Staphylococcus-biofilmin kasvatuksen ja irrottamisen protokolla

Standardoidut menetelmät ovat välttämättömiä luotettavien tutkimustulosten saamiseksi. Täältä löydät stafylokokkibiofilmien kasvatuksen ja irrottamisen protokollan. Protokollassa keskitytään suuren näytemäärän sujuvaan valmisteluun UIP400MTP-monikuoppalevyjen ultraäänilaitteella, jolla biofilmit voidaan irrottaa tehokkaasti 96-kuoppalevyistä suuria näytemääriä käsiteltäessä. Protokolla sisältää myös biofilmien kasvatuksen, pesun ja visualisoinnin keskeiset vaiheet, ja siinä painotetaan vaihtelun minimointia ja toistettavuuden varmistamista.

Staphylococcus-biofilmien ja antibioottien tutkimus

Staphylococcus-biofilmeillä on keskeinen rooli pitkittyneissä infektioissa, koska ne kestävät antibiootteja ja immuunivasteita. Biofilmin muodostuminen tarjoaa bakteereille suojaavan ympäristön, mikä vaikeuttaa infektioiden hoitoa. Biofilmitutkimuksessa keskitytään usein niiden muodostumisen, käyttäytymisen ja mikrobilääkeherkkyyden ymmärtämiseen ja painotetaan suurten näytemäärien käsittelymenetelmiä kokeellisten työnkulkujen sujuvoittamiseksi.
UIP400MTP-monikuoppalevyjen ultraäänilaite tarjoaa merkittävän edun biofilmitutkimuksessa mahdollistamalla biofilmien nopean ja tehokkaan irrottamisen 96-kuoppalevyistä. Laite syöttää kaikkiin kuoppiin tasaisesti ultraäänienergiaa, mikä varmistaa yhdenmukaiset tulokset ja minimoi vaihtelun.

Staphylococcus-biofilmin kasvatuksen ja irrottamisen protokolla

Alla opastamme sinut vaihe vaiheelta Staphylococcus-biofilmin kasvatuksen ja irrottamisen läpi. Analyyttisen vaiheen esimerkkinä näytämme, miten kasvatetun biomassan määrä määritetään spektrofotometrisesti kristalliviolettivärjäyksen avulla.

Staphylococcus-biofilmin kasvatus

Tarvittavat materiaalit:

• Steriilit tasapohjaiset 96-kuoppaiset polystyreenikudosviljelmäkäsitellyt kannelliset mikrotitterilevyt
• Tryptic Soy Broth (TSB) with 0,25% glucose
• Biologinen suojakaappi

Vaiheet:

1. Prepare a sterile working environment in a biological safety cabinet to minimize contamination.
2. Add TSB containing 0,25% glucose to the microtiter plate wells. TSB without glucose does not generally support biofilm formation and should only be used as a control if required.
3. Inokuloidaan kuopat bakteerikannoilla, jotka on valmistettu alla kuvatulla tavalla:
4. Valmistetaan bakteerisuspensioita varmistamalla, ettei olemassa olevia soluklustereita ole homogenisoimalla suspensiot sonikaatiolla tai hajottamalla klustereita 23-ulotteisella neulalla ja lyhyellä pyörteellä.
5. Sulje levy kannellaan ja inkuboi biofilmin muodostumisen kannalta optimaalisissa olosuhteissa (esim. 37 °C 24 tunnin ajan).
6. Koe suoritetaan kolmena kappaleena jokaiselle bakteerikannalle (kolme kuoppaa kantaa kohti) luotettavuuden varmistamiseksi.
7. Kullekin levylle varataan kuusi kuoppaa negatiivisia kontrolleja varten. Jopa 30 kantaa voidaan testata 96-kuoppalevyä kohti.

Biofilmin visualisointi ja pesu

1. Inkuboinnin jälkeen viljelyaine hävitetään varovasti, jotta biofilmi ei häiriinny.
2. Pese kukin kuoppa neljä kertaa fysiologisella suolaliuoksella planktonisten bakteerien poistamiseksi.
3. Tarkista kaivojen pohjasta biofilmin esiintymiseen viittaavia valkoisia laikkuja.

