiliuos hävitetään varovasti kuopista häiritsemättä biomassaa. Pese kukin kuoppa kolme kertaa steriilillä fysiologisella suolaliuoksella sitomattoman tahran poistamiseksi.
5. Kuivaus: Anna levyn kuivua huoneenlämmössä tai steriilin ilmavirtahupun alla. Vältä kuumentamista, koska se voi muuttaa tuloksia.
6. Liuottaminen: Lisää 200 μl 95-prosenttista etanolia (tai 30-prosenttista etikkahappoa tavanomaisista laboratoriokäytännöistä riippuen) kuhunkin kuoppaan sitoutuneen kristallivioletin liuottamiseksi. Sekoitetaan varovasti pipetoimalla tai ravistamalla levyä 10 minuutin ajan huoneenlämmössä.
7. Mittaus: Mitataan liuenneen kristallivioletin liuoksen optinen tiheys (OD) aallonpituudella 570 nm mikrolevynlukijalla.
8. Tietojen analysointi: Vähennä negatiivisten kontrollien (kuopat, joissa on TSB, mutta ei bakteeri-inokulaattia) keskimääräinen OD570-arvo kokeellisista kuopista taustavärjäyksen huomioon ottamiseksi. Tallenna ja analysoi tiedot.

Huomautus: Suorita koe kolmena kappaleena kullekin tilalle toistettavuuden varmistamiseksi. Varmista kristallivioletin ja etanolin asianmukainen käsittely turvallisuus- ja hävittämisprotokollien mukaisesti.
 

UIP400MTP tärkeimmät edut yhdellä silmäyksellä:

• Korkean suorituskyvyn käsittely: Suunniteltu erityisesti monikuoppalevyille, joten voit käsitellä useita näytteitä samanaikaisesti.
• Yhtenäinen ultraäänijakauma: Varmistaa tasaisen ultraääni-intensiteetin kaivojen välillä, mikä antaa johdonmukaisia tuloksia kaikissa näytteissä.
• Käytä mitä tahansa vakiolevyä: UIP400MTP pystyy käsittelemään mitä tahansa tavallisia monikaivolevyjä, petrimaljoja ja putkitelineitä. Kalliita patentoituja levyjä ei tarvita!
• Käyttäjäystävällinen käyttöliittymä: Helppo asentaa ja hallita, mikä tekee siitä erinomaisen työkalun laboratorion tuottavuuden lisäämiseen. Ohjelmoitavat asetukset ja automaatio helpottavat prosessien standardointia!