Biofilmin irrottaminen UIP400MTP-monikuoppalevyjen ultraäänilaitteella

Laitteen käyttöönotto ja parametrit:

• UIP400MTP-monikuoppalevyjen ultraäänilaite
• Käyttöasetukset: 60% amplitudi, syklitila 60 sekuntia päällä / 30 sekuntia pois päältä

Vaiheet:

1. Aseta pesty mikrotiitterilevy UIP400MTP alustalle.
2. Sonikoidaan näytteet suositelluilla asetuksilla (60% amplitudi, 60 sekuntia päällä, 30 sekuntia pois päältä). Säädä asetukset bakteerikannan mukaan.
3. Aloita sonikaatioprosessi biofilmin irrottamiseksi. Ultraääniaallot häiritsevät biofilmimatriisia ja vapauttavat tarttuvat bakteerit.
4. UIP400MTP varmistaa kaikkien kuoppien tasaisen altistuksen, jotta irrottamisen tulokset ovat yhdenmukaisia.

Analyyttinen vaihe: irrotetun Staphylococcus-biofilmin biomassan määritys kristallivioletilla (CV)

Tarvittavat materiaalit:

• 0,1% crystal violet (CV) solution
• 95% etanolia tai 30% etikkahappoa (liuottamiseen)
• Mikrolevynlukija, joka pystyy lukemaan 570 nm:ssä
• Sterile microtiter plates for staining

Steps:

1. Värjäyslevyn valmistus: Siirrä 100 μl irrotettua biofilmisuspensiota sonikoidun levyn jokaisesta kuopasta puhtaan, steriilin 96-kuoppaisen mikrotitterilevyn vastaaviin kuoppiin. Tämä takaa selkeän ja tasaisen ympäristön värjäykselle.
2. Staining the Detached Biofilm: Add 150 µL of 0,1% crystal violet solution to each well containing the detached biofilm suspension. Gently pipette to ensure even mixing of the biofilm suspension and crystal violet.
3. Inkubointi: Anna levyn inkuboida huoneenlämmössä 15 minuuttia, jotta kristallivioletti värjää biomassan tehokkaasti.
4. Pesu: Inkuboinnin jälkeen kristalliviolettiliuos hävitetään varovasti kuopista häiritsemättä biomassaa. Pese kukin kuoppa kolme kertaa steriilillä fysiologisella suolaliuoksella sitomattoman tahran poistamiseksi.
5. Kuivaus: Anna levyn kuivua huoneenlämmössä tai steriilin ilmavirtahupun alla. Vältä kuumentamista, koska se voi muuttaa tuloksia.
6. Liuottaminen: Lisää 200 μl 95-prosenttista etanolia (tai 30-prosenttista etikkahappoa tavanomaisista laboratoriokäytännöistä riippuen) kuhunkin kuoppaan sitoutuneen kristallivioletin liuottamiseksi. Sekoitetaan varovasti pipetoimalla tai ravistamalla levyä 10 minuutin ajan huoneenlämmössä.
7. Mittaus: Mitataan liuenneen kristallivioletin liuoksen optinen tiheys (OD) aallonpituudella 570 nm mikrolevynlukijalla.
8. Tietojen analysointi: Vähennä negatiivisten kontrollien (kuopat, joissa on TSB, mutta ei bakteeri-inokulaattia) keskimääräinen OD570-arvo kokeellisista kuopista taustavärjäyksen huomioon ottamiseksi. Tallenna ja analysoi tiedot.

Huomautus: Suorita koe kolmena kappaleena kullekin tilalle toistettavuuden varmistamiseksi. Varmista kristallivioletin ja etanolin asianmukainen käsittely turvallisuus- ja hävittämisprotokollien mukaisesti.
 

UIP400MTP:n keskeiset edut yhdellä silmäyksellä:

• Suurten näytemäärien käsittely: Suunniteltu erityisesti monikuoppalevyille, joten voit käsitellä useita näytteitä samanaikaisesti.
• Ultraäänen tasainen jakautuminen: Varmistaa saman ultraääni-intensiteetin kaikissa kuopissa ja yhdenmukaiset tulokset kaikista näytteistä.
• Käytä mitä tahansa standardilevyä: UIP400MTP soveltuu kaikkien standardinmukaisten monikuoppalevyjen, petrimaljojen ja putkitelineiden käsittelyyn. Kalliita valmistajakohtaisia levyjä ei tarvita!
• Helppokäyttöinen käyttöliittymä: Helppo ottaa käyttöön ja ohjata, joten se on erinomainen työkalu laboratorion tuottavuuden parantamiseen. Ohjelmoitavat asetukset ja automaatio helpottavat prosessien standardointia!